lification (NASBA) yönteminin kullan›ld›¤› QR System Anyliser (Or- ganon Teknika) bu gruptad›r. Klinik materyalden direkt MTBC arama iflleminde in-house (laboratuvarda haz›rlanm›fl) PCR yönteminin kul- lan›lmas› durumunda standardizasyon problemleri ile karfl›lafl›lmakta- d›r.
NAA testleri tüberküloz tedavisinin izlenmesinde kullan›lmaz. Tü- berküloz tedavisine ba¤l› kültür negatifleflmesinden hatta tedavinin ta- mamlanmas›ndan sonra da, bu testlerin pozitifli¤i devam edebilmekte- dir. Ayr›ca bir önceki hastadan al›nan ve bronkoskopta kalan MTBC veya DNA kal›nt›lar› yanl›fl pozitifli¤e yol açabilece¤i unutulmamal›- d›r.
2. Kültürde üretilen mikobakterilerin tür düzeyinde tan›mlanmas›:
Üreme özellikleri ve klasik biyokimyasal testlerle mikobakterilerin tan›mlanmas› kat› besiyerinde tatmin edici üremenin gözlenmesinden sonra 3 - 6 hafta sonra yap›labilmektedir. Bu testlerin uzun zaman al- mas› yan›nda say›ca da fazla olmas› ikinci bir dezavantaj oluflturmak- tad›r. Bu nedenle, CDC 1993 y›l›nda nükleik asid probu, NAP testi, high - performance liquid chromotography (HPLC) gibi çabuk sonuç- lanan test yöntemlerin kullan›lmas›n› önermifltir. Bu yöntemlerin MTBC tan›s›nda 21 gün avantaj sa¤lad›¤› bildirilmektedir.
Mikobakterilerin kromozomal DNA veya ribozomal RNA’lar›n›n, bunlara özgül olarak ba¤lanabilen DNA veya RNA proplar› yard›m› ile tür düzeyde tan›mlanmas› mümkün hale gelmifltir. Günümüzde prob teknolojisi olarak AccuProbe (Gen-Probe), BDProbeTec ET (BD Biosciences) and a mikrodilüsyon plate hibridizasyon (DDH Mycobacteria, Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co) bulunmaktad›r. AccuProbe ile 5, BDProbeTec ET ile 3, DDH Mycobacteria ile 18 mi- kobakteri türü tan›mlanabilmektedir. Bu sistemler prob teknolojsini
kulland›¤› için örnekte en az 105/ml basil bulunmal›d›r.
HPLC mikobakterilerin hücre duvar›nda bulunan mikolik asid yap› farkl›l›klar›n› ortaya koyarak tür seviyesinde tan›mlar. HPLC cihaz›- n›n pahal› olmas› ve iyi yetiflmifl eleman gerektirmesi kullan›m› s›n›r- lar. Referans laboratuvarlar›nda yayg›n olarak kullan›lmaktad›r.
1993’ten sonra mikobakterilerin tür düzeyinde tan›mlanmas›nda 16S rRNA, hsp65, rpoB ve di¤er gen bölgeleri hedef olarak seçilip, PCR baflta olmak üzere çeflitli amplifikasyon metodlar› ile ço¤alt›lma- s›na dayanan yöntemler gelifltirilmifltir. Amplifikasyondan sonra uy- gulanan prob hibridizasyon, restriction fragment length polymorphism (RFLP), DNA dizi ve DNA mikroarrays analizleri ile mikobakterile- rin tür düzeyinde tan›mlanmas› yap›labilmektedir. Mikobakterilerin identifikasyonunda DNA dizi analizi en yüksek seviyede do¤ru sonuç vermesine ra¤men cihaz›n pahal› olmas› kullan›m›n› s›n›rlar. Mikro- Seq 500 sistemi (Applied Biyosistems) 16S rRNA geninin bir bölümü- nün DNA dizisinin belirlenmesine dayan›r. Bu yöntemle M. tubercu- losis’i di¤er MTBC basillerinden ayr›labilmekte ve klinik örneklerden s›k olarak izole edilen baz› mikobakteri türleri tan›mlanabilmektedir. LIPA Mycobacteria, 16S-23S ribozomal RNA ara bölgesinin amplifi- kasyonu ve bu bölgenin PCR ürünlerinin revers-hibridizasyonu teme- line dayan›r. Bu metodla klinik örneklerden s›k olarak izole edilen mi- kobakteri türleri tan›mlanabilmektedir.
