‹Ü Deneysel Hayvanlar Merkezi Müdürü, Cerrahpafla, ‹stanbul
TÜR SUBKUTAN ‹NTRA- MUSKULER ‹NTRA- PER‹TON‹AL ‹NTRA -VENÖZ ‹NTRA -DERMAL
(deri alt›) (kas içi) (kar›n bofllu¤u içi) (Toplar damar içi) (deri içi)
FARE 1-3 0,05 2-3 0,2 0,05
SIÇAN 5-10 0,3 5-10 0,5 0,05
TAVfiAN 30-50 0,5-1,0 50-100 1-5 0,1
v› miktarlar› belirlidir. Afla¤›daki tabloda en çok kullan›lan deney hay- vanlar›n›n enjeksiyon bölgelerine verilebilecek maksimum çözelti miktar› gösterilmifltir. Deneylerde bu miktarlar›n afl›lmamal›d›r.
Anatomik özellikler: Burada da seçilecek türün yap›lacak çal›flma- ya uygun olmas› gerekir. Özellikle giriflimler için organ›n büyüklü¤ü, damarlanmas›, sinir dallanmalar› gibi. Bazen de seçilen tür çal›fl›lacak organa sahip olmayabilir. Örne¤in s›çanlarda safra kesesi bulunmaz. Ayr›ca organlardan hücre elde ederken o hücre grubunun en zengin ol- du¤u yerlerin anatomik yerleflimi bilinip mümkün oldu¤u kadar az hayvan kullan›p iyi sonuç elde etmek amac›yla da anatomi iyi bilinme- lidir. Örne¤in s›çanda B veya T lenfositler izole edilip çal›fl›lacaksa, makrofaj elde edilecekse o türdeki zengin elde edilme bölgeleri bilin- melidir. Bir bölüm türde ise baz› organlar›n eksikli¤i bizim çal›flmala- r›m›z için çok uygun zemin oluflturur. Örne¤in nud-farelerde kal›tsal olarak timus bezi yoktur. Bunun sonucu bu hayvanlarda doku reddi re- aksiyonlar›n›n elemine edilmesi gereken modellerde çok ideal seçim- dir.
Sistematik özellikler: Deneye hayvan seçerken öncelikle tür baz›n- da düflünmemiz gerekir. Tür baz›ndaki bilgi hayvan›n büyüklü¤ü, ana- tomik uygunlu¤u, histolojik özellikleri aç›s›ndan önemlidir. Türü seç- tikten sonra ise türlerin içinde bulunan soylardan hangisinin yap›lacak iflleme uygun oldu¤u araflt›r›lmal›d›r. Deneysel çal›flmalarla ilgili lite- ratürlere bak›l›rsa deneyin sadece s›çanda veya farede yap›ld›¤› yaz›l- maz. Hangi soy ve farede yap›ld›¤› yaz›l›r. Örne¤in s›çanda Wistar al- bino, Spraque Dawley, Fisher 344 gibi. Bunun bilinmesinin en etken oldu¤u alanlardan birisi kimyasal madde kullan›larak gelifltirilen has- tal›k modelleridir. Bilindi¤i gibi baflta diabet, kanser ve birçok meta- bolik hastal›k modelleri kimyasal madde verilerek gelifltirilir. Fakat bütün soylar o kimyasal maddeye ayn› duyarl›l›kta de¤ildir, hatta bir bölümü tamamen dirençlidir. Bu nedenle e¤er bu inceleme zaman›nda yap›lmaz ve rastgele bir soy kullan›l›rsa sonuçta bofl yere hayvan, madde ve zaman kaybedilmifl olur. Ayn› flekilde hücre pasajlar›yla ya- p›lan çal›flmalarda da her soy pasaj› yap›lan hücreyi kabul etmez ve re- jekte edebilir. Bu da yine ayn› kay›plara neden olur. Bu nedenle büyük araflt›rma merkezleri mümkün oldu¤u kadar fazla say›da soyu üret- mektedir. Ayr›ca baz› soyar›n içersinde baz› hastal›k modelleri spon- tan olarak meydana gelmektedir. Örne¤in Spontan Tip I diabetik BB s›çanlar›, Spontan hipertansif s›çanlar (SHR s›çanlar›) gibi.
