E. Kanun Yoluna Başvurulmasından Sonra Davadan Feragat
1. Temyiz Aşamasında
- Ácido sulfúrico, álcool metílico, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibasico, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio, sulfato de ferro heptahidratado foram adquiridos da Diadma (SP, Brasil);
- Ácido etilenodiminotetracético (EDTA) e metanol foram obtidos da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil; e São Paulo, Brasil respectivamente);
- Ácido clorídrico foram obtidos da ISOFAR Indústria e Comercio de Produtos Químicos Ltda (Duque de Caxias, RJ, Brasil);
- Ácido gálico foram comprados da CAQ Casa da Quimica Ind. E Com. (Diadma, SP, Brasil);
- Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT), riboflavina, nitrito de sódio, albumina sérica bovina e Violeta de pirocatecol foram adquiridos da Sigma-Aldrich (São Paulo, SP, Brasil);
- Cloreto de ferro e reagente Folin-Ciocalteau foram adquiridos da Merk (Darmstadt, Alemanha);
- Fenol e Molibdato de amônio sulfato de cobre, sulfato de potássio e sulfato de sódio foram adquiridos da Reagen Quimibrás Industrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
- DMEM foi adquirido da Dulbecco´s Modified Eagle Medium (Campinas, SP, Brasil). - Brain Heart Infusion Broth, Nutrient Agar e Mueller Hinton foram obtidos da HiMedia® (Mumbai, Índia);
- Ácido acético glacial P.A. e Sulfato de cobre II foram obtidos da CRB–Cromato produtos químico Ltda (São Paulo, Brasil);
- 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi obtido da FLUKA (Alemanha); - Filtro de seringa de 0,45 µm foi obtido da TPP Spritzen (Switzerland);
- Kit Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine foi obtido da BD Biosciences (San Diego, CA, USA);
- Prozima (Preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750); - Nitrato de prata foi obtido da CASA AMERICANA (Sta. Cecília – SP).
3.4.2 Equipamentos
- Agitador orbital, banho maria e estufa modelo 515 de 2013 foram adquiridos da FANEM Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
- Destilador de água MA -270 foi obtido da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil); - Balança analítica de precisão e bomba a vácuo foi obtido da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
- Espectrofotômetro foi obtido da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil); - Liofilizador - FreeZone4.5 foi obtido da Labcon;
- Medidor de pH foi obtido da PHS-3B (PHTEK, Japão);
- Espectrofotômetro de microplacas foi obtido da Epoch – BioTek (California, USA); - Sistema de purificação de água BarnsteadTM NanopureTM – DISCONTINUED
modelo 7146 e 7155. foi obtido da Thermo Scientific (California, USA);
- Zeta Plus - Zeta Potential Analyzer, ano 2012, foi obtido da Brookhaven (New York, USA);
- Fluxo Laminar foi obtido da Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil);
- Incubadora de CO2 com desinfecção UV - Modelo L212 foi obtido da LABOVEN
(TÜV – Alemanha);
- Microscópio de força atômica (Scanning Probe Microscope SPM) modelo 9700, ano 2011, da SHIMADZU (Kyoto, Japan);
- Espectrômetro FTIR- 8400S, modelo IRAffinity-1 (Shimadzu, Japão);
- Citômetro de fluxo modelo FACSCanto II, ano 2012, adquirido da BD Bioscience. 3.3 MÉTODOS
3.3.1 Extração dos Polissacarídeos 3.3.1.1. Delipidação
As algas trituradas passaram por um processo de despigmentação e delipidação como descrito por Farias (1992). Para tal, dois volumes de etanol PA foram adicionados a diferentes Beckers com as algas trituradas. Estes materiais ficaram em contato com o álcool por 24 h, a temperatura ambiente. A cada saturação do etanol, identificado visualmente, realizou-se a renovação do solvente. Após a sexta troca os pós foram separados do etanol por filtração e secados a temperatura ambiente e exposição ao sol. Obtendo-se assim pós de algas delipidados.