Klinik örneklerden izole edilen mikobakterilerin hemen hemen tamam›n› tan›mlayabilen PCR tabanl› RFLP yöntem gelifltirilmifl- tir. Bu yöntem 65 kDa a¤›rl›¤›ndaki ›s› flok proteinini kodlayan 439 bp uzunlu¤undaki hsp65 gen bölgesinin ço¤alt›lmas› ve BstEII ve Hae III enzimleri ile kesilmesi sonucu elde edilen DNA parçalar›- n›n jel elektroforezdeki paternlerinin yorumlanmas›na dayan›r. In- house olarak uygulanabildi¤i için ticari sistemlere göre daha eko- nomiktir.
Mikobakteriyoloji Laboratuvar›n›n Standardizasyonu ve Kalite Kontrol:
Do¤ru tan›ya ulaflmada; laboratuvar altyap›s›, test yönteminin seçi- mi, çal›flanlar›n deneyimi ve özeni, cihazlar›n verimli çal›fl›p, çal›flma- d›¤›n›n kontrolü, sürekli yap›lan internal ve eksternal kontrol ve dene- timlerin rolü büyüktür.
i. Moleküler tan› laboratuvar›n›n yap›lanmas›: Moleküler yöntem-
ler için önerilen yap›sal altyap› sa¤lanmal›d›r. Çal›flma kurallar› be- lirlenmeli ve taviz verilmeden uygulanmal›d›r. ‹fl ak›fl› temiz odadan kirli odaya do¤ru yap›lmal›d›r.
ii. Klinik örne¤in laboratuvara kabulu: Genel olarak klinik örnekler-
de mikobakteri yo¤unlu¤u son derece azd›r. Ayr›ca balgam içinde amplifikasyonu önleyici inhibitör maddeler mevcuttur. Balgam için önerilen ideal miktar 15-20 ml’dir. Beyin omurilik s›v›s› gibi az mik- tarda elde edilen klinik materyel 5 ml’nin alt›nda olmamal›d›r. He- molizli örnek gönderildi¤inde, mümkün ise yeni bir balgam örne¤i istenmelidir. Hemoglobin amplifikasyon ifllemi üzerine inhibisyon etkisi yapar. ‹nhibitör etkilerinden dolay› antikoagulan madde kulla- n›lmamal›d›r. Ancak kullan›lmas› gerekiyor ise heparin veya sod- yum polianetol sülfat yerine EDTA kullan›lmas› önerilmektedir.
iii. Homojenizasyon, - dekontaminasyon – konsantrasyon yöntemi
ile ifllenmifl balgam örne¤i moleküler metodlar için kullan›labilir. Pek çok ticari sistem ifllemlerini bu aflamada bafllatmaktad›r. Ancak, balgam›n homojenizasyon ve dekontaminasyonunda kullan›lan N asetil-L sistein – NaOH’n›n (NALC-NaOH) ve hatta fosfat tamponu- nun oluflturdu¤u kalsiyum fosfat kristallerinin NAA metodlar›nda in- hibitör bir faktör olarak rol oynayabilece¤i bildirilmektedir. ‹nhibitör faktörlerin birden fazla y›kama ve santrifüj ifllemi ile uzaklaflt›r›labi- lece¤i bildirilmektedir. Di¤er bir öneri NALC-NaOH kullanmaks›- z›n distile su ile homojenizasyonun sa¤lanmas› fleklindedir.
iv. Ekstraksiyon: Mikobakterilerin lipidden zengin kal›n hücre duvar
yap›s› DNA ekstraksiyonunu zorlaflt›rmaktad›r. E¤er ticari bir ürün kullan›l›yor ise kit önerilerine uyularak ifllem tamamlan›r. Mikobak- terilerde ekstraksiyon ifllemi için çok farkl› yöntemler denenmifltir. Fiziksel ifllemler (kaynatma, sonikasyon, cam boncukla çalkalama, dondurma çözme), kimyasal maddeler (guanidyum tuzu, sodyum hidrosid, sodyum dodesilsülfat, cheleks) ve enzimatik sindirim (li- zozim, proteinaz K) kullan›larak ekstraksiyon sa¤lanabilir. Labora- tuar iyi sonuç ald›¤› standart bir ekstraksiyon metodunu kullan›r. Klinik örne¤in ifllenmesi ve ekstraksiyonu sonras› bakteri say›s› 10 / ml alt›na düfler ise yanl›fl negatif sonuç elde edilir. Balgam›n ori- jinalinde bakteri say›s› az olabilece¤i gibi, ifllemler s›ras›nda yap›- lan hatalar bakteri veya nüklek asid kayb›na yol açabilir. MTBC kü- me oluflturma özelli¤ine sahip oldu¤u için, tam bir homojenizasyon sa¤lanamaz ise yalanc› negatif sonuç ile karfl›lafl›labilir.
