2.3. Denetim Kalitesine Yönelik Düzenleyici Çalışmalar
2.3.2. Denetim Süreci ve Kalite Araştırmaları
Uma solução padrão foi preparada como descrita no item 2.7, e foi injetada no
cromatógrafo, em cada hora, por 16 horas consecutivas. A presença de picos adicionais que
poderiam indicar a degradação de BMV ou DMA e/ou a diminuição das áreas dos picos de
BMV ou DMA foram avaliadas.
3. Resultados e discussão
3.1. Desenvolvimento do método por aQbD
O planejamento fatorial completo 3
3foi usado para o desenvolvimento do método
como uma ferramenta aQbD. Um total de 27 corridas cromatográficas foram executadas
variando-se três fatores: fluxo da fase móvel (A), a percentagem de acetonitrila (B) e o
comprimento da coluna (C) como mostrado na Figura 2.
Capítulo 3
87Figura 2. Cromatogramas de dexametasona acetato (primeiro pico à esquerda) e
betametasona valerato (segundo pico) obtidos de 27 corridas cromatográficas. Os
cromatogramas estão apresentados de acordo com o comprimento da coluna: a) 30 mm, b) 50
mm e c) 75 mm. O planejamento experimental está apresentado na tabela ao lado direito da
imagem.
Capítulo 3
88As variáveis de resposta avaliadas foram: resolução, tempo de retenção do último pico
(BMV) em cada cromatograma e fator
de cauda de BMV e DMA. Superfícies de resposta
foram ajustadas para cada variável para estudar sua dependência entre os fatores escolhidos.
Na metodologia de superfície resposta é conveniente e computacionalmente eficiente
converter os fatores a variáveis codificadas x1, x2, x3, que são geralmente definidas como
adimensionais e variáveis dentro do intervalo [-1, 1] (MASON, R.; GUNST, R.F.; HESS,
2003; MYERS, R.H.; MONTGOMERY, 2002). Os níveis codificados para cada um dos
fatores são dados pelas expressões apresentadas na Figura 3.
Figura 3. Expressões das variáveis codificadas, onde x1, x2 e x3 representam
respectivamente fatores A – fluxo; B - percentagem de acetonitrila; e C - comprimento da
coluna.
Fonte: autoria própria, 2015.
3.2. Efeito dos fatores
O modelo final para resolução, tempo de retenção, e fator de cauda expressos em
termos de fatores codificados são dados pelas equações mostradas na Figura 4.
Capítulo 3
89Figura 4. Design Space mostrando as melhores condições de: a) resolução (Rs), b) tempo de retenção do ultimo pico (RT), c) fator de cauda (Tf) DMA e d) fator de cauda (Tf) BMV, em que CL é o comprimento da coluna e ACN é acetonitrila. A cor branca representa os limites indesejados e a cor rosa representa o Design Space (DS) desejado.
Capítulo 3
90Foi observado que a taxa de fluxo teve um efeito menor sobre a resolução, quando
comparado com o comprimento da coluna e a percentagem de acetonitrila. Os gráficos de
contorno para cada comprimento da coluna para o modelo de superfície de resposta de
resolução é mostrada na Figura 4a. Na região experimental, quando o comprimento da coluna
é 75 mm, a resolução tem valores entre 5 e 12. Para o comprimento da coluna de 50 mm,
valores de resolução maiores que dois ocorrem para quase todas as regiões experimentais,
exceto quando a percentagem de acetonitrila for 75% (x2 = 0.5). Para o comprimento da
coluna de 30 mm, condições ótimas de resolução ocorreram com a percentagem de
acetonitrila de 60% (x2 = -1) em qualquer fluxo, desde que os valores de resolução sejam
maiores que 2.
De acordo com a teoria cromatográfica, em fase reversa, o fator de retenção é a
medida da hidrofobicidade relativa. Isto significa que o comportamento de retenção de
analitos ocorre em função de seu volume hidrofóbico e polaridade, e depende também da
natureza do modificador orgânico da fase móvel. Além disso, o processo cromatográfico para
um dado analito em diferentes proporções orgânico/aquoso envolve o aumento do tempo de
retenção com o aumento do número de carbonos na fase estacionária, e é correlacionado com
as propriedades físico-químicas do eluente (POOLE, 2003; SNYDER, L.R.; KIRKLAND,
J.J.; DOLAN, 2010). Estes conceitos estão de acordo com os resultados mostrados nos
gráficos de contorno para cada comprimento de coluna (Figura 4b).
