arkadafllar›n›n uzun süredir seviyeli araflt›rmalar› ve yay›nlar› bizlere yeni bilgilerin ö¤renilmesine yard›mc› olmaktad›r (10, 14).
Genetik farkl›l›klar› ortaya koymada di¤er bir yöntem de RAPD (random amplified polymorphic DNA)’dir. Genetik farkl›l›klar kona¤a, parazite ya da çal›fl›lan koflula ba¤l› olarak de¤ifliklikler gösterir. Epidemiyolojik tiplendirme amac›yla en çok baflvurulan yöntemlerden biri olan RAPD tekni¤inde, yaklafl›k 10 bazl›k primerler ile amplifikasyon gerçeklefltirilir. Primer seçimi tiplendirilecek mikroorganizman›n genom bilgisine gereksinim olmaks›z›n tamamen rastgele olabildi¤i gibi, genom içerisindeki belirli bölgelere yönelik, örne¤in çeflitli rDNA genlerine uygun ve bilinçli olarak da seçilebilir. RAPD yönteminin laboratuvar içi stabilitesinin bile birçok faktörden etkilenebilece¤i her zaman göz önünde tutulmal›d›r (15).
Geleneksel yöntemlerle konan tan›n›n do¤rulanmas› ve tür tayini çal›flmalar›nda moleküler yöntemlerin ELISA’ya karfl› üstünlükleri göz ard› edilemez. Belki daha da önemlisi epidemiyolojik verilerin de¤erlendirilmesi, türler aras› varyasyonlar›n belirlenmesi, tan› kitleri ve afl› çal›flmalar›n›n gelifltirilmesinde de çok önemli bir yere sahiptir.
Henüz tamamlanmasa da önemli bir ad›m olan kolay ve d›flk›dan kolayl›kla tan›ya gidilebilece¤i h›zl› bir tan› yöntemi- E. histolytica dipstik tan› kiti–umududur. Bu konudaki ilk veriler ve ön çal›flmalar bize çok yak›n gelecekte bu kitin haz›r olaca¤› müjdesini tafl›maktad›r (16).
E. histolytica’n›n de¤iflik co¤rafik yerleflim yerlerine göre de¤iflik klinik tablolar göstermesi bize infeksiyonun tan›mlanmas›nda da s›k›nt›lar yaflanmas›na neden olmaktad›r. Çünkü her 10 E. histolytica infeksiyonunun sadece birinde klinik tablonun nas›l olufltu¤u konusunda bir kesin bilgimiz yoktur (genotip?). E. histolytica de¤iflik sufllar›ndaki genotiplendirme sonucu tRNA genleri aras›nda intergenic bölgelerin k›sa tekrarlayan yap›lar (STR) içerdi¤i gösterilmifltir. Bu nedenle E. histolytica tRNA genleri, kromozomal DNA’n›n %11’ini, her ünitesinde 1-5 tRNA içeren 25 farkl› tandem array yöntemiyle tRNA genlerine bitiflik STR lokuslar›n tümü araflt›r›larak E. histolytica spesifik primerlerle genotiplendirme yap›lmaktad›r. Genotiplendirme modeli oluflturulan yöntem kullan›larak yap›lan bir çal›flmada, ülkemizdeki alt› örnekte üç STR lokusu kullan›larak (D-A, A- L ve R-R) üç genotip bulundu¤u, bu genotiplerin de Gürcistan’a ait DNA örneklerinden farkl› olduklar› gözlenmifltir (16). Böylelikle tüm dünyada farkl› genotiplerin varl›¤›n› göstermek, bize E. histolytica polimorfizmleri ile klinik görünümler aras›ndaki iliflkiyi ö¤renmemize yard›mc› olacakt›r. Ayn› bölgede farkl› sufllar›n varl›¤› söz konusudur, bu da klinik görünümü etkileyebilir. Bu nedenle de, amebiasis tan› ve afl› çal›flmalar›nda genifl, kapsaml›, bilinçli ve organize moleküler epidemiyolojik çal›flmalara ihtiyac›m›z vard›r.
