DNA’s› hastalar›n periferik kan, "buffy coat", plazma ve doku örneklerinden PZR ile ço¤alt›lm›flt›r (amplifiye edilmifltir) (9). Bütün patojenik riketsiyalar için 17-kDa protein geni ana hedeftir. Citrate syntase, 16S rRNA ve OmpA genleri de amplifiye edilmifl; PZR ürünlerinin AluI ve XbaI ile "restriction fragment length polymorphism" (RFLP) analizi veya dizi analizi ile Rickettsia türleri tan›mlanm›flt›r (9).
Hücre kültür yöntemlerinin kullan›lmas› ile pek çok labora- tuvarda riketsiyalar üretilmekte ve moleküler yöntemler ile bakteriler tan›mlanmaktad›r. PZR ile genus spesifik genlerin (17-kDa protein, citrate syntase veya OmpB genleri) veya Be- nekli Atefl Grubuna (BAG) spesifik OmpA geninin amplifikas- yonu ve PZR ürünlerinin RFLP analizi veya DNA dizi analizi ile üretilen riketsiyalar tan›mlanmaktad›r (9).
BAG riketsiyalar›n say›s›, gelifltirilmifl hücre kültür yön- temleri ve moleküler yöntemler sonras›nda art›fl göstermifltir. DNA dizi analizinin kullan›m› ise bu bakteriler aralar›ndaki ge- notipik iliflkilerin araflt›r›larak filogenetik analizlerin yap›labil- mesini sa¤lam›flt›r.
KAYNAKLAR
1. Tzianabos T, Anderson BE, McDade JE. Detecton of Rickettsia rickettsii DNA in clinical specimens by using polymerase chain reaction technology. J. Clin. Microbiol 1989; 27: 2866-8.
2. Regnery RL, Spruill CL, Plikaytis BD. Genotypic identification of Rickettsiae and estimation of intraspecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes. J. Bacteriol 1991; 173: 1576-89.
3. Eremeeva M, Yu X, Raoult D. Differentiation among spotted fever group rickettsiae species by analysis of restriction fragment length polymorphism of PCR-amplified DNA. J. Clin. Microbiol 1994; 32: 803-10.
4. Williams WJ, Radulovic S, Dasch GA, et al. Identifcation of Rickettsia conorii infection by polymerase chain reaction in a soldier returning from Somalia. CID 1994; 19: 93-9.
5. Dilsiz N. Moleküler Biyoloji. Ankara: Palme Yay›nc›l›k, 2004; 61-3. 6. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G. et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin. Microbiol Infect 2004; 10: 1108- 32.
7. Fournier PE, Roux V, Raoult D. Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rOmpA. International Journal of Systemic Bacteriology 1998; 48: 839-49.
8. Raoult D, Fournier PE, Fenollar F et al. Rickettsia africae, a tick-borne pathogen in travelers to sub-saharan Africa. N Engl J Med 2001; 344: 1504-10. 9. Walker DH, Bouyer DH. Rickettsia. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington DC: ASM Press, 2003: 1005-14.
Tularemi hastal›¤›, küçük, gram negatif bir kokobasil olan Francisella tularensis bakterisi taraf›ndan oluflturulur. Tularemi etkenleri olan F.tularensis subsp.tularensis (Amerika’da s›k görülen tipi) genellikle yaz›n ve kenelere ba¤l› olarak ortaya ç›kmas›na ra¤men Avrupa’da s›k görülen F.tularensis subsp.palearctica salg›nlar› bafll›ca sonbahar ve k›fl aylar›nda ortaya ç›kar ve yay›l›m genelde kontamine su, kemiriciler ve suyla iliflkili hayvanlar arac›l›¤›yle olur. Hastal›k kene ›s›r›¤›, av eti yenmesi, hayvan ya da haflere ›s›r›¤› ile de geçifl gösterebilir (1). Tularemi epidemileri etkene göre mevsimsel özellik de göstermektedir. Türkiye’nin birçok bölgesi Tularemi yönünden endemik olarak kabul edilmektedir. Günümüze kadar Türkiye’de dokuz salg›n hakk›nda bilgi bulunmaktad›r. Bunlar Trakya (1936, 1945), Antalya (1953), Bursa (1988), Ankara (1998), Zonguldak ve çevresi (2003), Suluova (2004), Düzce (2004) ve Gölcük (2005)’de ortaya ç›kan salg›nlard›r. Bilinen erken dönem epidemilerin tan›mlanmas›nda kültür, seroloji ve hayvan inokülasyon (fare, kobay) yöntemleri, son y›llarda ise tan›mlamada serolojik testler kullan›lm›flt›r (2, 3).
Klinik Tan›
Semptomlar özgün de¤ildir. Türkiye’de s›kl›kla görülen form orofarengeal formdur ve klinik bulgular bafllang›çta influenza ya da di¤er solunum sistemi enfeksiyonlar›na benzer. Bu formda görülen servikal lenfadenit özellikle streptokokal tonsillit, enfeksiyoz mononukleoz ve tüberküloz lenfadenit ile kar›flabilir (2, 4).
