Com a finalidade de se melhor analizar o efeito da formação de SPN (com a utilização das ASP) nas atividades aqui analizadas, mostra-se na tabela 16, um resumo dos resultados desta dissertação.
Tabela 16-Características físico-químicas e atividades das SPN desta dissertação.
NS NJ NF NM
Rendimento V VVV VVV VV
Tamanho 108 ± 2 nm 82 ± 1 nm 288 ± 52 nm 104 ± 2 nm
Forma Esférica Esférica Esférica Esférica
Proteínas - X - X
C. fenólicos X X X X
Açucares XXX XXX XXX XXX
Potencial Zeta ~ -5 ~ -20 ~ -20 ~ -20
CAT A-A + A-A ++ A-A ++ A-A ++
DPPH A-B +++ A-B +++ A-A +++ A-B +++
O2- A-B +++ A-B +++ A-B +++ A-B +++
OH- A-B + A-B + A-B + A-B +
Fe2+
A-B +++ A-B +++ A-B +++ A-B +++
Cu2+ A-B +++ A-B ++ A-B +++ A-B +++
MTT (3T3) A-A - A-B ++ A-A - A-A + MTT (16F10) A-B ++ A-B + A-A + A-B ++ MIC E. coli A-B 300 A-B 50 A-B 50 A-B 50 MBC E. coli A-B 500 A-B 50 A-B 50 A-B 100 MIC S. aureus A-B 100 A-B 100 A-B 100 A-B 50 MBC S. aureus A-B 100 A-B 100 A-B 100 A-B 100
NO A-A - A-A - A-A * A-A *
TNF-α A-A ** A-A * A-A * A-A ** IL-6 A-C ** A-A - A-A - A-A ** IL-10 A-A ** A-A - A-A - A-A -
(V): Rendimento de 0 a 30%; (VV): Rendimento de 31 a 60 %; (VVV): Rendimento de 61 a 100%; (-): Não detectado; (+): Atividade de 1 a 30%; (++): Atividade de 31 a 60%; (+++): Atividade de 61 á 100%; (X): Composto presente de 1 a 5%; (XX): Composto presente de 5 a 40%; (XXX): Composto presente de 40 a 100%; (A-A): Formação da nanopartícula não potencializou a ação do polissacarídeo; (A-B): Formação da nanopartícula potencializou a ação do polissacarídeo; (A-C): Formação da nanopartícula diminuiu a ação do polissacarídeo; (*): Pouco estimulou a produção; (**): Estimulou muito a produção. Os valores de MIC e MBC foram exibidos em µg/ml.
5 DISCUSSÃO
O rendimento da extração dos ASP foi diferente para cada alga (Tabela 10). Este tipo de variação já foi observado por outros autores e são citados alguns fatores que fazem com isso ocorra, dentre eles o método de extração, sazonalidade e fatores ambientais (GROSSO et al., 2015). Contudo, as algas foram aqui utilizadas foram coletadas no mesmo local e na mesma época, o que exclui alguns desses fatores citados. Além disso, utilizou-se aqui o mesmo método de extração para a obtenção dos quatro ASP, o que exclui também esse fator, o que indica que esta diferença de rendimento está diretamente relacionada com a espécie da alga utilizada.
Do mesmo modo, os resultados de rendimento para os SPN também foram discrepantes, com maior rendimento para NJ e menor para NS (Tabela 10). Segundo Rodríguez-León e colaboradores (2013) esta diferença na quantidade de nanopartícula de prata obtida com cada extrato pode ser explicada pelo poder redutor de cada extrato, quanto maior o poder redutor do extrato maior a quantidade de nanopartículas obtidas. Assim, espera-se que durante o processo de formação das nanopartículas, PJ tenha sido mais capaz de reduzir a prata com relação aos demais ASP. Costa e colaboradores (2010) avaliaram o poder redutor de ASP de D.
mertensii, S. filipendula e S. schröederi, já o poder redutor de D. justii foi avaliado por
Melo e colaboradores (2013), quando se observa os dados apresentados por estes autores, verifica-se que o poder reduto decresce na seguinte ordem PJ>PF>PM>PS, o que justifica se ter obtido a maior quantidade de SPN com PJ. Não foi possível comparar os resultados de rendimento aqui apresentados com o rendimento da síntese de nanopartículas de polissacarídeos apresentados em outros trabalhos, pois de forma inexplicada estes trabalhos não apresentaram o rendimento da síntese de suas nanopartículas.