3.3.1.2. Proteólise
Cada amostra delipidada foi suspensa em solução salina (0,25 M) e proteolisada em pH 8 com o uso de Prozima, durante 18 h, a 60 oC. Neste processo,
ocorreu a quebra das proteínas contidas nos fragmentos de algas, a liberação e a solubilização dos polissacarídeos na solução salina. As soluções de polissacarídeos
foram separadas do material sólido por filtragem e centrifugadas a 9500 g por 15 minutos, 4 ºC como descrito anteriormente (ROCHA et al. 2005) para a obtenção do sobrenadante rico em polissacarídeos.
3.3.1.3. Precipitação de polissacarídeos
Adicionaram-se dois volumes de metanol aos sobrenadantes provenientes da centrifugação (soluções ricas em polissacarídeos), e a nova mistura foi mantida a 4 °C, por um período de 12 h. Posteriormente, as soluções foram centrifugadas a 9500 g por 15 minutos a 4 °C e os precipitados foram secos em pressão reduzida e triturados. Os polissacarídeos sulfatados de algas (ASP) foram então denominados de acordo com a alga proveniente, portanto: os polissacarídeos provenientes de S.
schröederi, D. justii e S. filipendula e D. mertensii: PS; PJ; PF; PM,
respectivamente. Para a avaliação do rendimento de obtenção dos ASP, foi estabelecido 100% para massa de alga desidratada.
3.3.2 Síntese de nanopartículas
Soluções de 10 mg/mL dos polissacarídeos (PS, PJ, PF e PM), foram adicionadas á soluções de nitrato de prata (1 mM) (em preparações separadas para cada polissacarídeo) em uma proporção de 1:9 e mantidas em repouso (DIPANKAR & MURUGAN, 2012, modificado). As absorbâncias das soluções de nanopartículas foram verificadas a cada dois dias por meio em espectofotômetro de UV-visível. Quando não ocorreu mais acréscimo de absorção, as soluções foram centrifugadas duas vezes a 11500 g por 20 minutos. Os precipitados obtidos foram liofilizados e denominados de nanopartículas de polissacarídeos sulfatados (SPN). Cada nanopartícula sintetizada com um dos polissacarídeos sulfatados de algas foi denominado de acordo com o polissacarídeo da alga utilizada, portanto nanopartículas com PS, PJ, PF e PM foram denominadas: NJ, NS, NF e NM, respectivamente. Para a avaliação do rendimento de obtenção dos SPN, foi estabelecido o valor de 100% em elação a massa de ASP.
3.3.3 Caracterização estrutural das SPN
3.3.3.1. Análise de microscopia de Força Atômica (MFA)
Imagens de MFA foram realizadas pelo microscópio Scanning Probe Microscope SPM – 9700, SHIMADZU, no Laboratório de Microscopia Eletrônica de
Varredura (LABMEV) no Departamento de Engenharia de Materiais (DEMat) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Foram feitas no mínimo 3 imagens em campos distintos. Todas as imagens foram avaliadas quanto à forma das SPN.
3.3.3.2. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Imagens de MEV foram realizadas pelo Transmission electron microscopes Penta FET® Precision – OXFORD Instruments, no Centro de Tecnologia do Gás e Energias (CTGás), Brasil, Natal, RN. Para isso, uma gota de cada solução de nanopartícula foi colocada sobre uma lamínula, este material foi seco em pressão reduzida e a lamínula foi colocada no MEV. Foram feitas no mínimo 3 imagens em campos distintos. Todas as imagens foram avaliadas quanto à forma das SPN. 3.3.3.3 Avaliação do tamanho e carga das SPN.
Medições de dispersão de luz dinâmica (DLS) e Potencial Zeta das amostras foram realizadas a 25 oC no equipamento Zeta Potential Analyzer – Brookhaven,
para a determinação do tamanho e carga superficial das SPN, respectivamente. Além disso, o tamanho das nanopartículas em DLS foi verificado uma vez ao mês durante catorze meses para verificação da estabilidade das SPN.