O fator de cauda ou fator simétrico possuindo valor 1,0 significa completa simetria de
pico. Valores de Tf que são maiores que 1,5 podem levar à integração errada, resultando em
quantificação errônea de BMV e DMA. Os principais fatores que influenciam a simetria de
pico são: efeitos do solvente, incompatibilidade do soluto com a fase móvel ou surgimento de
um vazio na entrada da coluna, presença de grupos silanóis residuais na fase estacionária,
entre outros (POOLE, 2003; SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; DOLAN, 2010). Os gráficos
de superfície resposta para DMA e BMV correlacionados ao fator de cauda estão
apresentados nas Figuras 4c e 4d, respectivamente, onde foram delimitados os DS (de cor
rosa).
O planejamento experimental encontrou condições ótimas: comprimento da coluna de
30 mm, fluxo de 0,2 mL.min
-1e percentagem de acetonitrila de 60% na fase móvel. Nestas
condições, os valores de resolução foram mais próximos de 2,0, o fator de cauda próximo a
1,0 e o tempo de retenção do último pico foi menos que 2 minutos. Além de atender à
adequabilidade do sistema, apresentou um método com rápida corrida cromatográfica.
Capítulo 3
913.3. Estabilidade de soluções
Não foram observadas mudanças no tempo de retenção nos picos de BMV e DMA
depois de 16 horas. Da mesma forma, não foram observados picos adicionais. A redução
insignificante (cerca de 1,2%) das áreas de pico de BMV foram observadas, quando o pico
inicial (tempo zero) e a área de pico de BMV depois de 16 horas de preparação foram
comparadas. Apesar desta pequena redução no pico de BMV, a recomendação estabelecida
com esse estudo é que a injeção das soluções seja realizada o mais rápido possível após
prepará-las e deve ser usado frascos do auto-injetor com tampas para evitar a evaporação do
etanol. As áreas de pico de DMA mantiveram-se praticamente inalteradas após 16 horas de
análise.
3.4. Pré-tratamento da amostra
O maior problema encontrado na análise de fórmulas dermatológicas são as
interferências dos excipientes nestas complexas formulações, especialmente os componentes
lipofílicos. Antes da análise cromatográfica, um processo de extração é necessário para
separar adequadamente os compostos e também proteger a coluna, minimizando os danos
causados pelos interferentes da amostra, especialmente excipientes lipofílicos. O preparo de
amostra geralmente usado em analises de corticosteroides incluem extração líquido-líquido
em duplicata (KAUTSKY, 1981), extração em fase sólida (LUNN, 2005), hexano aquecido
(BRITISH PHARMACOPOEIA COMMISSION, 2011) e outros vários métodos demorados e
caros. O método escolhido neste trabalho foi melhorado e adaptado do original, o qual usa a
extração com etanol aquecido, um solvente muito menos tóxico que os usuais (KAUTSKY,
1981). Um padrão interno (IS) foi adicionado na amostra antes da análise. IS é composto de
um ou mais componentes com semelhança físico-química com os analitos de interesse,
contudo, não deve estar presente nas amostras. A área de padrão interno é usada para
normalizar as áreas dos picos de interesse, assim eliminando o efeito de diferenças em
volumes de injeção ou diluições, permitindo um método confiante e reprodutível. O método
de extração foi otimizado e mostrou uma boa recuperação pelo uso de etanol absoluto em
temperatura ambiente para amostras de creme, loção e gel. Esta extração foi simples, de baixo
custo e mais rápida quando comparada aos métodos oficiais (BRITISH PHARMACOPOEIA
COMMISSION, 2011; USP, 2011).
Capítulo 3
92
3.5 Validação do método
A validação do método foi realizada de acordo com as recomendações do ICH em
quatro tipos de matrizes placebos (creme, gel, pomada e loção). É conhecido que a técnica de
adição de padrão interno em matrizes é usada para avaliar o desempenho de um método
analítico quando testado em um tipo específico de matriz (BOUABIDI,A.; TALBI, M.;
BOUKLOUZE, A.; EL KARBANE, M.; BOURICHI, H.; EL GUEZZAR, M.; ZIEMONS,
E.; HUBERT, P.; ROZET, 2011). Este procedimento resulta no aumento da confiança na
exatidão e fundamentação dos resultados da amostra. Como proposto, o método CLUE pôde
atender a uma variedade de amostras dermatológicas de uso tópico. Além disso, o uso da
técnica de padrão interno foi escolhida para minimizar os erros no preparo de amostra e
algumas variações instrumentais. Conforme obtidos, os resultados de adequabilidade do
sistema estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Parâmetros de adequabilidade do sistema obtidos do método desenvolvido em
CLUE.