A formação das SPN com ASP foi acompanhada unicamente por espectroscopia, porque de acordo com Gurunathan e colaboradores (2013) a incidência de luz na prata reduzida presente nas nanopartículas promove a sua excitação, o que formam uma camada chamada de superfície de plasmon, o que promove o desvio da luz, e por conseguinte pode ser detectado numa faixa de comprimento que varia de 250 a 600 nm, sendo o aumento dos valores de DO na região de 403 nm apontado por Islam & Mukherjee, (2011) como indicador do aumento na quantidade de nanopartículas em suspensão, por isso esta faixa de
comprimento de onda foi utilizada para verificar o tempo necessário para a síntese de nanopartículas de polissacarídeos sulfatados de algas. Já a região menor que o comprimento de 350 nm é característico da prata livre em solução.
Vale salientar que o aumento observado na absorção de luz ao longo do tempo (Figura 3) foi semelhante a aquele relatado durante a síntese de outras nanopartículas de prata, como as sintetizadas sob agitação com o uso do polissacarídeo natural da goma da planta Cyamopsis tetragonaloba (PANDEY, GOSWAMI & NANDA, 2012) exopolissacarídeos de fungos (CHEN, YAN & WU, 2015) e polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas (El-RAFIE, El-RAFIE & ZAHRAN, 2013).
Os estudos morfológicos de todas as SPN sintetizadas aqui neste trabalho leva a observação que elas possuem forma esferica (figuras 4 e 5). Esta geometria já é conhecida para diversas nanopartículas de prata (OKAFOR, et al., 2013; GURUNATHAN, et al., 2013). Porém, nanopartículas podem ser amorfas ou assumirem diferentes formas geométricas. Entretanto, no caso das nanopartículas de polissacarídeos obtidos de diversas fontes (PANDEY, GOSWAMI & NANDA, 2012; AKMAZ et al., 2013), inclusive nanopartículas feitas com polissacarídeos sulfatados de algas (El-RAFIE, El-RAFIE & ZAHRAN, 2013), a única forma geométrica identificada ate o momento foi a forma esférica. E isso leva a proposta de que nanopartículas de prata contendo polissacarídeos assumem exclusivamente a forma esférica.
O fato das nanopartículas com polissacarídeos assumirem sempre a forma esférica é um ponto positivo, pois nanopartículas arredondas em são menos citotóxicas comparadas outras formas, como por exemplo, triangulares (PAL, TAK & SONG, 2007). Assim, espera-se que as SPN deste estudo também sejam pouco tóxicas às células.
Os ASP apresentaram diferentes tamanhos quando avaliados em DLS. Salienta-se que não foi encontrado trabalho que cite o tamanho de polissacarídeos de algas em DLS, por isso, esse é o primeiro a apresentar esse tipo de dado. O intuito original de se usar esta técnica era ter uma ideia geral do tamanho dos componentes presentes nos ASP para compará-los com os tamanhos das SPN obtidas, o que pôde ser feito. Além disso, pode-se observar que os ASP apresentaram tamanhos diferentes, o que já era esperado, pois vários autores
mostram que algas diferentes sintetizam diferentes tipos de polissacarídeos (PEREIRA, MULLOY & MOURÃO, 1999; ROCHA et al., 2005).
Ressalta-se também que não ocorreu uma correlação entre os tamanhos dos ASP com os tamanhos de suas respectivas SPN (Tabela 11). Ou seja, o tamanho do polissacarídeo sulfatado não é um fator determinante para o tamanho final das nanopartículas. As diferenças estruturais que singularizam os polissacarídeos presentes em cada ASP provavelmente influenciam nas interações destas moléculas com elas mesmas e com a prata. As interações regem as compactações e isso pode ser a explicação de porque não há correlação proporcional entre ASP e SPN.
