Şiddetin üç boyutu

O método para o sequenciamento emprega o uso de 2`, 3`didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs) marcados por fluoróforos que interrompem a amplificação aleatoriamente e possibilitam a leitura automatizada através de um feixe de laser gerando um cromatograma.

Assim sendo, essa leitura revelou as sequencias de bases de nucleotídeos referente aos insertos de DNA para os genes LIC11834 e LIC12253 no vetor de expressão pAE, como pode ser visto na figura 14, na qual observa-se o início de cada sequência. A sequência codificadora no vetor de expressão pAE foi confirmada através do programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1990; ALTSCHUL et al., 1997).

Figura 14 - Cromatogramas dos sequenciamentos da região 5’ das construções (A) pAE- LIC11834 e (B) pAE-LIC12253

ATG: códon de início da transcrição. 6xHis: seis resíduos de histidina. XhoI: sítio de restrição inserido nos oligonucleotídeos de amplificação. LIC11834 e LIC12253: início de cada gene.

4.8 Avaliação da expressão das proteínas recombinantes

A E. coli é considerada um dos sistemas mais eficientes de expressão heteróloga de proteínas devido a habilidade de crescimento fácil e rápido, e ao grande conhecimento que se tem de sua genética (BANEYX, 1999). Dessa forma, para obtenção das proteínas recombinantes realizou-se um estudo de indução utilizando a cepa E. coli BL21 SI (Salt

Induced), que possui o gene T7 RNA polimerase integrado ao genoma sob o controle do

promotor proU induzível por NaCl (BHANDARI; GOWRISHANKAR, 1997).

As bactérias E. coli BL21 SI foram transformadas e cultivadas até a fase log para indução da expressão dos plasmídeos recombinantes em diferentes concentrações de indutor (3, 30 e 300 mM NaCl). Após indução, as bactérias foram lisadas por sonicação em banho de

gelo e as frações proteicas obtidas (sobrenadante e sedimento, correspondentes às frações solúveis e insolúveis, respectivamente) analisadas em gel 12% SDS-PAGE.

A proteína recombinante rLIC11834 foi expressa na forma solúvel, enquanto que a rLIC12253 foi expressa na forma insolúvel como corpúsculo de inclusão.

A figura 15 apresenta os resultados da análise de expressão das proteínas recombinantes na cepa E. coli BL21 SI, sendo possível observar rLIC11834 com massa molecular aparente de ~33 kDa presente no sobrenadante do lisado bacteriano, após indução com 300mM de NaCl, e rLIC12253 com massa molecular aparente de ~24 kDa na fração insolúvel do lisado bacteriano, após indução com 300 mM de NaCl. Essas massas moleculares apresentadas no gel estão de acordo com as massas moleculares calculadas pelo programa ProtParam (GASTEIGER, 2006) tendo como base a composição dos aminoácidos (Tabela 2).

Tabela 2 - Massa molecular e ponto isoelétrico (PI) teórico das proteínas recombinantes

Gene ID1 Massa

molecular (Da) PI teórico

LIC11834 33132.0 5.28

LIC12253 24074.7 5.25

Figura 15 - Análise da expressão das proteínas recombinantes

Gel 12% SDS-PAGE apresentando bandas das proteínas recombinantes com os tamanhos esperados de ~33 e ~24 kDa, correspondendo a (A) rLIC11834 e (B) rLIC12253, respectivamente, visualizadas por Comassie blue. (1) Massa molecular kDa. A expressão das proteínas recombinantes foi analisada em diferentes concentrações de NaCl  300 mM (2 e 3, solúvel e insolúvel, respectivamente); 30 mM (4 e 5 solúvel e insolúvel, respectivamente); 3 mM (6 e 7 solúvel e insolúvel, respectivamente). As setas indicam rLIC11834 expressa na forma solúvel (A – linha 2), e rLIC12253 expressa na forma insolúvel (B – linha 3).

4.9 Purificação e diálise das proteínas recombinantes

A purificação das proteínas recombinantes foi realizada por cromatografia de afinidade utilizando resina de afinidade a metal tratada com níquel em sua forma catiônica. Como o vetor de expressão pAE adiciona uma sequência de seis resíduos de histidina na região N-terminal da proteína recombinante, esta se liga fortemente ao níquel via anel imidazólico, ao passo que os contaminantes proteicos da cultura se ligam fracamente, sendo lavados com tampão contendo baixa concentração de imidazol. A proteína recombinante por sua vez, é eluída por meio de um tampão contendo alta concentração de imidazol.

Assim sendo, a purificação da proteína rLIC11834 foi realizada a partir do sobrenadante obtido após lise bacteriana, já que se trata de uma proteína expressa na forma solúvel. As lavagens e as frações eluídas foram analisadas por gel 12% SDS-PAGE como demonstra a figura 16.



Figura 16 - Análise da purificação da proteína recombinante rLIC11834

Gel 12% SDS-PAGE apresentando (A) as lavagens e (B) eluição da proteína recombinante. (1) Massa molecular kDa, (2) fração não induzida, (3) induzida, fração anterior à passagem na coluna, (4) fração não ligada, (L) frações das lavagens com concentrações crescentes de imidazol (5, 20, 40 e 60 mM), (E) frações eluídas com alta concentração de imidazol (1 M).

Já a proteína rLIC12253, por ser expressa sob a forma insolúvel, foi solubilizada em tampão de desnaturação e, dessa maneira, pode ser purificada, após gotejamento em solução de renaturação (para diluição da ureia, já que se trata de um desnaturante). As lavagens e as frações eluídas foram analisadas por gel 12% SDS-PAGE, como demonstra a figura 17.

Figura 17 - Análise da purificação da proteína recombinante rLIC12253

Gel 12% SDS-PAGE apresentando (A) as lavagens e (B) eluição da proteína recombinante. (1) Massa molecular kDa, (2) fração não induzida, (3) induzida, fração anterior à passagem na coluna, (4) fração não ligada, (L) frações das lavagens com concentrações crescentes de imidazol (5, 20, 40 e 60 mM), (E) frações eluídas com alta concentração de imidazol (1 M).

 

 

As alíquotas que continham as proteínas recombinantes foram dialisadas contra tampão apropriado: PBS e 0,1% Glicina. Para a proteína rLIC11834, acrescentou-se ainda 2mM PMSF, o qual inibe ação de proteases (para evitar degradação da mesma, já que após a primeira purificação desta, verificou-se pequena banda de degradação).

Após diálise, a concentração das proteínas recombinantes foi estimada através da comparação destas com concentrações pré-estabelecidas de BSA (densitometria) através do

software Carestream (Gel Logic 2200 Pro). Como esperado, bandas majoritárias de ~33 e ~24

kDa correspondentes as proteínas rLIC11834 e rLIC12253, respectivamente, foram observadas em gel 12% SDS-PAGE (Figura 18).

Figura 18 - Quantificação das proteínas recombinantes por comparação com curva de BSA

Gel 12% SDS-PAGE apresentando diferentes concentrações das proteínas recombinantes (A) rLIC11834 e (B) rLIC12253, e de BSA. (1) Massa molecular kDa, (2) 3µl da proteína recombinante, (3) 5µl da proteína recombinante, (4) 10µl da proteína recombinante, BSA em concentrações crescente (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3µg).

Após quantificação, verificou-se que a proteína recombinante rLIC11834 se encontrava na concentração de 0,6µg/µL e a proteína recombinante rLIC12253 se encontrava na concentração de 1µg/µL.

 

4.10 Análise da estrutura e estabilidade das proteínas recombinantes por espectroscopia