Davran›fl Özellikleri: Hayvanlar›m›z›n üretim s›ras›nda veya de- ney s›ras›nda sa¤l›klar›n›n bozulup, bozulmad›¤›n› onlar›n davran›fl- lar›ndan ç›karabiliriz. Özellikle kafeslerini açt›¤›m›zda gösterdikleri tepkilerini iyi bilmemiz gerekir. Bunun d›fl›nda örne¤in hareketsiz kamburu ç›km›fl gibi bir davran›flla karfl›lafl›rsak, dokundu¤unuzda hiç tepki vermiyorsa hayvan›n bu duruflunun pnömonik bir durufl ol- du¤unu teflhis etmeliyiz. Ayr›ca deney s›ras›nda kendimize bir zarar gelmemesi için de mutlaka hayvanlar›n ne zaman nas›l davranacak- lar›n› bilmeliyiz, örne¤in gayet sakin hayvanlar olan tavflan ve s›çan- lar yeni do¤um yapt›klar› günlerde oldukça agresif olurlar. Böyle günlerde onlara yaklafl›rken daha dikkatli olunmal›d›r. Bu hayvanla- r›n menstruel döngü de¤iflimlerinde çiftleflmelerinde de oldukça farkl› davran›fllar vard›r. Dolays›yla bunlar›n da bilinmesi üretim aç›s›ndan önemlidir.
Özel Üretim Teknikleri: Deneylerimizin gere¤ine göre hayvanlar›- m›z›n baz› özel tekniklerle üretilmeleri gerekebilir, en az›ndan bu tek- niklerin varl›¤› ve neye yarad›¤›n›n bilinmesi projemizin planlamas› aç›s›ndan çok önemlidir.
Bu yöntemleri söyle s›ralayabiliriz: a. Saf döl üretim
I. ‹nbred üretim tekni¤iyle
b. Transgenik olarak istenilen özellik kazand›r›larak c. Mikroplardan ar›nd›r›lm›fl olarak üretim gibi.
Etik: Araflt›r›c›lar›n günümüzde belki de en fazla bilinmesi gereken özellik hayvanlar›n etik kurallara uygun olarak yetifltirilmesi ve kulla- n›lmas›d›r. Ülkemizde belirgin bir yasa bulunmamaktad›r. Dünyada bir çok ülkede de¤iflik yasalar ve Uluslararas› antlaflmalar vard›r. Bu yasalarda kanunlar›n içeri¤i uygulamay› kontrol edecek kurulufllar an- lat›lmaktad›r. Fakat bütün bu yasalar›n ortak özelli¤ini biz 3R kuram› ile aç›klayabiliyoruz. 3R, ‹ngilizce R ile bafllayan 3 kelimeden kay- naklanmaktad›r. Bunlar s›ras›yla,
a. Reduction (azaltma): Bu madde deneylerde yersiz hayvan kullan›-
m›n› ve kaybedilmesini önleyip mümkün oldu¤u kadar az hayvan kullan›larak en iyi sonuca varmay› önermektedir. Örne¤in çal›fl- may› yapmadan literatürlerin iyi taran›p böylece önceden sonuçla- r› çok net ayd›nlat›lm›fl çal›flmalar›n tekrar yap›lmas›n›n önüne ge- çilmesi en önemli ilkelerindendir. Ayr›ca deney yapacaklar›n, ön- ceden bir teknik ve etik kurstan geçirilmesi o kiflilerin yetersizli¤i nedeniyle bofl yere hayvan kay›plar›n›n da önüne geçecektir.
b. Replacement (yerine bir fley koyma): Bu madde e¤er mümkünse çal›fl-
man›n deney hayvan› üzerinde de¤il de alternatif yöntemlerle yap›lma- s›n› önermektedir. Önerilen alternatif teknikleri flöyle s›ralayabiliriz: 1. Doku kültürü
2. Omurgas›z hayvanlar 3. Bilgisayar programlar›
4. E¤itimin model hayvanlar üzerinde yap›lmas› 5. Embriyonlu yumurta
Tabi bu yöntemlerin ne kadar yeterli olabilece¤i tart›flmal› oldu¤u gibi, baz› çal›flmalar›n bu tip koflullarda yap›lmas› mümkün de¤ildir.