Parâmetro
Limites*
DMA
BMV
Fator de retenção
K > 2
2.16
3.83
Resolução
Rs > 2
-
2.87
Fator de cauda
Tf ≤ 1.5
1.27
1.35
Pratos teóricos
N > 2000
11357
13296
Precisão da injeção
DPR < 1%
0.03
0.01
Tempo de retenção
-
0.95
1.40
Área (mAU)
-
229141
216334
*de acordo com o FDA ; Rs = resolução; Tf = fator de cauda; N = número de pratos teóricos; DPR = desvio padrão relativo.
A seletividade e especificidade são medidas de confiabilidade das medições na
presença de outros componentes. Os testes foram realizados pela comparação de matrizes
livre de esteroides e amostras obtidas após a extração. Em seguida, a influência de
Capítulo 3
93interferentes na análise foi investigada. O comprimento de onda 254 nm foi selecionado
devido a sua boa sensibilidade para o fármaco e também por não apresentar picos
interferentes nesta região. O cromatograma da solução padrão contendo DMA e BMV
apresentou dois picos nos tempos de retenção de 0,95 e 1,40 minutos, respectivamente. O
cromatograma de BMV das amostras de gel, pomada, e loção (Figuras 5d e 5h) e amostras
placebo (Figuras 5c, 5e e 5g) mostraram um pico não identificado no tempo de retenção de
2,8 minutos. Não foram observados picos significantes nos tempos de retenção de BMV e
DMA em extrações de placebos como mostradas na Figura 5a, 5c, 5e e 5g. O índice de
similaridade foi calculado pelo detector de fotodiodos no modo de varredura completa e os
valores estão apresentados na Tabela 3. O método foi seletivo para a determinação de BMV e
do padrão interno (DMA) na presença dessas matrizes.
Figura 5. Cromatograma do creme placebo (A); creme de BMV fortificado com o padrão
interno (B); gel placebo (C); gel de BMV fortificado com o padrão interno (D); pomada
placebo (E); pomada de BMV fortificada com o padrão interno (F); loção placebo (G) e loção
de BMV fortificada com o padrão interno BMV, em que o pico 1 corresponde ao padrão
interno adicionado (DMA) e o pico 2 corresponde a BMV presente nas amostras.
Capítulo 3
94Uma série de três curvas de calibração contendo sete pontos (5 – 200 µg.mL
-1) foi
realizada para o fármaco BMV com adição do padrão interno DMA em 4 diferentes
formulações de placebo (creme, gel, loção e pomada), de acordo com as condições ótimas do
método desenvolvido. Os valores dos coeficientes de regressão linear e equações da reta estão
apresentados na Tabela 3.
A exatidão do método foi determinada adicionando quantidades já conhecidas de
soluções padrão de BMV e DMA em amostras placebo. As recuperações foram calculadas e
os resultados apresentados na Tabela 3. Os valores referem a média de 5 ensaios para cada
concentração. A precisão foi calculada de uma média de 6 determinações de amostras em
concentração nominal de 60 µg.mL
-1. Os dados precisos detalhados também constam na
Tabela 3. Os resultados apresentados estão de acordo com valores aceitáveis para a validação
de um procedimento analítico (“The International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)”, 2015). Algumas
pequenas variações em parâmetros cromatográficos foram realizadas para verificar a robustez
do método. De acordo com o ICH (ICH, 1996): ‘A robustez de um procedimento analítico é a
medida de sua capacidade de não ser afetado por pequenas, mas consideradas variações nos
parâmetros do método e fornece uma identificação de sua confiabilidade durante o uso normal
de rotina’. Os resultados de robustez foram expressos como percentagem de recuperação. O
aumento da temperatura da coluna de 30 °C para 32 °C, seguida da diminuição para 28 ºC,
não interferiu no tempo de retenção de BMV. Além disso, a variação do fluxo e do
comprimento de onda não mostraram mudanças em valores de percentagem de recuperação e
no tempo de retenção de BMV. Todos os resultados da validação estão resumidos na Tabela
3.
Capítulo 3
95Tabela 3. Resultados de validação do método desenvolvido por aQbD para determinação de betametasona valerato em CLUE.