3.3.4 Caracterização química
3.3.4.1. Dosagem de açúcares totais presente nas amostras
A quantificação de açúcar ocorreu através do método fenol/ ácido sulfúrico (DUBOIS et al, 1956). Neste ocorre a formação do furfural, composto formado pela ligação de fenol-açúcar, com a ação desidratante do ácido sulfúrico. Devido à ligação da porção fenol, este composto adquire cor alaranjada que pode ser mensurada por leitura em espectrofotômetro á 480nm. Quanto maior a absorção, mais açúcar está presente na solução testada. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e utilizou-se fucose como padrão.
3.3.4.2. Dosagem de proteínas presente nas amostras
As dosagens de proteínas ocorreram com o uso do método de Bradford (1976). Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e as cadeias laterais básicas ou aromáticas dos aminoácidos. Esta interação promove o deslocamento do
equilíbrio do corante para a forma aniônica, que por sua vez confere uma coloração azul que pode ser monitorada através de espectrofotômetro no comprimento de 595 nm. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e utilizou-se albumina sérica bovina (BSA) como padrão.
3.3.4.3. Dosagem de compostos fenólicos presente nas amostras
As dosagens de compostos fenólicos ocorreram com do método de Athukorala, Kim & Jeon (2006). Neste, o reagente de Folin Ciocalteau é reduzido pelos compostos fenólicos e este processo promove a mudança de coloração do reagente para a cor verde, que pode ser monitorada no comprimento de onda de 765 nm pelo espectrofotômetro. Quanto maior a coloração, maior a quantidade de compostos fenólicos. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e protegido da luz. Utilizou-se ácido gálico como padrão.
3.3.4.4. Análise de infravermelho das amostras
Para as análises de infravermelho 5 mg de cada amostra foi prensada com a mesma quantidade de KBr, e o material resultante foi levado ao Espectrômetro Shimadzu FTIR-8400S. Foram realizadas 30 varreduras para cada amostra na faixa compreendida entre 400 cm-1 á 4000 cm-1 a temperatura ambiente. A correção da
linha de base ocorreu no programa IRSolution versão 1.60SU1 (Shimadzu). 3.3.5. Avaliação da atividade antioxidante das amostras
3.3.5.1. Avaliação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) das amostras
Nesse ensaio verifica-se a capacidade da amostra doar elétrons para o molibdato (VI), formando o molibdato (V). Este se associa ao fostato presente, formando o complexo fosfomolibdato. Em pH ácido este complexo adquire uma coloração esverdeada que pode ser mensurada em espectofotômetro á 695nm (PRIETO, 1999). O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e colocada em estufa á 100 oC por 90 minutos. Utilizou-se ácido gálico como padrão. A atividade foi
exposta depois de descontados a leitura dos brancos de todas as amostras.
3.3.5.2. Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) das amostras
No teste verifica-se a capacidade da amostra doar elétrons para o radical 2,2- difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (ALVES et al., 2010), com a redução do DPPH este reagente adquire a coloração amarelo pálido e a intensidade de sua coloração pode ser mensurada por espectrofotômetro em 517 nm. Quanto maior a capacidade de doar elétrons da amostra menor será a coloração. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e protegido da luz.
Vale salientar que a mudança de coloração provocada pela redução do DPPH é dependente de toda a conformação estrutural do agente antioxidante (BRAND- WILLIAMS, CUVERIER & BERSET, 1995), por isso, este ensaio é considerado pela maioria dos autores (SELLIMI et al., 2014; LIM et al., 2014; HU et al., 2010; KIM et
al., 2007) como um teste que avalia o sequestro de radicais.