v. Amplifikasyon ve ürününün tayini: Ticari bir sistem kullan›l›yor
ise ürün önerilerine göre çal›flma yap›lmal›d›r. Is› blo¤u veya ben- zeri bir ›s›t›c› kullan›l›yor ise cival› termometre ile kontrollü çal›fl›l- mal›d›r. In house PCR uygulanacak ise amplikasyon tüpündeki her bir parametrenin ve siklus parametrelerinin optimizasyonu gerek- mektedir.
vi. Kontrollü çal›flma: Moleküler yöntem kullan›lacak ise mutlaka
AARB ve kültür metodlar› ile desteklenmelidir. Kat› kültür vasatla- r›n›n duyarl›l›¤›n›n düflük olmas› nedeni ile s›v› kültür vasatlar›n›n kullan›lmas› iki yöntemin karfl›laflt›r›lmas›n› kolaylaflt›r›r. Hastan›n klini¤i üçüncü bir parametre olarak de¤erlendirilebilir. Bu de¤erlen- dirmeler ile moleküler yöntemin hatal› pozitiflik ve negatiflik, poz- itif ve negatif prediktif de¤erleri saptanabilir. Hatal› pozitiflik oran› %1’den fazla ise, bu kabul edilmez bir de¤erdir.
vii. Pozitif ve negatif kontrol testleri: Her seri çal›flmada pozitif ve
negatif kontroller kullan›lmal›d›r. Pozitif ve negatif kontroller ör- neklerle birlikte ifllemlenmelidir. Kontrollerde ATCC numaral› standard sufllar kullan›lmal›d›r.
viii. Kalite kontrol (performans) testleri: Performans testleri çift kör
olarak yap›lmal›d›r. Bakteri say›s› örne¤in 0/ml, 10/ml, 100/ml,
1000/ml, 10000/ml … olacak flekilde ayarlanarak, balgam ve/veya fosfat tampondaki NAA performans› de¤erlendirilebilir. Eksternal performans testleri ba¤›ms›z bir kurulufl taraf›ndan yap›l›r. Bu kuru- lufl taraf›ndan gönderilen özellikleri bilinmeyen numuneler laboratuvarda test edilir ve laboratuvarda elde edilen test sonuçlar› bildirilir. Bu merkez sonuçlar› de¤erlendirir ve testin / laboratuvar›n performans› hakk›nda rapor sunar. Eksternal kalite programlar› içerisindeki laboratuvarlar›n yaklafl›k %50’sinin program yürütücü- lerin kriterlerine göre tam yeterli sonuca ulaflamad›klar› bildirilmek- tedir.
ix. Prob teknolojisi ile mikobakterinin tür düzeyinde tayini: Kül-
türde mikobakteri üredi¤inde kullan›labilir. S›v› kültürde üreyen mikobakteri santrifüj ile yo¤unlaflt›r›ld›ktan sonra ifllem bafllat›l›r. Örne¤in AccuProb’da bakteri yo¤unlu¤u McFarland 1 standard›na eflde¤er olmal›d›r. Kat› besiyerinde kolonilerden bir parça al›narak steril distile su ile McFarland 1 standard›na ulaflt›r›l›r. PCR bazl› mikobakteri idantifikasyon yöntemlerinde yo¤un bakteri yüküne gereksinim yoktur.
KAYNAKLAR
1. Burkardt H-J. Standardization and quality control of PCR analyses. Clin
Chem Lab Med 2000; 38: 87-91.
2. Durmaz R. Nükleik asit amplifikasyon yöntemlerinde sorunlar ve standar-
dizasyon. In Durmaz R.(ed). Uygulamal› Moleküler Mikrobiyoloji kursu Kitab›, 25-29 Haziran 2001, Malatya: s.45-56.