‹ki y›l önce, Paris-Pastör Enstitüsü, May›s 2003’deki Avrupa Moleküler Mikrobiyoloji Organizasyonu toplant›lar›nda E. histolytica ile beraber E. invadens, E. moshkovskii, E. dispar ve E. terrapinae’nin genom sekanslar› için DNA mikroarray gelifltirmeye çal›flt›klar› array yönteminde tan›mlad›klar›n› da içeren yeni yaklafl›mlar ve çal›flmalardan söz edilmifltir (17). Bu y›l (2005) içinde de, E. histolytica’n›n genomunun ç›kar›lmas›yla bakteriyel genlerin lateral gen transferleri (LGT), di¤er protistler aras›nda flimdiye kadar tan›mlanmayan yeni reseptör kinazlar›n varl›¤›, virülans, vezikül transportu ve fagositoz gibi birçok fonksiyonel
yap›lar›n tan›mlanmas› (18) gelecekte yeni bilgiler elde etmemize, amebiasis üzerinde gerek tan› üzerinde gerekse de afl› çal›flmalar›nda ivme kazand›rm›flt›r.
Etkili bir E. histolytica afl›s› için öncelikle amebiasisin patogenezini bilmekle bafllamaktad›r. Lektin arac›l›kl› konak- parazit iliflkisi E. histolytica’n›n konak hücredeki caspase-3’ü indüklemesi ve apopitosisle hücre ölümüyle sonuçlanmaktad›r. E. histolytica’n›n tan›mlanmas› ve apopitotik hücrelerin sindirilmesi bizlere, lektin arac›l›kl› ölümü ve bunun da apopitosis süresince yüzey de¤iflikliklerine ba¤l› olduklar›n› göstermifltir. Bu noktadan hareketle, lektinin anti-amebik antikorlarla durdurulmas›nda, amebapor’un nötralizasyonu ve apopitotik hücrelerin endositozunda amebik reseptörlerin inhibisyonu durumunun hastal›¤a karfl› koruyucu olaca¤› düflüncesi hakim olmufltur. Amebik patogenezde bir yaflamsal yap›tafl› olan Gal/GalNAc lektin en cazip afl› aday›d›r. Genetik lektinin "knock-out" yoluyla in vivo koflullarda dominant negatif mutantlar›n oluflumuna ya da anti-sense-RNA parazitin virülans›n azalt›lmas›na neden olur. Elbette ki, bir laboratuvar suflu üzerindeki çal›flmalar dünyan›n dört bir yan›ndaki sufllardan farkl›d›r, ayn› oranda de¤erlendirilemez ve de bu bilgiler parazit popülasyonundaki genetik farkl›l›¤›n›n derecesini saptamada çok önemlidir. Bunun böyle de¤erlendirilmesinin bir nedeni de, E. histolytica’n›n seksüel üreme faz›n›n bulunmay›fl›d›r, dolay›s›yla bu özellik onu sufllar aras›nda çok daha az genetik farkl›l›¤›n oluflmas›na nedene olmakta, iflleri kolaylaflt›rmaktad›r. E. histolytica klonal yap› göstermektedir ya da süperoksid dismutaz ve aktin genleri aras›ndaki intergenik bölgeler aras›ndaki sekans korunmas›yla da gösterildi¤i gibi ilgili mikroorganizmalar aras›ndaki yak›nl›k azd›r. A¤›r (hgl) subüniti kodlayan gendeki DNA dizisinin korunmas› - mutasyonun azl›¤› - bu antijenin kullan›lmas›nda küresel olarak bize çok daha efektif olaca¤› ipuçlar›n› vermektedir. Kazan›lm›fl immünitenin mukoza immün yan›tla birlikte oldu¤u sonucu klinik gözlemlerle de elde edilmifltir (mukoza anti-lectin IgA antikoru olan kifliler %64 daha az yeni E. histolytica infeksiyonuna yakalanm›fllard›r) Oral afl› gelifltirmenin en efektif yollar›ndan birisinin lektin antijeni eksprese eden bitki modelidir. Bunun avantajlar›, bakterilerin aksine proteinleri eksprese etmenin çok daha yüksek oranda olma kabiliyeti ve de hayvansal hücrede rastlan›lan prion ve virüslerden kaç›nma oran›n yüksekli¤idir (19).