Laboratuar Tan› Kültür
Enfeksiyonun kesin tan›s›nda alt›n standart olarak kabul edilmektedir. Fakat bakterinin nazl› üreme ve yüksek bulafl özelli¤i nedeniyle kolay de¤ildir. Özellikle çevresel örneklerdeki kontaminan bakteriler nedeniyle kültürde baflar› düflüktür. Laboratuar bulafl› nedeniyle Düzey III Emniyet kabininde kültür çal›flmalar›n›n yap›lmas› gereklidir.
Serolojik Tan› (ELISA ve Aglütinasyon Testleri)
Tan›da en yayg›n kullan›lan yöntemdir. Dezavantaj› antikorlar›n genellikle hastal›¤›n 2. haftas›na kadar saptanamamas› ve bazen brusella, proteus ya da yersinia cinsi bakterilerle çapraz reaksiyonlar göstermesidir.
‹mmunohistokimyasal Çal›flmalar
Referans merkezlerde yap›lan Floresan Antikor testi, Antijen saptama testleri ve ‹mmunohistokimyasal boyalarla yap›lan çal›flmalar›n s›n›rl› kullan›m alanlar› vard›r. Direkt Floresan Antikor testi h›zl› ve özgün bir testtir (duyarl›l›k s›n›r› ~106hücre/ml).
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Hasta örneklerinden (ülseratif lezyonlardan silgiçle al›nan örnek, ak›nt›, pü, lenf nodu aspiratlar› vb) PCR ile F.tularensis genomik segmentlerinin amplifikasyonu duyarl› ve özgün bir yöntemdir (5, 6). Bu yöntemin laboratuar personeli için güvenli olmas› bir di¤er avantaj›d›r.
Son y›llarda Jel-bazl› PCR sistemleri yerine DNA miktar›ndaki art›fl›n efl zamanl› olarak izlenebildi¤i Real-Time PCR teknikleri revaçtad›r. Bafll›ca Real-Time PCR teknikleri, 5’ nükleaz assay (TaqMan PCR), Hairpin problar›, Hibridizasyon temelli rezonans enerji transfer problar›, çift ipli¤e spesifik DNA boyalar›n›n kullan›lmas›na dayan›r.
TaqMan PCR (5’ nuclease assay) yönteminde primerlerin yan› s›ra bir prob (modifiye edilmifl DNA oligonükleotid) kullan›l›r. Bu prob bilinen forward ve reverse primerlerin aras›nda hedef sekansa tutunmaya (annealing) uygun seçilir. Probun 5’ ucunda reporter, 3’ ucunda ise quencher (Q) florofor bulunur. Sönümleyici (Q) florofor genellikle uzun dalga boyuna sahip renkli bir boyad›r ve reporter (R) floroforun floresans›n› durdurur. Reporter florofor genellikle k›sa dalga boyuna sahip renkli bir boyad›r. PCR ifllemi s›ras›nda denatürasyonu takiben TaqMan prob ve primerler 60°C de hedefe birlikte tutunurlar. Taq polimeraz primere dNTP’leri eklerken 5’’-3’ nükleaz aktivitesi ile karfl›laflt›¤› probu 5’ ucundan bafllayarak degrade eder. Sönümleyiciden kurtulan reporter florokromu çok daha fazla ›fl›n›r. PCR sikluslar›nda e¤er hedef DNA mevcut ise gittikçe artan oranda prob y›k›l›r ve her döngüde daha çok florofor serbest kal›r. Sonuçta ›fl›n›m gittikçe artar. Toplam enerji bilgisayar program› taraf›ndan bilinen konsantrasyonlarda eklenmifl pozitif kontrol ile oluflturulan enerjiye k›yasla say›sal veriye dönüfltürülür (7). TaqMan PCR, klasik PCR’a göre daha duyarl› ve özgün bir yöntemdir (5).
TaqMan MGB prob teknolojisine dayal› Real Time PCR metodu "Gelecek Jenerasyon TaqMan" olarak tan›mlanmaktad›r. Yeni bir s›n›f TaqMan prob olan, TaqMan MGB prob, 3’’ ucunda minor groove binder protein (MGB) ile iflaretlidir. TaqMan prob hibridize oldu¤unda MGB protein hedef sekans ile birleflen probu çift sarmal›n küçük olu¤u (minor groove) içerisine katlanarak güçlendirir. Testin daha yüksek düzeyde duyarl›l›¤› ve özgüllü¤ü, hassasiyeti, tekrarlanabilirli¤i bu geliflim sayesinde olur. Ayr›ca MGB sayesinde daha k›sa (13-18 nukleotid) prob kullan›labilir. K›sa problarda floresan veren boya (reporter) ile sönümleyiciyi (quencher) daha yak›nlafl›r. Böylece florsans›n daha etkin flekilde sönmesi sa¤lan›r (8).
PCR temelli metodlarda F. tularensis’e ait hedeflenen bafll›ca genler: tul4 (D›fl membran proteinlerini kodlar), fopA (D›fl membran proteinlerini kodlar), ISFtu2 (Multiple say›da bulunan insersiyon element benzeri bir sekans) ve 23kDa gen (Makrofaj infeksiyonunda eksprese edilen bir proteini