c. Refinement (Hayvan rahat›n›n sa¤lanmas›): Bu maddeye göre
hayvanlar›n do¤umlar›ndan deney bitiminde sakrifiye edilmeleri- ne kadar geçen süreçte en iyi koflullar içinde bulundurulmalar› ge- rekir. Beslenme, sa¤l›k, yaflan›lan ortam›n ›s›, ›fl›k, nem, havalan- d›rma düzeyi, o türe uygun olmal›d›r. Hayvanlar›n hangi yaflta hangi alandaki kafese en fazla kaçar adet konacaklar› dahi belir- lenmifltir. Bu say›n›n üstüne ç›kt›¤›n›zda hayvan haklar›na ayk›r› davranm›fl olursunuz.
Refinement maddesinin içinde hayvanlar›n deney s›ras›ndaki du- rumlar› da belirtilmifltir. Deneylerde hayvanlara ac› verilmesinden mümkün oldu¤u kadar kaç›n›lmal›d›r. Anestezi gerektiren her koflulda en iyi anestezi sa¤lanmal›d›r. Operasyon sonras› e¤er maddelerin kul- lan›m› deney sonuçlar›m›zda yan etki yapmayacaksa a¤r› eleminasyo- nu yapman›z gerekir. Deney bitiminde de ötanazi uygularken ötanazi- yi uzman kiflinin en az ac› vererek en h›zl› flekilde yapmas› ve belirti- len tüm kurallara uymas› gerekir. Ayr›ca refinement maddesi baz› ça- l›flmalar› yasaklam›flt›r. Örne¤in uzun süreli açl›k çal›flmalar› gibi. Tü- mör çal›flmalar›nda da surviyi saptamak için beklenen hayvanlar e¤er terminal noktada iseler ölümlerini beklemeden, ac› çekmelerini engel- lemek için ötanazi yap›lmas› önerilmektedir.
Hayvan Çal›flmalar›ndan Gelebilecek Riskler: Üretimde ve deney- lerde çal›flanlar›n mutlaka deney hayvanlar›ndan ve bu amaçla kulla- n›lan her türlü araçtan gelebilecek riskleri ö¤renmeli ve onlara karfl› önlemlerini almal›d›rlar. Bunlar› flöyle s›ralayabiliriz:
a. Fiziksel zararlar: Kafes veya kapaklar›n›n batmas›, kesmesi, çiz-
KL‹M‹K 2003 XI. TÜRK KL‹N‹K M‹KROB‹YOLOJ‹ ve ‹NFEKS‹YON HASTALIKLARI KONGRES‹
Bunun için tüm personelin yara temizli¤ini iyi bilmesi ve mutlaka tetanoz afl›s› bulunmas› gerekir.
b. Zoonozlar: Deney hayvanlar› tamamen izole sistem içersinde ye- tifltirildi¤i için çok önemli bir zoonoz bildirilmemifltir.
c. Kullan›lan kimyasal maddeler ve onlar›n metabolitleri: Bu tip maddeler kullananlar›n mutlaka maddelerinin bütün özelliklerini bilip, bulafl›rsa yapmas› gerekenleri, hayvana verildikten sonra ne kadar zamanda metabolize edilece¤ini ve metabolitinin ne oldu¤u,
hangi yolla at›ld›¤› gibi özellikleri bilmelidir. Radyoaktif madde kullan›yorsa gereken önlemler al›narak çal›fl›lmal›d›r.
At›klar›n Yok Edilmesi: Deney s›ras›nda hayvanlar›n yatakl›klar› deney bitiminde de ölüleri ve doku parçalar› at›klar› oluflturur. Bun- lar›n ideal yok edilmesi yakma f›r›nlar›nda yakma f›r›n› yoksa bun- lar›n so¤uk odalarda depolan›p ayr› ve belirgin bir ambalajlama ile il- gili yerlere teslim edilmelidir.
