otomatize hale getirilmifllerdir (BACTEC 460, BACTEC 9000MB gi- bi). Kat› besiyeri olarak Löwenstein-Jensen (LJ) gibi yumurta bazl› veya Middlebrook 7H11 gibi agar bazl› besiyeri kullan›labilir. Kat› be- siyerlerine antimikrobiyal ajanlar eklenerek selektif hale getirilebilir- ler.
Mikobakteriyoloji laboratuvarlar›nda en s›k kullan›lan besiyeri LJ olmakla birlikte, besiyerinin opak görünümü nedeni ile üremenin fark edilmesi daha zor ve inkübasyonu zaman› daha uzundur. Agarl› besi- yerleri ise berrak oldu¤undan koloniler daha erken dönemde fark edi- lirler. Ayr›ca agarl› besiyerinde mikrokoloni incelemesi yap›labilir. Ancak inkübasyon süresi uzad›kça LJ besiyerinde kültür pozitifli¤inin agarl› besiyerlerine oranla daha yüksek oldu¤u bildirilmifltir. Besiyeri seçimi laboratuvar›n hizmet düzeyine ve olanaklar›na göre de¤iflken- lik gösterebilir.
S›v› besiyerinde kord faktörün görülmesi M. tuberculosis komplek-
sin üredi¤ini gösteren erken bir ipucudur. Yap›lan çal›flmalarda ince- lemenin duyarl›l›¤› %90 dolaylar›nda bulunmufltur. Kat› besiyerleri ise koloni morfolojilerini vermeleri ve DNA hibridizasyon testlerine ola- nak sa¤lamalar› nedeni ile s›v› besiyerlerine üstünlük sa¤larlar. Bu ne- denle s›v› besiyerinde üreme olduktan sonra kat› besiyerine aktar›m yap›lmal›d›r.
Mikobakterilerin optimal üreme ›s›s› 35-37°C’dir. Ancak deri, yu- muflak doku örnekleri M. marinum, M. ulcerans, M. chelonae veya M. haemophilum izolasyonu için 25-33°C’de ayr› bir set haz›rlanarak in- kübe edilmelidirler. Primer izolasyonda %5-10 CO2’li ortamda miko- bakteriler daha iyi ürer. LJ besiyerini ilk yedi gün CO2’li ortamda b›-
rakmak yeterlidir. Kültürler negatif sonuç verilmeden önce 6-8 hafta inkübe edilmelidir. Yayma pozitif, kültür negatif örneklerin bu süreye ek olarak dört hafta daha inkübasyonu önerilmektedir. Üreme kontro- lü için kat› besiyerleri ilk dört hafta haftada iki kez, dört haftadan son- ra ise haftada bir kez incelenmelidir. BACTEC fliflelerinin ilk üç hafta haftada üç kez, daha sonra alt›nc› haftaya kadar haftada bir kez de¤er- lendirilmesi önerilmektedir. Laboratuvar yükü fazla olan yerlerde yay- ma pozitif örneklerin di¤erlerinden ayr›larak daha s›k takip edilmeleri zaman kazand›r›c› olabilir. S›v› besiyerlerinde üreme olduktan sonra yayma haz›rlanarak asidorezistan ve Gram boyama yap›lmas› ve ko- yun kanl› agara pasaj yap›lmas› kontaminasyonun araflt›r›lmas› için gereklidir. Üreme gösterildikten sonra mikobakterinin tür ayr›m›na gi- dilmelidir.
‹dentifikasyon
‹zole edilen mikobakterilerin her laboratuvarda tür düzeyinde ta- n›mlanabilmesi mümkün de¤ildir. Ancak tüberküloz basillerinin etken olma s›kl›¤› ve infektivitesi göz önüne al›nd›¤›nda en az›ndan M. tu- berculosis kompleksin identifikasyonunda kullan›lan anahtar testlerin yap›lmas› önerilmektedir.
