Kenan M‹D‹LL‹
‹Ü Cerrahpafla T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AB Dal›, ‹stanbul
30 Mart - 03 Nisan 2003
rekse antimikrobiklere karfl› gelifltirdikleri direnç mekanizmalar› çö- zümlenmifl ve daha yak›ndan izlenebilir hale gelmifltir. Bütün bunlar›n sayesinde daha iyi afl›lar›n, direnç mekanizmalar›na dayan›kl› kemo- terpötiklerin gelifltirilmesi beklenmektedir. Ayr›ca hastal›k etkenleri- nin s›n›fland›r›lmas›ndaki belirsizlikler giderilmifl ve yeni etkenler ta- n›mlanabilmifltir. Moleküler e¤idemiyolojik çal›flmalar›n yap›lmas› kolaylaflm›fl, hastal›k etkenlerinin co¤rafi da¤›l›m ve davran›fl kal›pla- r› izlenmeye bafllam›flt›r (9-11).
DNA dizilemesinin rutine yönelik olarak kullan›labilece¤i baz› du- rumlar da vard›r:
1. Viruslar›n genotiplendirilmesi ve ilaç direncine yol açan mutas- yonlar›n saptanmas›: Çeflitli dolayl› yöntemler gelifltirilmifl olmak- la birlikte, viruslar›n genotiplendirmesinde dizileme hala alt›n standartt›r. Virus genotipleri, baz› viral hastal›klar›n tedavisinde (hepatit C) önem tafl›maktad›r. Ayr›ca HIV, HBV gibi viruslarda ilaç direncine yol açan mutasyonlar›n saptanmas›, tedavinin yön- lendirilmesinde önem tafl›yabilir.
2. Broad range PCR: 16S, 23S RNA ve giraz B gibi tüm bakteri tür- lerinde k›smen korunmufl olan bölgeler universal priemerler kul- lan›larak PCR ile ço¤alt›ld›ktan sonra, DNA dizilemesi ile infek- siyon etkeni tan›mlanabilir. Ayr›ca kültürde üretilmifl tan›mlanma- s›nda güçlük çekilen bakterilerin tan›mlanmas›nda da kullan›labi- lir (12).
3. MLST (Multilocus sequence typing): “House keeping” genleri ad› verilen hücrelerin rutin ifllevlerinin sürdürülmesinden sorumlu genlerin birkaç tanesinin dizilemesine dayanan yöntemdir. Elde edilen veriler internet üzerinde bulunan bir veri taban›nda özel bir karfl›laflt›rma program› ile de¤erlendirilip tiplendirmeye gidilebil- mektedir (13).
Gerek infeksiyon etkenlerinin daha güvenilir bir flekilde tan›m ve s›n›fland›r›lmas›, gerekse infeksiyon hastal›klar›n›n immünopatogene- zinin daha iyi anlafl›lmas› daha etkin afl› ve kemoterapötiklerin geliflti- rilmesinin yan› s›ra infeksiyon hastal›klar›n›n epidemiyolojisinin iz-
lenmesinde daha flimdiden büyük bir yere sahip olan DNA dizileme ve DNA’ya dayal› di¤er teknikler, gelecekte sa¤lanacak teknik ilerle- melerle birlikte infeksiyon hastal›klar›n›n tan› ve tedavisinde çok daha yayg›n ve genifl bir yer edinecek görünmektedir.
KAYNAKLAR
1. Alphey L. DNA-Sequencing. BIOS Scientific Publishers, 1997.
2. Crain PF and McCloskey JA. Applications of mass spectrometry to
characterization of oligonucleotide and nucleic acids. Curr Opin in Biotechnol 1998, 9:25-34.
3. Sterky F and Lundeberg. Sequence analysis of genes and genoms. J
Biotechnol 2000, 76:1-31.
4. Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res
2001, 11:3-11.
5. Swanson D. The art of the state of nucleic acid sequencing. TheScientist
2000, 14(3):23-.
6. Pisano JM. The core of DNA sequencing. TheScientist 2002 16(6):41-.
7. Schmalzing D, Koutny L, Salas-Solano, Adourian A, Matsudaira P and
Ehrlich D. Recent developements in DNA sequencing by capillary and microdevice electrophoresis. Electrophoresis 1999, 20:3066-77.