3. Eisenach KD. Molecular diagnosis. In: Ratledge C, Dale J (eds).
Mycobacteria. Londfon: Blacwell Science, 1999161-179.
4. Kocagöz T. Tüberküloz tan›s›nda kullan›lan moleküler yöntemler. In:
A¤açfidan A, Badur S, Türko¤lu S (eds). ‹nfeksiyon hastal›klar›n moleküler tan›s›nda moleküler yöntemler. ‹stanbul: MGG Matbaac›l›k, 2002: 189-195.
5. Molecular diagnosis of tuberculosis: current clinical validity and future
perspectives. Eur Respir J 1997; 10: 1877-1891.
6. Pfaller MA. Molecular approaches to diagnosing and managing infectious
diseases: Practically and costs. Emerging Infectious Diseases 2001 ; 7: 312-318.
7. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR 2000;
49: 593-594.
8. Woods GL. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic tech-
niques. Infectious Disease Clinics of North America 2002; 16: 127-144.
G‹R‹fi
Tüberkülozun gittikçe yükselen grafi¤inde en önemli konulardan birisi çok ilaca dirençli Mycobacterium tuberculosis sufllar›n›n artma- s›d›r. Bundan dolay›, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlar› tüberkülo- zun kontrolünde önemli bir rol oynamaktad›rlar.
Tüberkülozda duyarl›l›k testlerini uygulama teknikleri; hem uy- gulanan yöntem olarak, hem de sonuçlar›n yorumlanmas›nda fark- l› laboratuvarlar aras›nda büyük de¤iflkenlikler göstermektedir. Gü- venilir bir duyarl›l›k test yöntemi; duyarl› veya dirençli olarak mi- nimum düzeyde hatal› s›n›flama yapmal›d›r. Hatal› s›n›flama; hata- l› duyarl›l›k (major hata) ve hatal› dirençlilik (minör hata) olarak iki ayr› kategoride de¤erlendirilmektedir. Bir suflun referans yön- temde dirençli fakat test etkinli¤i araflt›r›lan yöntemde duyarl› gö- rünmesi major hata olarak s›n›fland›r›lmaktad›r. Sa¤alt›m› uzun sü- ren bir hastal›k olan tüberkülozda, hatal› duyarl› s›n›flama nedeniy- le, bir suflun dirençli oldu¤u bir antibiyoti¤in hastaya uygulanmas› tedavi baflar›s›zl›klar›na neden olmaktad›r. Tam tersine bir suflun referans yöntemde duyarl› fakat test etkinli¤i araflt›r›lan yöntemde dirençli görünmesi minör hata olarak s›n›fland›r›lmaktad›r. Minör hatan›n major hata gibi a¤›r klinik yans›malar› olmasa da hasta kul- lanabilece¤i bir antibiyoti¤i, hatal› dirençli s›n›flama nedeniyle, kullanamamaktad›r.
Antibiyotik duyarl›l›k testleri; bafllang›ç kemoterapisinin seçimi- ni yönlendirmede, hastan›n tedaviye cevap vermemesi durumunda ilaç direncinin ortaya ç›k›fl›n› do¤rulamada ayr›ca toplumdaki pri- mer ve edinilmifl ilaç direncini hesaplamada kullan›l›rlar. Bu ne- denlerden dolay›, duyarl›l›k testlerinde güvenilir bir teknik kullan- mak esast›r.
Antibiyotik duyarl›l›k testleri; tüm hastalardan edinilen bafllang›ç izolatlar›nda, üç ayl›k tedaviye ra¤men kültür pozitifli¤i devam edi- yorsa ve tedaviye cevapta baflar›s›zl›¤›n klinik kan›tlar› varsa uygulan- mal›d›r.
Antibiyotik duyarl›l›k test yöntemleri
Modern ve konvansiyonel yöntemler olarak iki ana bafll›kta toplaya- biliriz.
Modern yöntemler: Genotipik yöntemler; direnci oluflturan mutas- yona u¤ram›fl genlerin saptanmas›na dayan›r. Rifampin için rpoB; izo- niazid için katG, inhA, ahpC ve oxyR genlerini saptayan PCR-SSCP buna örnektir.