Mikobakterilerin identifikasyonunda çeflitli yöntemler kullan›lmak- tad›r. Konvansiyonel olarak üreme h›z› ve pigmentasyon özelliklerine göre mikobakteriler ön gruplara ayr›lmakta (Runyon s›n›flamas›), da- ha sonra bu gruplar için öncelik tafl›yan biyokimyasal testler kullan›la- rak tür ayr›m›na gidilmektedir. Bu yöntemler zaman al›c› ve zor ol- makla birlikte maliyetleri moleküler yöntemlere oranla oldukça dü- flüktür. Biyokimyasal testler tüberküloz basillerinin tan›mlanmalar›n- da halen geçerliliklerini korumaktad›r. Ancak tüberküloz d›fl› miko- bakterilerin ayr›m›nda bu testler her zaman yeterli de¤ildir ve bu ne- denle moleküler yöntemler tercih edilmektedir.
Tüberküloz basillerinin identifikasyonu için uygulanacak algoritma, laboratuvarda kullan›lan besiyerine ve olanaklara göre de¤iflkenlik gösterir. Kat› besiyeri kullanan laboratuvarlarda üreme h›z›, pigmen- tasyon, koloni görünümü ve mikrokoloni incelemesinden sonra niasin testi, nitrat redüksiyon testi ve ›s›ya stabil katalaz testinin uygulanma- s› ile M. tuberculosis identifikasyonu yap›labilir. M. bovis ve M. tuber- culosis ayr›m› için TCH (Tiyofen 2-karboksilik asit hidrazit) ile inhi- bisyon testi tercih edilmelidir. BACTEC sistemi kullanan laboratuvar- lar için M. tuberculosis kompleksin identifikasyonunda NAP testi h›z- l› ve güvenilirdir. Ayn› zamanda s›v› besiyerinde kord faktör oluflumu aranmal›d›r. Tüberküloz d›fl› mikobakterilerin identifikasyonunda bi- yokimyasal testler uygulanabilirse de her zaman do¤ru sonuç vermez- ler.
Tüberkülozun do¤ru tan›s› güvenilir ve standardize edilmifl mikro- biyolojik yöntemlerin kullan›lmas› ile mümkündür. Bu nedenle örnek- lerin toplanmas›ndan, mikroskobik inceleme, kültür ve identifikasyo- na kadar her aflamada belirlenen standart yöntemlere uyulmas›, test kontrollerinin kullan›lmas› ve laboratuvarda periyodik olarak kalite kontrolün yap›lmas› zorunludur.
KAYNAKLAR
1. Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ. Mycobacterium. In: Murray PR,
Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, eds. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC: ASM Press, 1999: 399-437
2. McCarter YS, Ratkiewicz IN, Robinson A. Cord formation in BACTEC
medium is a reliable, rapid method for presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microb 1998; 36: 2769-71
3. Nelson SM, Deike MA, Cartwright CP. Value of examining multiple
sputum specimens in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. J Clin Microb 1998; 36: 467-69
4. Dunlap NE, Bass J, Fujiwara P, Hopewell P, Hersburgh CR, Salfinger M,
Simone PM. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1376-95
5. Gill VJ, Fedorko DP, Witebsky FG. The clinician and the microbiology
laboratory. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed. Pennsylvania: Churchill Livingstone, 2000: 184-221.
Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC) dahil, mikobakteri- lerin büyük ço¤unlu¤unun bölünme zaman› uzundur ve genellikle 2-3 haftal›k inkübasyondan sonra besiyerinde koloni görülür. Bu özellik- leri nedeni ile mikobakterilerin klasik yöntemler ile üretilmesi, tür dü- zeyinde tan›mlanmas› ve duyarl›l›k testlerinin sonuçland›r›lmas› için 45-60 günlük süreye gereksinim duyulur. Test süresini k›saltmak ama- c› ile h›zl› kültür yöntemleri gelifltirilmifl, ancak bu yeni yöntemler ile bu süre yar›ya indirilebilmifltir.