Comparando-se os tamanhos de SPN com de outras nanopartículas de polissacarídeos da literatura, identificou-se que o tamanho de NJ foi semelhante a de nanopartículas de prata com fucanas sintetizadas por Leung, Wong & Xie (2010) que tiveram tamanho 78 nm. Já nanopartículas de prata com polissacarídeos de Chen, Yan & Wu (2015) apresentaram tamanho semelhante a NM e NS, com 120 nm.
Coradeghini e colaboradores (2013) relatam que nanopartículas muito pequenas podem apresentar grande citotoxicidade comparadas a nanopartículas maiores. Por outro lado, nanopartículas grandes não são facilmente absorvidas pelos tecidos, dificultando a ação em seu respectivo alvo (ELSABAHY & WOOLEY, 2012). Assim, de acordo com estes autores, as nanopartículas com tamanhos 20- 200 nm são particularmente indicadas para possíveis aplicações in vivo, sendo que para alguns casos, como aplicação de fármacos para o fígado, podem-se utilizar também nanopartículas com tamanhos de até 500 nm. Como as SPN encontram-se próximas a esta faixa de tamanho, espera-se que também sejam adequadas para aplicações in vivo.
Quando se observa o tamanho das nanopartículas identifica-se mais de um tipo de população (tabela 12). Os extratos apresentam diferentes polissacarídeos que variam quanto a tamanho, carga e atividades biológicas, como mostra estudo de Costa e colaboradores (2010). As interações entre cargas são o principal fator para a estruturação das nanopartícula, assim, as diferenças na composição e na quantidade ou posição das cargas, em um mesmo extrato, podem resultar em variações de tamanho das nanopartículas. Portanto em um mesmo extrato pode haver variações em polissacarídeos que resultam em variações no tamanho das nanopartículas. Porém, aqui neste trabalho, em todos os casos, há sempre uma
população de nanopartículas (com um tamanho característico) que tem uma maior quantidade de nanopartículas (predomina sobre as outras populações), o que mostra uma homogeneidade nas nanopartículas obtida aqui. Este fato não é tão comum, como por exemplo, no trabalho de El-Rafie, El-Rafie & Zahran, (2013) encontrou-se nanopartículas de prata com polissacarídeos de algas que apresentavam tamanhos tão diferentes que permitia agrupa-las em no mínimo cinco populações distintas.
Assim, o fato de se ter sintetizado uma maior quantidade de nanopartículas com tamanhos parecidos leva a ideia de há sempre um tipo de polissacarídeo sulfato que predomina dos ASP utilizados. Isso também é um fator positivo para as nanopartículas aqui sintetizadas, pois acredita-se que as atividades biológicas atribuídas as SPN seriam dependentes principalmente da nanopartícula sintetizada a partir deste polissacarídeo que se encontra em maior quantidade, o que em suma, daria maior segurança no uso das SPN.
Com relação à estabilidade (Figura 6), as SPN tiveram tamanhos constantes (não ocorrendo diferença significativa com o passar do tempo). Quanto a estabilidade de outras nanopartículas de polissacarídeos, na literatura, encontrou-se estabilidade de 25 dias para nanopartículas de prata com chitosan e fucoidan (HUANG & LI, 2014), dois meses para nanopartículas de exopolissacarídeos de fungos (CHEN, YAN & WU, 2015) três meses para nanopartículas bimetálicas de ácido gálico (MITTAL, KUMAR & BANERJEE, 2014) e seis meses para nanopartículas de prata com polissacarídeos de alga (El-RAFIE, El-RAFIE & ZAHRAN, 2013). Como não encontramos nenhum artigo que mostrasse nanopartículas de prata com polissacarídeos estáveis por mais de nove meses, acreditamos que as estabilidades das SPN são as mais extensas já descritas.