Bakteri ve Mantar Modellerinin Genel Özellikleri
Mikrobiyoloji alan›nda iki önemli olay, hayvan modelleri arac›l›¤› ile gerçeklefltirilmifltir: Birincisi 1935 y›l›nda Domagk taraf›ndan sul- fonamidin, farenin pnömokok enfeksiyonunuda etkili oldu¤unun gös- terilmesi, ikincisi ise önce Fleming taraf›ndan lokal bir antiseptik ola- rak kullan›lmaya bafllanan penisilinin daha sonra 1940’larda Florey ve Chain taraf›ndan fare modelinde etkili bir antibiyotik oldu¤unun gös- terilmesi (1).
Enfeksiyöz modellerin önemli bir bölümü ilaç çal›flmalar› için kul- lan›lm›flt›r. In vivo olarak etkili oldu¤u gösterilen bir ilaç daha sonra hayvan modellerinde denenir. Etkinlik, toksisite, farmakokinetik ve farmakodinamik gibi pek çok parametre farkl› dizayn edilmifl model- lerde çal›fl›l›r.
‹nfeksiyöz Hayvan Modellerinin Genel Dezavantajlar› Bir hayvan modeli dizayn ederken yada uygularken insanla seçilen hayvan aras›ndaki benzerlikler ve farkl›l›klar mutlaka de¤erlendiril- melidir. Deneysel çal›flman›n dizayn›, gerçek hayatta görülen hastal›- ¤›n, küçük bir grupta benzerini oluflturmakt›r. Ancak genetik olarak farkl› mikroorganizmalar›n ve kökenlerin yine genetik olarak farkl› in- sanlar› enfekte etti¤i gerçek hayat ile, genellikle tek tip bir mikroorga- nizman›n neredeyse birbirinin eflde¤eri olan hayvanlar› enfekte etti¤i deneysel model aras›nda önemli farklar olacakt›r (2). Baz› hayvanlar›n kendi genetik yap›lar› ve farkl› konak yan›tlar›, deneyin sonucunu önemli ölçüde etkileyebilir. Ayr›ca seçilen hayvanda baz› mikroorga- nizmalar hiç hastal›k yapm›yor olabilir ve cerrahi yada medikal bir gi- riflimle bir hastal›k durumu oluflturulur. Bu do¤al seyri içinde geliflen hastal›ktan farkl›d›r. Örne¤in tedavi modellerinini ço¤unda bakteri ile birlikte antibiyotik uygulamas› ayn› anda yap›l›r: bu tedaviden çok profilaksi ile ilgili sorulara yan›t verebilir.
‹nfeksiyöz Hayvan Modellerinin Genel Avantajlar›
Hayvan çal›flmalar› insan çal›flmalar›na göre baz› avantajl› yönlere de sahiptir. Küçük hayvanlar›n yaflam döngüleri h›zl›d›r. Bu, deneyin süresini ve maliyetini olumlu etkiler. Hayvan çal›flmalar›nda birbirine eflde¤er pek çok canl› ile ayn› anda deney yapma imkan› sunar. Bu fle- kilde, güvenilir de¤erlilikte ve istatistiksel olarak yeterli veri elde edi- lebilmifl olur. ‹nsan çal›flmalar›nda ço¤u kez yap›lmas› güç olan de¤ifl- kenlerin kontrolü, hayvan modeli ile gerçeklefltirilir. Böylece deneyin sonucunun, bakteri-konak aras›ndaki iliflkilere mi, yoksa araya giren di¤er pek çok parametreye mi ba¤l› oldu¤u anlafl›labilir. Enfektif ajan d›flardan verildi¤i için enfeksiyonun bafllang›c› bilinmektedir. Böylece yap›lacak gözlemler ve bulgularla enfeksiyonun kronolojik iliflkisi da- ha sa¤l›kl› yap›l›r. ‹nsanlarda denenmesi imkans›z olan morbiditesi ve mortalitesi yüksek hastal›klar denenebilir. Ayr›ca insanlarda çok sey- rek olarak ortaya ç›kan enfektif hastal›klar, etkenin pek çok hayvana verilmesi ile rahatl›kla çal›fl›l›r.
