kodlar)’dir.
Üç farkl› genomik lokusu (ISFtu2, 23kDa, tul4) hedefleyen multitarget TaqMan assay sayesinde bir adet F.tularensis’i dahi saptamak mümkün oldu¤u iddia edilmifltir. Bu yöntem ayn› zamanda türe özgün sonuçlar verebilir. Üçünün pozitif oldu¤u durumda F. tularensis, ISFtu2 pozitif ve tul4 negatif ise F. philomiragia tan›s› konulabilir.
TaqMan PCR yöntemi tularemi salg›nlar›nda, biyoteror olgular›nda, organizman›n do¤a döngüsü s›ras›nda, ekolojisinin araflt›r›lmas›nda; hayvan dokular›, idrar, d›flk›, keneler, hasta örnekleri gibi birçok farkl› örnekler üzerinde çal›fl›lm›fl ve hassas flekilde F.tularensis’i saptad›¤› gösterilmifltir (5).
KAYNAKLAR
1. Ellis J, Oyston PC, Green M, Titball RW. Tularemia. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 631-46.
2. Karadenizli A, Gurcan S, Kolayli F, Vahaboglu H. Outbreak of tularaemia in Golcuk, Turkey in 2005: Report of 5 cases and an overview of the literature from Turkey. Scand J Infect Dis 2005;37: 712-6.
3. Helvaci S, Gedikoglu S, Akalin H, Oral HB. Tularemia in Bursa, Turkey: 205 cases in ten years. Eur J Epidemiol 2000; 16: 271-6.
4. Arikan OK, Koç C, Bozdo¤an O. Tularemia presenting as tonsillopharyngitis and cervical lymphadenitis: a case report and review of the literature. Eur Arch Otorhinolaryngol 2003; 260: 298-300.
5. Versage JL, Severin DD, Chu MC, Petersen JM. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J Clin Microbiol 2003; 41: 5492-9.
6. Lamps LW, Havens JM, Sjostedt A, Page DL, Scott MA.Histologic and molecular diagnosis of tularemia: a potential bioterrorism agent endemic to North America. Modern Pathology 2004; 17: 489-95.
7. Campbell, Malcolm. Real-time PCR, molecular beacon method. <http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/realtimepcr.html> Accessed 2/17/03.
8. Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, Singer MJ, Walburger DK, Lokhov SG, Gall AA, Dempcy R, Reed MW, Meyer RB, Hedgpeth J. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res 2000; 15: 28: 655- 61.
Mycobacterium tuberculosis’in tüberküloz etkeni olarak belirlenmesinden beri 120 y›l› aflk›n süre geçmesine karfl›n tüberküloz özellikle geliflmekte olan ülkelerde en önemli sa¤l›k sorunlar›ndan biri olmaya devam etmektedir. Bu ülkelerde tüberküloza ba¤l› ölümler önlenebilir ölümlerin %25’ini oluflturmaktad›r. Toplumu tüberkülozdan koruman›n en etkili yolu balgam›nda tüberküloz basili bulunan akci¤er tüberkülozlu hastalar› erken saptamak ve etkili bir tedavi ile iyilefltirmektir. Her ne kadar tüberküloz tan›s› için son y›llarda moleküler tan› yöntemleri gibi karmafl›k h›zl› yöntemler gelifltirilse de mikroskop ile inceleme hala en yararl› yöntem olarak karfl›m›za ç›kmaktad›r.
Mikroskopla ‹nceleme
Uygulamas›n›n kolay ve ucuz olmas›n›n, birkaç saat içerisinde sonuç elde edilmesinin yan› s›ra mikroskopla incelemenin en önemli avantaj› tüberkülozu bulaflt›ran hastalar›n çok erken saptanmas›d›r. Bu, toplumda bulafl zincirinin k›r›lmas› aç›s›ndan çok önemlidir. Ancak mikroskopla inceleme duyarl›l›¤› düflük bir yöntemdir ve tüberküloz basilinin saptanabilmesi için balgam›n mililitresinde en az 5 ila 10 bin basilin bulunmas›n› gerektirir. Örneklerin dekontaminasyon ve konsantrasyonu, duyarl›l›¤› belirgin flekilde artt›r›r. Yeni kullan›ma haz›r dekontaminasyon ve konsantrasyon kitleri bu ifllemin daha yayg›n olarak kullan›lmas›n› sa¤layabilir.