Sonuçta, önemli bir hastal›k olan amebiasisin tan›s›, günümüzde s›kl›kla mikroskopi ve seroloji ile konmaktad›r. Ancak ELISA, PCR ve de olas› dipstik testlerin yayg›n kullan›m› tan›y› kolaylaflt›racak (20,21), sa¤l›kl› epidemiyolojik verilerin temininde, tedaviyi yönlendirmede, patogenezin anlafl›lmas›nda, yeni tan› kitleri ve afl› çal›flmalar›n›n yürütülmesinde bizlere çok önemli bilgiler verecektir.
KAYNAKLAR
1. Tachibana H, Cheng X-J, Masuda G, Horiki N, Takeuchi T. Evaluation of recombinant fragments of Entameba histplytica Gal/GalNAc lectin intermediate subunit for serodiagnosis of amebiasis. J Clin Microbiol 2004; 42:1069-74.
2. Beck DL, Tanyuksel M, Mackey AJ, Haque R, Trapaidze N, Pearson WR, Loftus B, Petri WA, Jr. Entamoeba histolytica: Sequence conservation of the GalNAc lectin from clinical isolates. Exp Parasitol 2002; 101:157-63.
3. Gonin P, Trudel L. Detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar isolates in clinical samples by PCR and enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 2003; 41: 237-41.
4. Blessmann J, Ali IK, Nu PA, Dinh BT, Viet TQ, Van AL, Clark CG, Tannich E. Longitudinal study of intestinal Entamoeba histolytica infections in asymptomatic adult carriers. J Clin Microbiol 2003; 41: 4745-50.
KL‹M‹K 2005 XII. TÜRK KL‹N‹K M‹KROB‹YOLOJ‹ VE ‹NFEKS‹YON HASTALIKLARI KONGRES‹
MA, van Lieshout L, Polderman AM. Simultaneous detection of Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, and Cryptosporidium parvum in fecal samples by using multiplex real-time PCR. J Clin Microbiol 2004; 42: 1220-23.
6. Kebede A, Verweij JJ, Endeshaw T, Messele T, Tasew G, Petros B, Polderman AM. The use of real-time PCR to identify Entamoeba histolytica and E. dispar infections in prisoners and primary-school children in Ethiopia. Ann Trop Med Parasitol 2004; 98: 43-8.
7. Blessmann J, Buss H, Nu, PAT, Dinh BT, Ngo QT, Van AL, Alla MD, Jackson TF, Ravdin JI, Tannich E. Real-time PCR for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in fecal samples. J Clin Microbiol 2002; 40: 4413-17.
8. Bhattacharya S, Bhattacharya A, Diamond LS. Entamoeba histolytica extrachromosomal circular ribosomal DNA: analysis of clonal variation in a hypervariable region. Exp Parasitol 1992; 74: 200-4.
9. Mukhopadhyay A, Chakraborti A, Mahajan RC, Ganguly NK. Entamoeba histolytica: rapid identification and differentiation of Indian isolates by riboprinting. Exp Parasitol 2002; 102: 109-12.
10. Clark CG. PCR detection of pathogenic Entamoeba histolytica and differentiation from other intestinal protozoa by riboprinting, p. 468-474. In Persing D H, Smith TF, Tenover FC, White TJ. (ed.), Diagnostic molecular microbiology. principles and applications. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1993.
11. Clark CG. Riboprinting: A tool for the study of genetic diversity in microorganisms. J Eukaryot Microbiol 1997; 44: 277-83.
12. Clark CG, Diamond LS. Ribosomal RNA genes of 'pathogenic' and 'nonpathogenic' Entamoeba histolytica are distinct. Mol Biochem Parasitol 1991; 49: 297-302.
13. Clark CG, Diamond LS. Differentiation of pathogenic Entamoeba histolytica from other intestinal protozoa by riboprinting. Arch Med Res 1992; 23: 15-6.
14. Clark CG, Diamond LS. Intraspecific variation and phylogenetic relationships in the genus Entamoeba as revealed by riboprinting. J Eukaryot Microbiol 1997; 44: 142-54.
15. Gomes MA, Melo MN, Macedo AM, Furst C, Silva EF. RAPD in the analysis of isolates of Entamoeba histolytica. Acta Tropica 2000; 75: 71-7.