Em nanopartículas, distinguem-se duas regiões, a região interna e a externa, e a interação das nanopartículas com o ambiente ocorre a partir da camada externa, que confere a estas partículas diferentes propriedades, inclusive carga. O Potencial Zeta é uma representação numérica que aponta a unidade total de carga (potencial eletrônico) da superfície de partículas.
Com relação a caracterização da carga superficial das SPN por potencial zeta, identificou-se carga negativa (Figura 7). Também se encontra, na literatura, nanopartículas com polissacarídeos sulfatados com potencial zeta negativo. Venkatpurwar & Pokharkar (2011) sintetizaram nanopartículas de prata com
polissacarídeos de algas com potencial zeta negativo de - 35,05 mV. Estes autores indicam que os polissacarídeos sulfatados são responsáveis por esta carga. Chauvierre e colaboradores (2003) também obtiveram nanopartículas de polissacarídeos sulfatados com carga superficial negativa (em torno de – 45 mV), estes autores ainda expõem que nanopartículas com dextrana (polissacarídeo neutro) apresentaram menor carga negativa (em torno de -15 mV) comparado as nanopartículas com heparina e dextranas sulfatadas. Assim, especula-se, assim como ocorreu para Chauvierre e colaboradores (2003), que a carga negativa das SPN provavelmente esteja relacionada com a presença e exposição de grupos sulfato dos ASP.
Apesar de NS ser constituída por PS, (com grande teor de sulfato), o potencial zeta de NS foi menor que as demais SPN. Acredita-se que isso ocorreu devido a possível conformação que PS assumiu quando se associou a prata para formar a NS, o que fez com que alguns grupos sulfato de PS ficassem voltados para o interior de NS, assim não contribuirão para o valor do potencial zeta de NS. Corrobora com nossa hipótese os dados apesentados por Yang e colaboradores (2000). Estes autores verificaram que nanopartículas de prata formadas com dextranas sulfatadas apresentavam potencial zeta próximo de zero, e eles atribuem este valor a fato das dextranas assumirem uma conformação que posiciona os grupos sulfato para o interior da nanopartícula.
Quanto à relação: tamanho/potencial zeta, também não ocorreu correlação entre o tamanho e o potencial zeta das nanopartículas, corroborando com Chauvierre e colaboradores (2003), que também não encontraram relação entre massa molecular de diferentes dextranas utilizadas para a síntese de nanopartículas e os valores de potencial zeta.
Outro fator importante sobre a carga negativa das SPN e que eles podem ter sido um fator importante para a boa estabilidade durante catorze meses. Isso porque, no sistema aquoso, cargas negativas ou positivas conferidas as nanopartículas contribuem para a repulsão entre elas, impedindo sua agregação e consequentemente impedindo sua instabilidade (OSTOLSKA & WISNIEWSKA, 2014). Porém a pequena carga de NS (figura 7) não ocasionou instabilidade (figura 6), indicando que outros fatores devem estar relacionados com estabilidade desta nanopartícula.
Extratos de polissacarídeos podem apresentar diferentes níveis de contaminação com outras moléculas (proteínas, lipídeos e compostos fenólicos, por exemplo) dependendo dos procedimentos realizados para a extração do material. O teor de compostos fenólicos e proteínas, observado neste trabalho é considerado baixo comparado à quantidade de polissacarídeos (Tabela 13), e muito menor que a contaminação, de nanopartículas, por proteína detectada em trabalho de El-Rafie, El-Rafie & Zahran (2013). Esse fato pode ser explicado pela utilização de passos de retirada de contaminantes (como a proteólise) que diferem do trabalho de El-Rafie, El-Rafie & Zahran (2013).