3.3.5.3. Avaliação da capacidade do sequestro de íons superóxido (O2-) das
amostras
Neste teste verifica-se a capacidade da amostra sequestrar o nitroblue
tetrazolium (NBT) ativado por meio da redução fotoquímica pelo sistema Riboflavina-
Luz-NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971; DASGUPTA, 2007). Quanto menor a intensidade da coloração, menos NBT esta disponível para a ativação fotoquímica, portanto maior atividade sequestradora. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente o branco foi protegido da luz e as amostras foram submetidas à luz intensa para a ativação do NBT livre. Utilizou-se ácido gálico como padrão.
3.3.5.4. Avaliação da capacidade do sequestro de radical hidroxila (OH-) das
amostras
O potencial de sequestro do radical hidroxila pode ser simulado pelo método FeCl2/H
2O2,. Nele os radicais hidroxilas reagem com o salicilato de sódio formando o
intermediário diidroxibenzoico (DHBA), que é monitorado á 510 nm em espectrofotômetro (SMIRNOFF, 1985). Quanto menor a coloração menos radical hidroxila está disponível para a reação, assim, verifica-se maior atividade sequestradora. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e protegido da luz. Utilizou-se o ácido gálico como padrão.
3.3.5.5. Avaliação da capacidade quelante de ferro (Fe2+) das amostras
Neste teste o Fe2+ livre forma um complexo com a ferrozina, adquirindo uma
espectrofotômetro em 562 nm (BORG, 1993; WANG et al., 2008). Quanto maior a capacidade da amostra quelar o ferro, menos ele estará disponível para formação do complexo e, portanto menor será a coloração.
3.3.5.6. Avaliação da capacidade quelante de cobre (Cu2+) das amostras
Com a utilização do reagente violeta de pirocatecol, foi possível a identificação de cobre livre em solução (MEGÍAS et al., 2009). Este reagente se associa ao cobre na solução conferindo uma coloração que pode ser acompanhada por meio de um espectrofotômetro em 632 nm, quanto menor a coloração, menor a quantidade de cobre livre e maior a capacidade da amostra de capturar este íon.
3.3.6. Atividades antibacterianas.
3.3.6.1 Avaliação da Concentração inibitória mínima (MIC) das amostras
Os polissacarídeos sulfatados PS, PJ, PF e PM e as nanopartículas NS, NJ, NF e NM foram adicionados em diferentes concentrações (500, 300, 200, 100, 50 20 e 10 ug/mL, - cada concentração em triplicata -) ao meio Mueller Hinton, HiMedia® e
transferidos para microplaca de 96 poços. Em paralelo, as bactérias ativadas, que cresceram por 24 h em ágar nutriente, foram ajustadas quanto a turvação da solução em escala de Macfarland (0,5.108 UFC/mL) para conter aproximadamente 1x108
UFC/mL, e então foi retirado 10 µl dessa solução que foram adicionados aos poços da microplaca contendo amostras (concentração do inóculo por poço foi de 5x105
UFC/mL).
Para o controle positivo (poços com bactéria e antibiótico) foi utilizado antibiótico gentamicina e para o controle negativo (poços com bactéria sem antibiótico) adicionou-se somente solução salina e meio. O crescimento bacteriano foi verificado, após 24 h de incubação a 37 °C, por densidade ótica em 560 nm. MIC foi interpretado como a menor concentração, de cada amostra, que foi capaz de impedir completamente o crescimento bacteriano. A atividade foi exposta depois de descontados a leitura dos brancos de todas as amostras. Este ensaio verifica a atividade bacteriostática das amostras.
3.3.6.2 Avaliação da capacidade concentração bactericida mínima (MBC) das amostras
As soluções com diferentes concentrações de nanopartículas submetidas as bactérias por 24 h em MIC, foram semeadas em Agar nutriente (Nutrient Agar, HiMedia) e incubadas por 24 h e 48 h para verificar o crescimento bacteriano. As placas foram verificadas visualmente quanto à presença de colônias e aquelas em que não se identificou colônias foram separadas a fim de se identificar a menor concentração da amostra que promoveu morte de todas as bactérias, e essa foi intitulada de concentração bactericida mínima (MBC). Este ensaio verifica a atividade bactericida das amostras.