Parâmetros de validação Creme Gel Pomada Loção
Linearidade (n = 3) r2:0.9997 y = 0.0153x + 0.0205 r2:0.9982 y = 0.0158x + 0.0196 r2:0.9992 y = 0.0152x + 0.018 r2:0.9991 y = 0.0151x + 0.0135 Especificidade, SI 0.9999 0.9996 0.9998 1.0000 % % % % Exatidão (n = 5), µg.mL-1 5 99.39 ± 1.06 100.54 ± 0.37 100.67 ± 0.31 98.89 ± 0.23 20 98.60 ± 0.70 99.85 ± 0.88 98.96 ± 0.73 98.41 ± 1.44 80 99.36 ± 0.87 100.86 ± 0.52 98.41 ± 0.96 97.82 ± 1.05 160 100.68 ± 0.51 101.13 ± 1.01 99.02 ± 0.67 99.65 ± 1.03
Area* ± DPR Area* ± DPR Area* ± DPR Area* ± DPR
Precisão (n = 6), 60 µg.mL-1 Intra-dia 0.9670 ± 1.76 0.9765 ± 2.33 0.9737 ± 1.03 0.9824 ± 0.87 Inter-dia 0.9735 ± 1.24 0.9871 ± 2.39 0.9923 ± 1.24 0.9860 ± 2.03 % RT % RT % RT % RT Robustez Fluxo (mL.min-1) 0.18 101.39 ± 0.71 1.55 100.49± 1.03 1.53 100.04 ± 0.87 1.54 102.01± 0.48 1.55 0.20 97.95 ± 0.80 1.41 102.23± 1.64 1.40 98.97 ± 0.55 1.41 97.99 ± 0.39 1.41 0.22 101.47 ± 0.57 1.27 99.29 ± 0.98 1.26 99.93 ± 0.51 1.25 100.34± 0.93 1.27 % RT % RT % RT % RT Robustez Forno da coluna (°C) 28 102.67± 0.94 1.41 101.66± 1.06 1.41 100.03± 0.30 1.42 103.38± 0.52 1.41 30 100.61± 0.78 1.40 100.08± 0.79 1.40 100.87± 1.69 1.40 101.83± 1.20 1.40 32 97.24 ± 1.21 1.38 99.04 ± 0.92 1.39 98.74 ± 0.98 1.38 97.63± 0.91 1.38 Robustez Comprimento de onda (nm) % RT % RT % RT % RT 252 97.66 ± 0.25 1.40 98.97 ± 0.81 1.40 99.06 ± 0.44 1.40 99.93± 0.76 1.40 254 99.18 ± 0.21 1.40 99.01 ± 0.70 1.40 99.94 ± 0.13 1.40 98.99± 0.88 1.40 256 103.70 ± 0.19 1.40 100.07± 0.26 1.40 101.03± 0.37 1.40 102.68± 0.76 1.40
r2 = coeficiente de correlação linear da curva “BMV area/DMA area vs. concentração”; SI = índice de similaridade; * BMV area/DMA area ; % = media do percentual de recuperação ± DPR; DPR = desvio padrão
Capítulo 3
963.6. Aplicação do método e vantagens
O método foi aplicado para análise de formulações dermatológicas de creme,
gel, pomada e loção contendo betametasona valerato a 0,1%. As amostras foram
preparadas em triplicata conforme descrito no item 2.7.2 na concentração analítica de 60
µg.mL
-1em etanol absoluto. Os resultados de teor encontrados nas formulações de
creme, gel, pomada e loção foram, respectivamente: 98,21, 99,03, 107,97 e 101,13%.
Estes resultados demonstraram claramente que o método desenvolvido se mostrou
adequado para a análise de rotina destas preparações farmacêuticas semissólidas.
Quando comparado aos compêndios oficiais (BRITISH PHARMACOPOEIA
COMMISSION, 2011; USP, 2011), este método apresentou vantagens relativas à custos
operacionais. Vários autores têm discutido sobre os benefícios do uso de CLUE em
laboratórios analíticos (ALAN XU, 2013; GUILLARME, D.; VEUTHEY, 2012;
NOVÁKOVÁ, L.; MATYSOVÁ, L.; SOLICH, 2006). Dessa forma, supondo que seja
realizada uma análise de controle de qualidade de rotina na indústria farmacêutica em
80 amostras de cremes de BMV, o método desenvolvido neste trabalho e dois métodos
oficiais, da Farmacopeia Americana e da Farmacopeia Britânica, foram comparados e
estão apresentados na Tabela 4.
Capítulo 3
97Tabela 4. Comparação entre dois métodos oficiais e o método desenvolvido neste estudo,
para determinação de BMV em amostras de creme.
CLAE (300 x 4 mm, 5 µm) ** CLAE (250 x 4.6 mm, 5 µm) *** CLUE (30 x 2 mm, 2.2 µm) ****
Tempo de corrida (min) 10 7 3
Tempo total da análise (min) 800 560 240
Tempo economizado (min) 560 320 -
Volume de injeção (µL) 10 20 1
Fluxo (mL.min-1) 1.2 1.0 0.2
*FM utilizada (mL) 960 560 48
*FM economizada (mL) 912 512 -
*FM – volume de fase móvel; ** Farmacopeia Americana; ***Farmacopeia Britanica; ****Método desenvolvido neste trabalho.