Günümüze kadar binlerce enfektif hayvan modeli tan›mlanm›flt›r. Bu modellerden denenecek hipoteze en uygunu seçilirken belli özel- liklere dikkat etmek gerekir. Çal›fl›lacak enfeksiyon hastal›¤› için, in- sandaki patofizyolojisine en benzeyen hayvan seçilmelidir. Yap›lacak ifllemlerin ve hayvan temininin kolayl›¤› ve ayr›ca maliyetin de düflük olmas› nedeniyle modele uygun hayvanlar içinde en küçük olan› seçil- melidir.
‹laç yada di¤er maddelerin uygulanmas› da baflka bir problemdir. S›k intravenöz uygulama yada baz› hayvanlarda oral uygulama pratik olmayabilir. Suyuna kat›lmas›, orogastrik sonda ile uygulama, intrape- ritoneal uygulama seçilecek modele ba¤l› olmak üzere birer çözüm olabilir.
Antimikrobiyallerle ilgili çal›flmalarda, hayvanlar›n bu maddeleri genellikle insanlardan çok daha h›zl› metabolize ettikleri unutulmama- l›d›r. Bu, örne¤in antibiyoti¤in konsantrasyonuna dayanan bir çal›flma- n›n sonucunu önemli düzeyde etkileyecektir. Bu problem, infüzyon yoluyla ilaç verilemsi, dozlar›n s›k aralarla verilmesi, yada metaboliz- may› etkileyecek giriflimler yap›lmas› (önceden nefrotoksik bir ajan verilemesi gibi) ile afl›labilir.
Bakteri Modelleri
Binlerce “bakteri hayvan modeli” tan›mlanm›flt›r. Deney yap›lacak model, detayl› tan›mland›¤› kaynaktan al›nmal› ve deneye özgü düzen- lemeler d›fl›nda, metodoloji de¤ifltirilmeden uygulanmal›d›r.
‹ki ayr› bakteri hayvan modeli örnek olarak verilmifltir: Bakteryel sepsis modeli
Bu modelde ratlarda Escherichia coli sepsisi oluflturmak için, 2 x 1010
cfu E. coli verilir. (3,4). Uygulama, kuruk veninden yap›labilir. Bu amaçla, uygulama s›ras›nda kuyruk, proksimal k›sm›ndan bir turnike ile ba¤lanarak venodilatasyon sa¤lan›r. Ayr›ca kuyru¤un s›cak su ile ›s›t›lmas› da ayr›ca venodilatasyona katk›da bulunur. Ven ponksiyone edilince turnike aç›l›r ve enjeksiyon yap›l›r.
Sepsis oluflturmak için lipopolisakkarit (LPS) de verilebilir: bu amaçla her bir rata 0,3 mg/100 gr vücut a¤›rl›¤› E. coli LPS verilebilir (5). LPS, 0,15 mol/L tuzlu suyun 1,5 mL’si ile çözelti halinde, intra- peritoneal olarak verilir.
Eter, yada CO2, yada 50 mg/kg pentobatbital verilerek anestezi ya- p›ld›ktan sonra cerrahi ifllem yap›l›r (yada rat feda edilir).
Sirotik Rat Modelinde Pnömokok Bakteremisi ve Pnömonisi Ratlarda siroz, haftal›k CCl4uygulamas› ile yap›l›r. Fenobarbital, CCL4’ün hepatotoksisitesini art›rd›¤›ndan önce 10-14 günlük fenobar- bital (1,5 ml/L fenobarbital içeren içme suyu) uygulamas›ndan sonra, 0,04 ml CCl4uygulamas› bafllat›l›r ve 0,02 ml art›r›l›r (6). CCl4intra- gastrik gavaj ile verilir: Ucuna pediatik nazogastrik tüp tak›lm›fl bir en- jektör yoluyla uygulama yap›l›r. 8-12 haftal›k bir uygulama sonras›