Kültür
Klinik örneklerden M. tuberculosis’in üretilmesi hem kesin tan› konmas›n› hem de antitüberküloz ilaçlara duyarl›l›k bak›lmas›n› sa¤lar. Ancak M. tuberculosis yavafl ço¤alan bir organizma oldu¤u için Löwenstein-Jensen gibi klasik kültür besiyerlerinde kolonilerin görünür hale gelmesi haftalar al›r. Besiyerlerinde üremenin erken saptanmas›n› sa¤layabilmek için birçok sistem gelifltirilmifltir. Mikrokoloni yönteminde, ince Middlebrook 7H11 agar üzerinde üreyen koloniler mikroskop ile incelenerek erken saptan›r. Genellikle bir hafta içerisinde mikrokoloniler görülebilmektedir. BACTEC 460 TB (Becton Dickinson) mikobakteri üremesini 14C iflaretli palmitik
asitin metabolize olarak 14C iflaretli CO
2oluflturmas›n› ölçerek
saptar. Sistemin en önemli dezavantaj› radyoaktif at›k üretiyor olmas›d›r ve bu nedenle yerini giderek radyoaktif maddeler kullanmayan h›zl› kültür sistemlerine b›rakmaktad›r. MGIT (mycobacteria growth indicator tube) (Becton Dickinson) ismi verilen sistemde mikobakteri üremesi tüp dibindeki bir jele kat›lm›fl floresan madde ile saptan›r. Bakteri üremesi ile O2
tüketilip CO2 oluflturuldu¤unda floresan madde indirgenir ve
ültraviyole ›fl›¤›na tutuldu¤unda floresans vermeye bafllar. ESP kültür sisteminde (ESP culture System II) (TREK Diagnostic
Systems) mikobakteri üremesi, flifle içerisindeki bas›nç de¤iflikli¤ini alg›layan bir kapak sistemi sayesinde alg›lan›r. MB/BacT kolorimetrik bir sistemdir. fiifle dibindeki jel mikobakteri üremesi ve CO2oluflturmas› ile renk de¤ifltirir. Bu
de¤ifliklik otomatik okuyucu taraf›ndan alg›lan›r. Tüm bu h›zl› kültür sistemlerinde Middlebrook besiyeri kullan›l›r. Üreme saptand›¤› zaman besiyerinden bir örnek al›p mikroskopla inceleme yapmadan üreyenin mikobakteri olup olmad›¤› saptanamaz. Son y›llarda geliflimini tamamlam›fl olan TK besiyeri (Salubris Medica) mikobakteri üremesini rengi k›rm›z›dan sar›ya dönerek gösterir. Kat› bir besiyeri oldu¤u için renk de¤iflikli¤inden sonra kolonilerin oluflmas› ve gözlenmesini de sa¤lar. Di¤er kültür besiyerlerine göre önemli bir üstünlü¤ü kontaminasyonu gerçek mikobakteri üremesinden ay›rt edebilme yetene¤idir. Mantar, Gram negatif bakteriler gibi s›kça görülen kontaminantlar üredi¤i zaman besiyerinin rengi yeflile dönerek mikroskop ile inceleme öncesinde bunun anlafl›lmas›n› sa¤lar. TK kültür sisteminin bir baflka üstünlü¤ü kültür tüplerinin göz ile rahatça de¤erlendirilebilmesi herhangibir okuyucu sisteme gereksinim duymamas›d›r. Buna karfl›n ifl yo¤unlu¤u fazla olan merkezler için tüplerin otomatik olarak inkübe edilip izlendi¤i "MyColor TK" (Salubris Technica) ad› verilen çok geliflmifl bir okuyucusu bulunmaktad›r.
Faj Ço¤altma Biyolojik Deneyi (Phage Amplified Biologically -Pha B- Assay)
Bu sistemde mikobakteriler hem M. tuberculosis hem de h›zl› üreyen mikobakterileri enfekte eden bir faj arac›l›¤› ile saptan›r. Önce fajlar klinik örne¤e eklenir. Örnekte mikobakteri varsa faj bunlar›n içerisine girer ve ortama eklenen virüs öldürücü kimyasaldan korunur. Ortamdaki serbest fajlar öldürüldükten sonra mikobakteri içerisinde korunmufl fajlar h›zl› üreyen bir mikobakteri kültüründe ço¤alt›larak faj plaklar›n›n oluflmas› sa¤lan›r. Faj plaklar›n›n varl›¤› baflta örnekte mikobakteri oldu¤unu gösterir.
Moleküler Tan›
Birçok nükleik asit ço¤altma yöntemi aras›nda halen polimeraz zinzirleme tepkimesi (PCR) ve transkripsiyona ba¤l› ço¤altma (transcription mediated amplification –TMA-) M. tuberculosis’in klinik örneklerde saptanmas› için en yayg›n olarak kullan›lan möleküler tan› yöntemleridir. Uygun koflullar sa¤lanacak olursa bu yöntemlerin özgüllü¤ü ve duyarl›l›¤› mikroskop ile incelemeden daha iyidir. Ancak hala karmafl›k ve pahal› yöntemler olduklar› ve deneyimli çal›flanlar gerektirdikleri için mikroskop ile incelemenin yerini alacak durumda de¤illerdir. Ço¤altman›n ço¤altma s›ras›nda izlenebildi¤i PCR sistemleri (real time PCR) elektroforez