‹mmün yetmezli¤i bulunan kiflilerde daha s›k hastal›k oluflturan non-tüberküloz mikobakteri (NTM) infeksiyonlar›n›n insidans›nda son y›llarda art›fl gözlenmektedir. NTM’lerin 70’ten fazla türü bulun- makta olup, bunlar›n yaklafl›k 30’unun insan ve hayvanlarda hastal›k yapt›¤› bilinmektedir. Üretilmifl olan mikobakterilerin klasik metod- larla tür seviyesinde tan›mlanabilmesi için uzun süreye gereksinimleri yan›nda test say›s›n›n fazla olmas› uygulama ve de¤erlendirme zorluk- lar›n› da beraberinde getirmektedir. H›zl› kültür yöntemlerinden rad- yometrik Bactec 460 sisteminde (BD Biosciences) kullan›lan NAP (p- nitro-α−asetilamino-β-hidroksipropiofenon) testi sadece MTBC’i NTM’den ay›rabilmekte, moleküler yöntemler kullan›lmad›¤› taktirde NTM’lerin tan›mlanmas› için yine fenotipik özelliklerin belirlenmesi- ne dayanan klasik metotlara baflvurmak gerekmektedir.
Mikobakteriyoloji laboratuvar› uygulamalar›nda daha k›sa zamanda sonuçlanan genotipik yöntemler gelifltirilmifltir. Rutin uygulamalarda, kültür ve fenotipik özelliklere dayanan mikobakteri identifikasyon ve duyarl›l›k yöntemlerinin alt›n standart oldu¤u göz ard› edilmeksizin moleküler yöntemlerin kullan›lmas› yararl› olacakt›r.
Rutin mikobakteriyoloji laboratuvar›nda tan› için kullan›lan mole- küler yöntemler;
Klinik örneklerden direkt olarak MTBC’nin varl›¤›n›n saptanmas› Kültürde üretilen mikobakterilerin tiplendirilmesi amac›na dayan-
maktad›r.
Ayr›ca epidemiyolojik ve henüz daha rutin uygulamaya girmemifl olan antitüberküloz ilaç duyarl›l›klar›n› belirlemek amac› ile de mole- küler yöntemler gelifltirilmifltir.
1. Klinik örneklerden direkt MTBC’in saptanmas›:
Tüberküloz hastalar›n›n erken tan› ve tedavisi bu hastal›ktan toplu- mu korumada en etkili yoldur. Aside alkole rezistan basil (AARB) bo- yama teknikleri ile mikroskopik inceleme kültüre göre daha h›zl› bir metot olarak kabul edilebilir. Ancak mikroskopik incelemede AARB’in görülebilmesi için klinik örne¤in mililitresinde yaklafl›k 10.000 bakteri olmas› gerekir. Ayr›ca mikroskopik inceleme sonucu saptanan basilin MTBC veya hangi tür mikobakteri oldu¤u konusunda karar verilemez. Bu amaçla in vitro flartlarda türe özgü nükleik asid bölgesinin ço¤alt›lmas› ve tespitine olanak sa¤layan nükleik asid amp- lifikasyon (NAA) teknikleri gelifltirilmifltir.
