Türkiye’de medyaya karşı çocukları koruyucu önlemler

Os ensaios de imunoproteção foram realizados no laboratório de Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária da USP. Grupos de 14 hamsters Golden Syrian machos recém-desmamados (80 a 120 gramas) foram imunizados pela via subcutânea no dorso com 50 µg de proteína recombinante, dose de bacterina (controle positivo) ou PBS (controle negativo) em suspensão contendo Aldydrogel (2% Al(OH)3) na concentração final de 12%

como adjuvante.

Foram realizadas duas imunizações no intervalo de 15 dias e ao final da segunda imunização, dois animais de cada grupo foram sangrados via punção cardíaca. Os soros foram avaliados por ELISA, semelhante ao descrito para a seção 3.19.

Duas semanas após a segunda imunização, os animais foram infectados por inoculação intraperitoneal de 200 µL de cultura de L. interrogans sorovar Kennewicki cepa Pomona Fromm virulenta recém-isolada, sendo inoculadas 4 x 107 leptospiras/animal.

Os animais inoculados foram observados quanto ao aparecimento dos sintomas de leptospirose por 21 dias, e ao final deste período os sobreviventes foram sacrificados. O sangue foi coletado via punção cardíaca e o soro foi avaliado quanto à presença de anticorpos. Os rins dos animais sobreviventes foram coletados, macerados, ressuspendidos em solução salina (na diluição de 1:10 e 1:100) e cultivados em meio EMJH modificado semissólido a 28

o_{C para avaliação da presença de leptospiras após 6 semanas de observação (Figura 6).}

A análise de significância estatística foi realizada com auxilio do programa GraphPad

Figura 6 - Esquema do ensaio de desafio

Esquema da metodologia usada para o ensaio de imunoproteção.

Hamsters Bacterina + adjuvante Imunizações (dias 1 e 15) PBS + adjuvante Proteína + adjuvante Animais sangrados (punção cardíaca) Títulos de anticorpos (ELISA)

L. interrogans sorovar Kennewicki cepa Pomona Fromm

Desafio (dia 30)

Sobreviventes à infecção por leptospiras Sobreviventes sacrificados (dia 51) Animais sangrados (punção cardíaca) Títulos de anticorpos (ELISA) Rins coletados  cultura

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Análise por bioinformática

O estudo de proteínas de membrana de Leptospira spp. é importante devido ao contato íntimo que estas têm com o ambiente na qual as bactérias estão inseridas, e com as proteínas do hospedeiro, contribuindo para a sobrevivência bacteriana. Inclusive, algumas proteínas de membrana externa são reguladas de forma diferenciada nas condições in vivo e in

vitro (LO et al., 2006; MATSUNAGA et al., 2007). Dessa forma, a escolha dos genes se

baseou pela predita localização das proteínas nas leptospiras.

O gene LIC11834, segundo o programa PSORT (NAKAI; HORTON, 1999), codifica uma predita lipoproteína de membrana externa. Análise no BLAST (ALTSCHUL et al., 1990; ALTSCHUL et al., 1997) revelou a presença desta proteína nas leptospiras patogênicas já sequenciadas L. interrogans sorovar Lai (similaridade igual a 99%), L. borgpetersenii sorovar Hardjo-bovis (similaridade igual a 87%), L. licerasiae sorovar Varillal (similaridade igual a 60%), L. santarosai sorovar Shermani (similaridade igual a 34%), e 31% de similaridade com uma sequência identificada na espécie saprofítica L. biflexa sorovar Patoc (além da presença também em outras espécies, as quais ainda não apresentam seus genomas completos). Segundo o programa LipoP (JUNCKER et al., 2003), esta sequência possui peptídeo sinal de exportação entre os aminoácidos 1 e 21, e sítio spII, o qual indica lipidação. De acordo com o programa SMART, o gene LIC11834 possui domínio FecR (entre aminoácidos 60 a 162), que segundo o programa PFAM, está envolvido na regulação do transporte de dicitrato de ferro e, provavelmente, reconhece dicitrato de ferro no periplasma.

O gene LIC12253, segundo o programa PSORT (NAKAI; HORTON, 1999), codifica uma predita proteína de membrana externa. A análise do BLAST (ALTSCHUL et al., 1990; ALTSCHUL et al., 1997) revelou a presença desta proteína nas leptospiras patogênicas já sequenciadas L. interrogans sorovar Lai (similaridade igual a 100%), L. borgpetersenii sorovar Hardjo-bovis (similaridade igual a 77%), L. licerasiae sorovar Varillal (similaridade igual a 48%) e 39% de similaridade com uma sequência identificada na espécie saprofítica L.

biflexa sorovar Patoc (além da presença também em outras espécies, as quais ainda não

apresentam seus genomas completos). Segundo o programa LipoP (JUNCKER et al., 2003), possui peptídeo sinal de exportação entre os aminoácidos 1 e 20, e sítio spI. E por último, de acordo com o programa PFAM, o gene LIC12253 possui um domínio de função desconhecida entre os aminoácidos 58 e 164: DUF1566 (Protein of unknown function).