8. Righetti PG, Gelfi C and D’Acunto. Recent Progress in DNA analysis by
capillary electrophoresis. Electrophoresis 2002, 23:1361-74.
9. Fraser CM, Eisen JA and Salzberg SL. Microbial genome sequencing.
Nature 2000, 406(17):799-803.
10. Sassetti C and Rubin EJ. Genomic analysis of microbial virulance. Curr Opin Microbiol 2002, 5:27-32.
11. Clarke SC. Nucleotide sequence based typing of bacteria and impact of automation. BioEssays 2002, 24:858-62.
12. Watanabe K, Nelson JS, Harayama S and Kasai H. ICB database: the gyrase B database for identification and classification of the bacteria. Nuc Acids Res 2001, 29(1):344-5.
13. Chan MS, Maiden MC and Spratt BG. Database-driven Multi Locus Sequence Typing (MLST) of bacterial pathogens. Bioinformatics 2001, 17:1077-83.
T
Taabblloo--11::BBaaflflll››ccaa DDNNAA ddiizziilleemmee cciihhaazzllaarr›› vvee üürreettiiccii ffiirrmmaallaarr.. F
Fiirrmmaa WWEEBB ssiitteessii ÜÜrrüünn aadd›› EElleekkttrrooffoorreezz ÖÖrrnneekk BBooyyaa
y
yöönntteemmii kkaappaassiitteessii
Amersham www.amershambiosciences.com MegaBACE Kapiller 48-384 DYEnamic ET (4’lü)
Biosciences
Applied www.biosystems.com ABI PRISM Kapiller/jel 1-384 Big Dye (4’lü)
Biosystems
Beckman www.beckmancoulter.com CEQ Kapiller 8 Dye terminator (4’lü)
Coulter
LI-COR-NEN www.bio.licor.com Global IR2,ALF Jel 48 2’li (çift yönlü)
SpectruMedix Corp. www.spectrumedix.com SCE9610 Kapiller 24-384 Adapte edilebilir
Visible Genetics www.visgen.com OpenGene, Jel 4 Tek ya da ikili
Kantitatif real-time (gerçek zamanl›) PZR testi viral yük de¤erlen- dirmek amac› ile HBV, HCV ve di¤er baz› enfeksiyon hastal›klar›n›n takip ve tedavisinde bir süredir kullan›lmaktad›r (1, 3, 4). Son y›llarda önemli olarak bu teknik gen ekspresyonu (gen anlat›m›) ve hücre fonk- siyonu aras›nda ki iliflkinin araflt›r›lmas›nda kullan›lmaya bafllanm›fl- t›r. Teknik yo¤un olarak saflaflt›r›lan ve ayr›flt›r›lan total hücresel RNA içerisinde aranan genin mRNA miktar›n› ölçmek amac› ile kullan›l- maktad›r. Gen anlat›m› ile fonksiyon aras›nda ki iliflki daha çok relatif olarak normale göre de¤erlendirilerek anlafl›lmaya çal›fl›l›r (2). Güve- nilir bir k›yaslamal› de¤erlendirme mutlak surette stabil genlerin de çal›fl›larak bunlar arac›l›¤› ile sonuçlar›n düzeltilmesine dayanmakta- d›r. Bu stabil genlere ço¤u kez housekeeping genler denilmektedir (5).
KAYNAKLAR
1. Abe, A., K. Inoue, T. Tanaka, J. Kato, N. Kajiyama, R. Kawaguchi, S.
Tanaka, M. Yoshiba, and M. Kohara. 1999. Quantitation of hepatitis B
virus genomic DNA by real-time detection PCR. J Clin Microbiol 37:2899-903.
2. Pfaffl, M. W. 2001. A new mathematical model for relative quantification
in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29:e45.
3. Shi, L., J. Ho, L. A. Norling, M. Roy, and Y. Xu. 1999. A real time
quantitative PCR-based method for the detection and quantification of simian virus 40. Biologicals 27:241-52.
4. Takeuchi, T., A. Katsume, T. Tanaka, A. Abe, K. Inoue, K. Tsukiyama-
Kohara, R. Kawaguchi, S. Tanaka, and M. Kohara. 1999. Real-time detection system for quantification of hepatitis C virus genome. Gastroenterology 116:636-42.
5. Vandesompele, J., K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De
Paepe, and F. Speleman. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3:RESEARCH0034.