Como também foi observado na tabela 13, ao comparar-se o teor de compostos fenólicos e teor proteico entre ASP e SPN, não se observa diferença significativa, portanto a formação de SPN a parti de ASP não ocorreu por adição destes dois componentes. Porém ao comparar-se a quantidade de açúcar entre os ASP e suas respectivas SPN, ocorre aumento significativo de açúcar em NM e NF. O aumento na quantidade de açúcar pode ser explicado porque no processo de formação destas nanopartícula, a prata provavelmente favoreceu a concentração dos componentes presentes nos extratos, incluindo açúcar.
Típicos sinais de infravermelho foram encontrados nos espectros de ASP e SPN (Tabela 14). Para todas as amostras verificou-se absorção intensa nas regiões: 3400 cm-1 e 3000 cm-1 característicos de estiramento dos grupos O-H e C-H,
respectivamente (WANG, et al., 2010), confirmando a presença de componentes orgânicos. As absorções em 1000-1100 cm-1 representam vibrações do grupo C-O-C
característico de ligações glicosídicas (TURQUOIS, et al., 1996), por isso confirma- se que a parte orgânica das ASP e SPN corresponde principalmente a polissacarídeos, corroborando com os dados obtidos para análises químicas.
A análise dos perfis de infravermelho ainda exibe absorções nas regiões 1274 cm-1, 1045 cm-1 e 810-850 cm-1, característicos de estiramento assimétrico de S=O,
deformação assimétrica de C-O-SO3 e vibração de flexão de C-O-S,
respectivamente (ALBUQUERQUE, et al., 2004; ZHANG, et al., 2008) confirmando a presença de grupamentos sulfato ligados as SPN.
O pico de absorção específico para a prata em SPN sobrepõe-se ao pico de estiramento de C-O-C na região 1078 cm-1 e não pode ser identificado
separadamente. Por outro lado, nos espectros das SPN há o surgimento de um sinal em 1400 cm-1 que é atribuído presença da prata reduzida (HE et al., 2013). Também
se observa uma diminuição da intensidade do sinal em 1274 cm-1. Este sinal é
atribuído ao alongamento assimétrico de S=O e sua diminuição indica a associação dos grupos sulfato com a prata reduzida (HE et al., 2013). Portanto, as análises de infravermelho confirmaram a ligação dos polissacarídeos a prata presente na nanopartícula.
Diversas pesquisas investigam atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados, uma destas atividades é a capacidade antioxidante. Antioxidantes podem atuar contra espécies reativas de oxigênio, com o uso de diversos mecanismos, em três principais etapas que incluem doação de elétrons; quelação de íons; e sequestro de radicais livres (MELO 2013). No intuito de verificar o efeito das SPN nestes diferentes estágios e compará-los com ASP foram realizados diferentes ensaios de atividade antioxidante.
O primeiro ensaio antioxidante verificou a capacidade das amostras doarem elétrons pelo teste de capacidade antioxidante total (CAT) (Figura 8). Para todas as quatro algas estudadas não há diferença significativa entre as CAT de ASP e as CAT de suas respectivas SPN, assim, a formação de SPN manteve a atividade encontrada para seus ASP (Figura 8). Zhang e colaboradores (2010) sugerem que CAT pode estar relacionada a presença e disponibilidade dos elétrons dos grupos hidroxila dos resíduos de açúcar. Portanto, acredita-se que as conformações assumidas pelos ASP nas nanopartículas permite a disponibilização das hidroxilas para que essas exerçam essa atividade antioxidante e por isso, as CAT das SPN foram semelhantes as seus correspondentes ASP.
Posteriormente, identificou-se a capacidade de sequestro de radicais utilizando-se diferentes testes. A partir da análise geral dos ensaios de sequestro de radicais, verificou-se que a formação de nanopartículas aumentou a eficiência dos polissacarídeos como agentes sequestradores de espécies reativas, pois foi necessária uma menor quantidade de SPN, consequentemente de polissacarídeos sulfatados, para se obter o mesmo valor de sequestro de radicais verificado com os ASP. Esse efeito de potencialização da atividade também foi observado quando nanopartículas foram feitas de chitosa-fucoidan por Huang & Li (2014), estas nanopartículas apresentaram atividade sequestradora maior do que os polissacarídeos livres. Contudo, os autores não explicam o porquê desta potencialização. Com os dados aqui apresentados, acredita-se que a potencialização das atividades avaliadas ocorreu devido ao tipo de conformação que
os polissacarídeos assumiram ao se associarem a prata durante a formação da nanopartícula, esta conformação seria mais eficiente em sequestrar radicais do que aquela assumida pelos polissacarídeos quando estão livres em solução aquosa. Espera-se que futuramente, com a obtenção de novos dados, posa-se confirmar ou não esta hipótese.