Klinik örneklerden direkt MTBC tayini için farkl› amplifikas- yon metodlar›n›n kullan›ld›¤› pek çok ticari sistem bulunmaktad›r. Gü- nümüzde Food and Drug Administration (FDA) taraf›ndan onay veri-
len iki ticari sistem mevcuttur: Amplified Mycobacterium Tuberculo- sis Direct Test (MTD), (Gen-Probe) ve AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test (Roche Diagnostic System). Bu iki sitemde de FDA onay› solunum sistemi örnekleri için al›nm›flt›r. Her iki sistem için AARB pozitif klinik örneklerde sonuçlar mükemmel (duyarl›l›k %95- 96, özgüllük %100) iken, AARB negatif örneklerde duyarl›l›k ve öz- güllükleri düflüktür (duyarl›l›k %48-53, özgüllük %96-99). Bu neden- le FDA bu iki ürün için 1996 y›l›nda sadece AARB pozitif solunum yolu örneklerinde kullan›m›na onay vermifltir. 1999 y›l›nda MTD AARB negatif örnekler için de FDA onay›n› alm›flt›r. Bunun üzerine, Center for Disease Control and Prevention (CDC) 2000 y›l›nda yeni bir algoritm haz›rlayarak rehberini yenilemifltir. Yeni rehbere göre, EZN boyamas› ve mikobakteri kültürü için farkl› üç günde üç balgam örne¤i al›nmas›n› önermifltir. ‹lk örnek EZN pozitif ve NAA pozitif ise; hasta tüberkülozlu oldu¤u kabul edilir, testin tekrar›na gerek yok- tur. E¤er ilk balgam AARB pozitif, ancak NAA negatif ise; inhibitör- lerin varl›¤› araflt›r›lmal›d›r. Herhangi bir inhibitör madde tesbit edile- mez ise; ikinci bir balgam örne¤inde test tekrarlanmal›d›r. E¤er ikin- ci balgam AARB pozitif, NAA negatif ve herhangi inhibitör madde saptanamaz ise; hasta NTM ile infekte oldu¤u kabul edilir. E¤er inhi- bitörün varl›¤› tespit edilmifl ise NAA’n›n tan› de¤eri yoktur. Bu du- rumda ikinci bir balgam örne¤i ile test tekrarlanmal›d›r. (Test tekrar›- n›n üçten fazla yap›lmas›n›n yarar› yoktur)
AMPLICOR sisteminin örnekte bulunan inhibisyonu saptayabilme yetene¤i vard›r. MTD testinde inhibisyonun belirlenmesi için ekstrak- te edilmifl balgam›n içine yaklafl›k 10 MTBC basili konulmas› öneri- lir. Negatif sonuç inhibitör varl›¤›n› gösterir.
E¤er AARB negatif ve MTD pozitif ise; CDC hastan›n ikinci bir balgam örne¤inde testin bir kez daha tekrarlanmas›n› önermektedir. ‹kinci kez MTD pozitif bulunmufl ise hastan›n tüberkülozlu oldu¤u varsay›l›r. ‹kinci tekrar›n nedeni, AARB negatif vakalarda MTD testi- nin özgüllü¤ünün %96-99 aras›nda olmas›na ba¤l› konulabilecek yan- l›fl tan›dan kaç›nmak içindir. Kros kontaminasyona ba¤l› geliflebilecek yanl›fl pozitif sonuçlar göz ard› edilmemeli, AARB negatif ve MTD pozitif vakalarda hastan›n klini¤i ve radyolojisi ile uyumlu oldu¤u gözlenmelidir. Ayr›ca yedi günden fazla veya son bir y›l içinde antitü- berküloz ilaç alan hastalar›n solunum yolu örnekleri NAA için kabul edilmez.
Solunum yolu d›fl›ndaki klinik örneklerde direkt MTBC aranmas› için elimizde yeterli veri yoktur ve ticari ürünler için FDA onay› bu- lunmamaktad›r. Bu konuda kontrollü genifl çal›flmalara ve yöntem modifikasyonlar›na gereksinim duyulmaktad›r. Örne¤in plevral ma- yii’de bulunan inhibitörler MTD amplifikasyonunu önledi¤i saptanm›fl olup, bu tür klinik materyallerde bulunan inhibitörlerin y›kanarak uzaklaflt›r›lmas›ndan sonra çal›fl›lmas› önerilmektedir.
FDA onay› olmamakla birlikte di¤er kurulufllardan onay alm›fl ve sat›fla sunulmufl çeflitli ticari ürünler de bulunmaktad›r. Strand Disp- lacement Amplification (SDA) yönteminin kullan›ld›¤› BDProbeTec ET (BD Biosciences), Ligase Chain Reaction (LCR) yönteminin kul- lan›ld›¤› LCx Anyliser (Abbott), Nucleic Acid Sequence Based Amp-