16. Tanyuksel M, Ulukanligil M, Araz E, Ali IKM, Koru O, Herbein J, Clark CG, Petri WA, Jr. Entamoeba histolytica tan›s›nda h›zl› tan› yönteminin (dipstick test) yeri ve genotiplendirmede yeni bir yöntemin tan›mlanmas›. IV.Ulusal Sindirim Yolu ile Bulaflan ‹nfeksiyonlar Simpozyumu Özet Kitab›. 16-20 May›s 2005, Mersin.
17. EMBO workshop on "Pathogenesis of amoebiasis: from genomics to disease", Pasteur Institut, Paris, France, May 19-21 2003, Abstract Book.
18. Loftus, B., I. Anderson, R. Davies, et al. The genome of the protist parasite Entamoeba histolytica. Nature. 2005; 433: 865-8.
19. Miller-Sims VC, Petri WA, Jr. Oppurtinities and obstacles in developing a vaccine for Entamoeba histolytica. Curr Opin Immunol 2002; 14: 549-52.
20. Tanyuksel M, Petri WA, Jr. Laboratory diagnosis of amebiasis. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 713-29.
21. Tanyuksel M, Yilmaz H, Ulukanligil M, Araz E, Cicek M, Koru O, Tas Z, Petri WA, Jr. Comparison of two methods (microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay) for the diagnosis of amebiasis. Exp Parasitol 2005; 110: 322-6.
S›tma halen dünyadaki en önemli parazit hastal›¤› olma özelli¤ini sürdürmektedir. Her y›l 500 milyon üzerinde s›tma olgusunun varoldu¤u, ço¤u 5 yafl alt› çocuk olmak üzere her y›l 2,7 milyon kiflinin öldü¤ü tahmin edilmektedir (1). Bu kadar ciddi bir hastal›¤›n tan›s› oldukça önemlidir ve bu hastal›¤›n önlenmesi için afl› çal›flmalar› son h›z›yla devam etmektedir.
Uzun y›llardan beri, s›tma tan›s› için önerilen ve alt›n standart olarak kabul edilen rutin laboratuar yöntemi, ince yayma ve kal›n damla kan preparatlar›n›n birlikte de¤erlendirilmesidir. Bu kombine metod ile 50 parazit/μl (%0,001 parazitemi) kadar düflük paraziteminin saptanabildi¤i bildirilmektedir. Ancak bu prosedür zordur, fazla zaman gerektirir ve tecrübeli eleman ister. ‹flte bu nedenlerle son y›llarda özellikle ticari olarak, en az bu yöntemlerle ayn› ya da daha iyi sensitivite sa¤layan yöntemlerin araflt›r›lmas› sürdürülmektedir (2).
‹nce yayma ve kal›n damla preparatlara alternatif olarak kullan›lan yöntemler aras›nda yer alan floresan mikroskobik yöntemde, plasmodium nükleusundaki nükleik asitlere afinite gösteren ve böylece nükleusa yap›flarak, uygun dalga boylar›ndaki UV ›fl›kta nükleuslar›n güçlü floresan vermesine neden olan baz› floresan boyalardan yararlan›l›r. Bu amaçla s›kl›kla akridin oranj (AO) ve benzotiokarboksiporin (BCP) gibi boyalar yan›nda, parazit membran›n›n bütün oldu¤u canl›l›k durumunun de¤erlendirilmesi için rodamin-123 kullan›l›r. Floresan mikroskobik yöntemin sensitivitesinin daha iyi olmas›na ra¤men, spesifitesinde düflüklük olmas›, önemli bir dezavantaj olarak gösterilmektedir (2, 3).
‹nsan s›tma parazitlerinin dört türünün de tan›s› için kullan›labilen PCR yöntemi, mikroskobik bak› ile k›yasland›¤› zaman, 5 parazit/μl alt›ndaki parazitemiyi saptamas›, sensitivite ve spesifitesinin daha yüksek olmas› nedeni ile mikroskobik olmayan metodlar aras›nda en iyi yöntem olarak belirlenmifltir. Ancak, PCR, zaman almas›, teknik ekipman ve deneyim gerektirmesi gibi nedenlerle, rutin s›tma tan›s›n›n de¤erlendirilmesi için pratik bir yöntem de¤ildir. Ayr›ca, enfeksiyondan belirli zaman sonras›nda al›nan örneklerde DNA’n›n saptanmas›, rekrüdens ve ilaç direnci ile ilgili kar›fl›kl›klara neden olabilmektedir (3).