A partir das análises de similaridade pelo BLAST (ALTSCHUL et al., 1990; ALTSCHUL et al., 1997) - análises comparativas das sequências de aminoácidos preditas), foi verificado que as proteínas são altamente conservadas em diversas cepas de Leptospira, como pode ser observado claramente nos filogramas gerados pelo programa CLUSTALW2 (Figura 7A e 7B) (LARKIN et al., 2007).

Figura 7 - Filograma das sequências de aminoácidos codificadas pelos genes (A) LIC11834 e

(B) LIC12253

B

Em destaque nos filogramas estão as espécies que já possuem o genoma totalmente sequenciado.

A tabela 1 resume as principais características preditas dos genes de estudo.

Tabela 1 - Resumo das características preditas por análise de bioinformática para os genes em

estudo

Gene ID1 Descrição Sítio de

clivagem Similaridade com outras espécies já sequenciadas2 LIC11834 Lipoproteína predita 21 - 22 Lai (99%) LBH (87%) LlicsVM (60%) LSS (34%) LBP (31%) LIC12253 Proteína de membrana predita 20 - 21 Lai (100%) LBH (77%) LlicsVM (48%) LBP (39%)

Notas: Gene ID - identificação do gene no genoma. 1http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/world/lic.

2_{http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi/.}

Abreviaturas: LIC – L. interrogans sorovar Copenhageni. Lai - L. interrogans sorovar Lai. LBH - L. borgpetersenii sorovar Hardjo-bovis. LlicsVM - L. licerasiae sorovar Varillal. LSS - L. santarosai sorovar Shermani. LBP - L. biflexa sorovar Patoc.

4.2 Estudo da presença dos genes dentre diferentes cepas de Leptospira por PCR

Devido à grande variedade da composição antigênica entre os diversos sorovares de

Leptospira (LEVETT, 2001), a análise da presença dos genes é extremamente importante,

pois pode indicar expressão de possíveis antígenos candidatos para produção de uma vacina. A presença dos genes foi avaliada utilizando-se espécies patogênicas e uma saprofítica de

Leptospira. (Figura 8).

Figura 8 - Análise da presença genômica para os genes LIC11834 e LIC12253

Gel de agarose 1% apresentando (1) o gene 16S rRNA usado como controle interno, além da análise da presença dos genes (2) LIC11834 e (3) LIC12253 em espécies patogênicas (L.

interrogans, L. borgpetersenii, L. kirshnery, L. noguchi and L. santarosai) e na não

patogênica L. biflexa após PCR. O controle negativo, o qual não contém DNA, está indicado por (-).

O gene LIC12253 foi detectado em todos os sorovares testados, incluindo na espécie saprofítica L. biflexa, na qual se verifica uma banda, apesar de sua baixa intensidade, e na L.

santarosai, a qual não apresentou similaridade significativa com a sequência deste gene

encontrada na L. interrogans sorovar Copenhageni através da predição pelo BLAST.

Já o gene LIC11834 não foi detectado na L. santarosai e nem na L. biflexa, dado que pode ser explicado pela baixa similaridade destas sequências com a sequência deste gene encontrada na L. interrogans sorovar Copenhageni. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que entre ambos os genes testados mostraram-se bastante conservados nas diferentes cepas de leptospiras testadas.

4.3 Estudo da presença dos transcritos dentre diferentes cepas de Leptospira por PCR

Como já dito no item acima, a análise da conservação dos genes é importante no sentido de indicar expressão de possíveis antígenos potenciais para produção de uma vacina. A realização do ensaio de prevalência dos transcritos acaba por completar estes dados, já que, se o gene é transcrito, há grande possibilidade de haver uma tradução. Quanto maior o número de espécies que expressam esses genes, maior será o espectro de proteção deste contra diferentes leptospiras. Esta presença dos transcritos foi avaliada utilizando-se espécies patogênicas de Leptospira, além da espécie não patogênica L. biflexa sorovar Patoc (Figura 9).

Figura 9 - Análise da presença dos transcritos para os genes LIC11834 e LIC12253

Gel de agarose 1% apresentando (1) o gene 16S rRNA usado como controle interno, além da análise da presença dos transcritos (2) LIC11834 e (3) LIC12253 em espécies patogênicas (L.

interrogans, L. borgpetersenii, L. kirshnery, L. noguchi and L. santarosai) e a não patogênica L. biflexa após PCR. O controle negativo, o qual não contém DNA, está indicado por (-).

Foi verificada expressão do gene LIC12253 em todos as espécies e sorovares testados, exceto na espécie saprofítica L. biflexa, na qual não se verifica banda, apesar de ter sido detectada presença do gene nesta espécie. Este dado evidencia a presença do transcrito para o gene LIC12253 entre as diferentes espécies e sorovares. Já a expressão do gene LIC11834 foi detectada apenas nos sorovares da espécie L. interrogans, embora o gene tenha sido identificado também nas outras espécies testadas.