Fenotipik yöntemler: mikobakteriyel canl›l›¤a ait mark›rlar›n sap- tanmas› esas›na dayan›r. Flow cytometry, Microplate-based Alamar Blue Assay, Phage Amplified Biologically Assay, RT-PCR, Biolumi- nescence Assay ve Luciferase Reporter Phage yöntemleri örnek olarak verilebilir.
Konvansiyonel yöntemler:
Mutlak konsantrasyon yöntemi; antibiyotikli ve antibiyotiksiz besi- yerleri 2x103
– 1x104
cfu/ml mikobakteri içeren özenli haz›rlanm›fl bir inokulum ile ekilir. Direnç belli bir say›dan (20 cfu) fazla üremeyle ta- n›mlan›r.
Direnç oran› yöntemi; ‹lkine benzer, fakat farkl› olarak ikinci s›ra LJ tüpleri M. tuberculosis H37Rv ile inokule edilir. Bu yöntemde 105 cfu/ml’lik inokulum kullan›l›r ve direnç ise test suflunun M‹K de¤eri- nin H37Rv’nin M‹K de¤erine bölünmesiyle elde edilir.
Proporsiyon yöntemi; ‹nokulumun belli dilüsyonlar› hem kontrol hem de ilaç içeren besiyerlerine ekilir. ‹laçl› besiyerinde üreyen kolo- nilerin say›s›, kontrol besiyerindeki kolonilerin say›s›yla karfl›laflt›r›l›r. Buradan belli bir ilaca dirençli basillerin oran› hesaplan›p, test edilen populasyona yüzdesi olarak ifade edilebilir. Modifiye proporsiyon yöntemi alt›n standart yöntem olarak tan›mlanmaktad›r.
Proporsiyon yönteminin esas›
‹laca dirençli tüberküloz basillerini belirleme amprik temellere otur- tulmufltur. Antibiyotik duyarl›l›k test yöntemlerinde ve sonuçlar› yo- rumlamakta kullan›lan kriterlerde iki konu gözönüne al›n›r. Bunlardan birisi test besiyerindeki ilac›n konsantrasyonu ve bir di¤eri ise ilaca di- rençli mutantlar›n oran›d›r. Klinik cevab›n al›namad›¤› antitüberküloz ilaçlara dirençli basil oran›, yap›lan klinik ve bakteriyolojik çal›flmalar sonucunda, genel olarak %1 düzeyi kriter al›narak ayarlanm›flt›r. Test edilen sufl belli bir antibiyoti¤e karfl› %1 veya daha yüksek oranda di- rençli ise sonucu dirençli; %1’in alt›ndaki oranlarda dirençli ise sonu- cu duyarl› olarak yorumlamaktay›z. Tablo 1’de proporsiyon yöntemi esas al›nd›¤›nda, antibiyotiklerin farkl› besiyerlerindeki eflde¤er son ilaç konsantrasyonlar› görülmektedir. Farkl› besiyerlerindeki kritik konsantrasyon de¤erlerinin farkl›l›¤›; baz› besiyeri içeriklerine farkl› absorbsiyon ve ba¤lanma, besiyeri haz›rlanmas› esnas›nda ilac›n inak- tivasyonu ve inkübasyonun farkl› evreleri esnas›nda ilac›n etkisinin azalmas› nedeniyledir.
Test edilecek antibiyotiklerin seçimi
Tüberküloz basillerinin duyarl›l›k testi için primer ilaçlar›n tam pa- neli; iki farkl› konsantrasyonda izoniazid (kritik ve yüksek konsantras- yon), rifampin, ethambutol, streptomisin ve pirazinamidi içermelidir. Azalt›lm›fl panel ise; izoniazid, rifampin ve ethambutolün tek bir kri- tik konsantrasyonunu içerir. Laboratuvarlar, hastanelerindeki tüberkü- loz uzmanlar›yla koordine ederek bu iki panelden birisini seçebilir. Fa- kat tam panel pirazinamid ve izoniazidin yüksek konsantrasyonunu da içerdi¤inden dolay›, direnç sözkonusu oldu¤unda dörtlü ilaç tedavisi- nin etkinli¤i hakk›nda hemen bilgi sa¤layabilmektedir. Bir tüberküloz basili izolat› rifampine veya primer ilaçlar›n herhangi ikisine direnç- liyse; tüm sekonder ilaçlar test edilmelidir.