Dünya Sa¤l›k Örgütü’nün 2000 y›l›nda bildirdi¤i raporda, RDT (h›zl› tan› testleri)’nin mikroskobik yöntemler kadar güvenilir oldu¤u belirtilmifltir. Bu raporda RDT sensitivitesinin, mikroskobik testlerle k›yasland›¤› zaman ortalama %95 civar›nda oldu¤u, e¤er parazit dansitesi 100 parazit/μl (%0,002 parazitemi) fleklinde ise sensitivitenin %100’e ulaflt›¤› belirtilmifltir (2). Bu testler, mikroskobik bir yöntem olmamalar›, daha h›zl› olmalar›, zaman kazand›rmalar›, kolay uygulanabilmeleri, çok az tecrübe gerektirmeleri ve genellikle tek kullan›ml›k olmalar› gibi avantajlara sahiptir. ‹mmunokromatografik dipstik fleklindeki h›zl› tan› testlerinde
(fiekil 1) en s›k kullan›lan iki antijen HRP2 (P. falciparum’a özel) ve pLDH (dört plasmodium türünde de mevcut)’d›r. P. vivax tan›s›nda kullan›lan testlerin %90-96 (optiMAL) ve %75- 95 (ICT Pf /Pv) düzeylerinde sensitiviteye sahip oldu¤u belirlenmifltir (2, 3).
fiekil 1: S›tmada kullan›lan h›zl› tan› testlerinden örnekler
S›tma afl›lar›n›n insanlar üzerindeki koruyucu etkileri, yaklafl›k 30 y›l önce gösterilmifl olmas›na ra¤men, tam koruyucu etkideki bir s›tma afl›s› halen uygulan›ma konulamam›flt›r. Bu önemli gecikmenin nedeni, baz› faktörlere ba¤l› olarak zorluklar›n yaflanmas›ndan kaynaklanmaktad›r. Bu faktörler içerisinde en önemlisi, parazitin morfolojik ve genetik olarak kompleks bir yap› içermesi ve farkl› yaflam dönemlerine sahip olmas› nedeniyle konak immun sistemine yüzlerce farkl› antijenin sunulmas›d›r. Son y›llarda daha çok P. falciparum’a karfl› uygulanabilecek afl›lar üzerine çal›flmalar yap›lmaktad›r. Bunun nedenleri aras›nda, bu türün in vitro olarak kolay elde edilebilmesi, deneysel in vivo çal›flmalar›n mümkün olmas› ve en önemlisi bu türün fliddetli ve öldürücü enfeksiyonlara neden olmas› gelmektedir (4, 5).
S›tma afl›lar› parazit dönemlerine göre s›n›fland›r›lmaktad›r (preeritrositik afl›lar, aseksüel dönem afl›lar ve seksüel dönem- geçifli önleyici- afl›lar). Son çal›flmalar, farkl› yaflam dönemlerini hedefleyen afl›lar›n birlikte kullan›ld›¤› kombine afl›lar üzerine yo¤unlaflm›flt›r. Araflt›rmac›lar, ideal bir s›tma afl›s›nda iki temel hedefin var olmas› gereklili¤ini aksi halde tam korunman›n sa¤lanamad›¤›n› bildirmektedirler. Bu iki hedef, preeritrositik dönem (sporozoit ve hepatik dönem) ve aseksüel eritrositik dönemdeki parazitlere ait antijenlerdir. Baz› araflt›rmac›lar 3. hedef olarak seksüel dönem parazitlerinin de hedef al›nmas›, dolay›s› ile sadece hastal›¤›n önlenmesi de¤il, sivrisineklerde plazmodyumun yay›lmas›n›n da önlenmesi gereklili¤ini savunurlar. Günümüzde, s›tma afl›lar›nda hedeflenen ve parazitin farkl› yaflam dönemlerine ait olan yaklafl›k 40 kadar önemli temel antijen saptanm›flt›r (4, 6) (fiekil 2).