4.4 Amplificação das sequências genômicas para clonagem

As sequências de DNA correspondentes aos genes LIC11834 e LIC12253 foram obtidas por PCR a partir do DNA genômico de L. interrogans sorovar Copenhageni (NASCIMENTO et al., 2004a) utilizando os oligonucleotídeos descritos no Quadro 1.

As bandas de DNA obtidas através da amplificação foram analisadas em gel de agarose 1% e apresentaram os tamanhos esperados de 885 e 651 pb para os genes LIC11834 e LIC12253, respectivamente. A figura 10 demonstra os produtos obtidos da reação de PCR, os quais foram, em seguida, purificados a partir do gel de agarose.

Figura 10 - DNA de interesse amplificado através de reação de PCR

Gel de agarose 1% apresentando (marcador molecular - 1) 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) e as bandas obtidas após PCR, as quais apresentaram os tamanhos esperados. (2) LIC11834, (3) LIC12253.

4.5 Clonagem no vetor pGEM-T Easy (Promega)

O inserto de DNA obtido pela reação de PCR foi utilizado para clonagem em vetor pGEM-T Easy no sítio de clonagem existente para produtos de PCR. Este vetor é utilizado para otimizar as reações de digestão com as enzimas específicas de cada clonagem. O vetor é fornecido pelo fabricante pronto para uso, preparado a partir da digestão do pGEM-5Zf (+) com EcoR V e adição de timidinas nas extremidades 3' obtidas. Estas timidinas possibilitam a ligação de produtos de PCR, pois estes, normalmente, possuem uma adenosina em cada extremidade 3', adicionada pela atividade transferase terminal da Taq polimerase.

Após transformação em bactérias competentes e extração de DNA, os plasmídeos referentes aos clones foram digeridos com as enzimas de restrição correspondentes para certificação da presença de insertos (Figura 11).

Figura 11 - Insertos de DNA obtidos por digestão do DNA plasmidial (pGEM-T

Easy/inserto)

Gel de agarose 1% apresentado (marcador molecular – 1) 1Kb Plus DNA Ladder, (2 e 4) o pGEM-T Easy contendo inserto gene LIC11834, (3 e 5) o pGEM-T Easy digerido com as enzimas XhoI/NcoI e as bandas correspondentes ao gene LIC11834, (6 e 8) o pGEM-T Easy contendo inserto gene LIC12253, (7 e 9) e o pGEM-T Easy digerido com as enzimas XhoI/NcoI e as bandas correspondentes ao gene LIC12253.

4.6 Clonagem no vetor de expressão pAE

Os insertos correspondentes aos genes LIC11834 e LIC12253 foram removidos dos plasmídeos recombinantes (pGEM-T Easy/inserto) após digestão com as enzimas de restrição (XhoI e NcoI) e clonados no vetor de expressão em E. coli, pAE(RAMOS et al., 2004), o qual também foi digerido com as mesmas enzimas de restrição. Este foi desenvolvido para expressar a proteína recombinante contendo 6 resíduos de histidina na região N-terminal. O vetor pAE possui códon ATG de início de transcrição, gene de resistência a ampicilina e sinal de terminação de transcrição. É um sistema de alta expressão que é controlado pelo promotor do fago T7, sendo que a expressão da proteína recombinante só ocorre na presença da T7 RNA polimerase (STUDIER et al., 1990).

 pGEM-T Easy

A figura 12 mostra o cassete de expressão do vetor pAE com o códon de início (ATG), que é seguido pelas bases nitrogenadas que codificam resíduos de histidinas (CAT/CAC) e, logo após, a sequência codificadora do inserto.

Figura 12 - Cassete de expressão do vetor pAE

PT7: promotor T7. RBS: sítio de ligação ao ribossomo. ATG: códon de início da transcrição. 6xHis: seis resíduos de histidina. Inserto: presença dos genes LIC11834 ou LIC12253. T7term: região de terminação de transcrição.

Por meio da análise dos plasmídeos por fenol-clorofórmio foram selecionados os inóculos que possuíam clones positivos. Após a obtenção do DNA plasmidial (pAE/inserto) destes inóculos, os clones foram digeridos com as enzimas de restrição correspondentes para certificação da presença de inserto (Figura 13).

Figura 13 - Insertos de DNA obtidos por digestão do DNA plasmidial (pAE/inserto)

Após análise plasmidial por fenol-clorofórmio, os clones positivos foram purificados e os plasmídeos obtidos foram digeridos com as enzimas apropriadas. Gel de agarose 1% apresentado (marcador molecular – 1) 1Kb Plus DNA Ladder, (2 e 4) o pAE contendo inserto gene LIC11834, (3 e 5) o pAE digerido com as enzimas XhoI/NcoI e as bandas correspondentes ao gene LIC11834, (6 e 8) o pAE contendo inserto gene LIC12253, (7 e 9) e o pAE digerido com as enzimas XhoI/NcoI e as bandas correspondentes ao gene LIC12253.