3.3.7. Avaliação da capacidade redutora de MTT das amostras
Para os testes, 0.5x104 células cresceram em placa de 96 poços com meio
DMEM contendo as amostras em concentrações de 0.01; 0.05; 0.1 e 1 mg/mL por 24 h (cada concentração em triplicata). A viabilidade celular foi determinada pelo teste colorimétrico de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; MOSMANN, 1983).
3.3.8. Avaliação da atividade imunomodulatória das amostras 3.3.8.1. Ensaio de produção de óxido nítrico das amostras
Células de macrófago de camundongo (RAW) foram cultivadas em placas de 24 poços (com 3x105 células/poço) com meio DMEM contendo 10% de soro fetal
bolvino (FBS) e antibióticos (estreptomicina e penicilina - 15 mg/L de meio -). Após 24 h de incubação para que houvesse a adesão celular, o meio foi removido e adicionou-se um novo meio contendo as amostras (ASP e SPN). Para o controle adicionou-se somente novo meio.
Após 24 h de permanência com as amostras, 100 µl do sobrenadante de cada triplicata, foi retirado e adicionado a 100 µl do reagente de Griess, (1% de sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico e 0,1% naphthlethylenediamine
dihydrochoride em água) em placas de 96 poços. A presença de óxido nítrico foi
evidenciado pela mudança de coloração (com a adição ao reagente) que foi acompanhada em leitor de microplaca á 540 nm. Para controle foram utilizados meios de cultura de células de macrófagos induzidos à produção de óxido nítrico (NO) por lipoproteínas (LPS) e meios de cultura de células não induzidas à produção de NO, controle positivo e negativo, respectivamente. Como padrão utilizou-se o
nitrito de sódio. Também foi realizado ensaio de MTT com células RAW incubadas com 0,001 mg/mL de cada amostra.
3.3.8.2. Ensaio de produção de citocinas por células
Macrófagos de camundongo (RAW) foram cultivadas em placas de 24 poços (com 3x105 células/poço) com meio DMEM contendo 10% de soro fetal bolvino
(FBS) e antibióticos (estreptomicina e penicilina - 15 mg/L de meio -). Após a adesão celular com 24 h o meio foi removido e adicionou-se um novo meio contendo as amostras (ASP e SPN). Para o controle adicionou-se somente novo meio. Após 24 h de permanência com as amostras o sobrenadante foi retirado para avaliação quanto a concentração de interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6), interferon- (INF- ), fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-17A (IL-17A) e interleucina-10 (IL-10), conforme o os procedimentos indicados no kit.
A determinação ocorreu por Cytometric Bead Array (CBA) Mouse
Th1/Th2/Th17 Cytokine (BD). Este kit CBA contém esferas de captura de tamanho
conhecido que estão conjugadas com um anticorpo primário específico. Quando estas esferas foram incubadas com os meios de cultura coletados, as diferentes esferas se ligaram á analítos específicos (de citocinas específicas). Por sua vez o anticorpo primário foi submetido à contato com o reagente de detecção e ligou-se a um anticorpo secundário contendo ficoeritrina (PE). A presença de PE forneceu sinal de florescência proporcionalmente a quantidade de analito ligado a cada esfera de captura, portanto permitiu a identificação de citocinas pela intencidade da fluorescência do reagente de detecção. Os ensaios foram realizados de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante e a leitura realizada em citômetro de fluxo (FACSCANTO II, BD Bioscience). O ensaio foi realizado uma única vez . 3.3.9. Análises estatísticas dos ensaios
Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Dados em triplicata foram analisados por analise de variância (ANOVA). O teste Student Newman-Keuls (p<0,05) foi utilizado para determinar diferenças significativas entre as amostras testadas usando o programa GraphPadPrism versão 5.0, 2014 (La Jolla, CA, USA).
4 RESULTADOS
4.1 RENDIMENTOS DA EXTRAÇÃO E DA SÍNTESE DAS NANOPARTÍCULAS