Outra estratégia para impedir o efeito maléficos de radicais hidroxila é pela ação quelante de metais (ZOU et al., 2008). Isso porque de acordo com Ueda e colaboradores (1996) os íons metálicos participam no processo de geração destes radicais. Os íons ferro e o cobre ocorrem em grande quantidade nos organismos e a neutralização de seus efeitos são de grande relevância para o funcionamento normal das células (DROUIN, et al., 1996), por isso, avaliou-se a capacidade das amostras quelarem estes íons (figuras 12 e 13). Para ambos os ensaios observou-se que ao se comparar as maiores concentrações de ASP com as maiores concentrações de SPN, estas últimas apresentaram atividade quelante significativamente maior, portanto, a formação das SPN também potencializou a atividade quelante de metais de ASP.
Sabendo-se que o efeito antioxidante pode ser potencializado ao se formar nanopartículas, buscou-se compreender melhor quais modificações estruturais seriam responsáveis por esse aumento da atividade de SPN. O principal indício de modificação estrutural apresentado aqui neste trabalho é a provável ligação da prata a grupos sulfato presente nos polissacarídeos (como sugerido a partir da interpretação dos espectros de infravermelho). Os grupos sulfatos podem ser separados em dois grupos: os que são importantes para a atividade sequestradora de radicais (SI), e os que não são (SN). Estes dois tipos de grupos sulfatos ocorrem porque segundo Wang e colaboradores (2013) a quantidade de grupos sulfato não é proporcional a atividade sequestradora de radicais. Vale a pena salientar, que um grupo SI pode ser um grupo SN, e vice e versa, dependendo da conformação que o polímero assume. Portanto, acredita-se que a ligação de grupos sulfato com a prata levou a uma modificação estrutural, que terminou expondo mais grupos SI, o que por conseguinte, aumentou a atividade sequestradora das nanopartículas. A mesma linha de pensamento pode ser utilizada para o fenômeno observado nos testes de quelação, ou seja, maior atividade das nanopartículas.
Outra característica importante das SPN é que elas apresentam uma alta estabilidade e isso pode ser importante para que a atividade antioxidante delas se
perdure por muito tempo. Já que Kong e colaboradores (2014) apontam que as nanopartículas menos estáveis se agregam mais facilmente, e por isso, diminuem a área de possível interação com radicais livres diminuindo assim sua a atividade antioxidante.
Os resultados obtidos dos ensaios de MTT utilizando células normais 3T3 incubadas com SPN (figura 14), indicam que em baixas concentrações as SPN promovem muito pouca morte celular. Isso também ocorre quando outras nanopartículas de prata com polissacarídeos são incubadas com diferentes células, como por exemplo, nanopartículas de prata com Chitosan-fucoidan sintetizadas por Huang & Li (2014) não alteraram a viabilidade celular.
Já com relação às células tumorais, observa-se que quando as SPN foram incubadas com B16F10, elas induziram uma expressiva citotoxicidade (figura 15). Um estudo com nanopartículas de prata feitas com extratos de algas mostrou que estas apresentavam índices de citotoxidade contra células HepG2, MCF-7, HeLa e Jukat (NAMVAR et al., 2014) que se assemelhavam com aqueles observados com as SPN estudadas aqui. Outro fato interessante é que a atividade citotóxica das SPN foi maior do que aquela observada com nanopartículas de prata feitas com extrato da bactéria Nocardiopsis sp. sintetizadas por Manivasagan e colaboradores (2013).