Çocuğun dünyasında haberin anlamı

Já foi demonstrado que os domínios kringle do PLG medeiam a interação com resíduos de lisina em receptores de diversas bactérias (LAHTEENMAKI; KUUSELA; KORHONEN, 2001). Este mesmo efeito também foi observado para as leptospiras (VIEIRA et al., 2009b). Neste sentido, avaliou-se a participação dos resíduos de lisina da Lsa33 na interação com o PLG pelo acréscimo de AAC, um derivado e análogo de lisina, à reação de ligação proteína recombinante-PLG.

Como pode ser observado na figura 32, houve redução significativa na interação da Lsa33 com o PLG pela a adição de 2 mM AAC (68%), o que sugere participação dos resíduos de lisina da proteína recombinante Lsa33 nesta interação.

Figura 32 – Inibição da interação do PLG à Lsa33 pelo AAC 0 20 40 60 80 100 120 0 2 20 AAC (mM) Ini bi çã o n a l iga çã o d a L sa 33 ao P L G pe lo A A C % Lsa33 **

A ligação da proteína recombinante Lsa33 ao PLG foi verificada na ausência (0 mM) e na presença de AAC (2 e 20 mM). Cada ponto foi realizado em triplicata e expresso como a média dos valores de absorbância a 492 nm ± o desvio padrão de cada ponto. Os dados são representativos de dois experimentos independentes. Para análise estatística, a ligação da proteína recombinante ao PLG com adição ao AAC foi avaliada por comparação com a ligação sem AAC por Student´s two tailed t test (** P <0,005).

4.18 Avaliação da atividade enzimática da plasmina

Na presença de um ativador, o PLG aderido à superfície de L. interrogans gera plasmina enzimaticamente ativa (VIEIRA et al., 2009b). Assim sendo, alguns autores mostraram este mesmo efeito através da ligação de algumas proteínas recombinantes ao PLG (MENDES et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011; SOUZA et al., 2012; VERMA et al., 2010; VIEIRA et al., 2010a). Portanto, verificou se o PLG ligado à Lsa33 gera atividade proteolítica: placas de ELISA foram adsorvidas com Lsa33 e incubadas com PLG. Adicionou- se o ativador de PLG tipo uroquinase (uPA) e o substrato cromogênico específico para avaliar a atividade da plasmina.

Como demonstrado pela figura 33, o PLG ligado à Lsa33 pode ser convertido em plasmina, como demonstrado pela atividade proteolítica da plasmina gerada. Os controles do experimento, onde um dos componentes da reação (PLG, uPA ou o substrato cromogênico) foi omitido, ou a reação empregando Lsa63, já que se trata de uma proteína que não se liga ao PLG (VIEIRA et al., 2010b), ou BSA (controles negativos), não mostraram atividade enzimática.

Figura 33 - Geração de plasmina pelo PLG ligado à Lsa33

A geração de plasmina pelo PLG ligado à Lsa33 foi avaliada indiretamente, por ELISA. A proteína imobilizada (1µg/poço) recebeu os seguintes tratamentos: plasminogênio+uPA+Substrato específico, ou controles nos quais um dos componentes foi omitido. BSA e proteína Lsa63 foram empregadas como controle negativo. As barras representam o valor médio de absorbância no comprimento de onda de 405 nm, como uma medida da clivagem do substrato, ± o desvio padrão de quatro replicatas e são representativas de dois experimentos independentes. Significância estatística em comparação ao BSA avaliada por Student´s two tailed t test (* P < 0,05). PLG: plasminogênio. uPA: ativador do PLG tipo uroquinase. S: substrato cromogênico específico para a plasmina.

Dessa forma, esse dado sugere que a proteína Lsa33 tenha um papel na patogênese e na invasão da bactéria nos tecidos, pois já foi demonstrado que vários patógenos empregam proteases do hospedeiro para degradar componentes da MEC e penetrar nos tecidos. Este sistema já foi descrito para outras espiroquetas como Borrelia spp. e T. denticola (COLEMAN; ROEMER; BENACH, 1999; LAHTEENMAKI; KUUSELA; KORHONEN, 2001).

4.19 Tratamento dos componentes glicoproteicos com metaperiodato de sódio

O papel dos carboidratos da laminina, do C4bp, e do Fg, na interação com as proteínas recombinantes foi investigado através do tratamento destes componentes com metaperiodato de sódio. Esse reagente oxida o grupamento hidroxil dos carboidratos sem prejudicar a estrutura da cadeia polipeptídica (WOODWARD et al., 1985).

Para a proteína Lsa25, a oxidação dos resíduos de carboidratos da laminina e do C4bp provocou uma redução na interação com estes componentes, efeito não verificado para a

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

PLG+uPA+S PLG+uPA PLG+S uPA+S

A b s. 4 0 5 n m Lsa33 Lsa 63 BSA *

proteína Lsa33, que também foi avaliada na ligação ao Fg e também não apresentou redução na ligação (Figura 34).

Figura 34 - Tratamento da laminina, do C4bp e do Fg com metaperiodato de sódio

Laminina (A), C4bp (B) e Fg (C) imobilizados foram tratados com metaperiodato de sódio (5 - 100 mM) durante 15 minutos a 4° C no escuro antes da interação com as proteínas Lsa33 e Lsa25. Os valores de absorbância a 492 nm ± o desvio padrão de três experimentos independentes foram comparados com aqueles obtidos com os componentes não tratados (0 mM) por Student´s two tailed t test (* P <0,05).

De acordo com os dados obtidos, os resíduos de carboidratos da laminina e do C4bp são importantes na ligação destes componentes à proteína Lsa25, mas sem completa participação neste processo.

4.20 Ensaio de inibição da formação do coágulo de fibrina

Recentemente, a proteína LigB de leptospiras foi demonstrada como ligante ao Fg, sendo capaz de inibir a formação do coágulo de fibrina e a agregação plaquetária, sugerindo que há nas leptospiras um mecanismo de regulação da coagulação sanguínea do hospedeiro, o

que poderia explicar os quadros hemorrágicos observados em casos clínicos de leptospirose (CHOY et al., 2011; LIN et al., 2011).

Assim sendo, avaliou-se a possível interferência na formação do coágulo de fibrina pela proteína Lsa33. Portanto, realizou-se um ensaio no qual o Fg solúvel pré-incubado com Lsa33 induziu a conversão para fibrina insolúvel na reação catalisada pela Tb. A formação do coágulo foi detectada pelo aumento da densidade ótica por um período de 45 minutos. Assim como ocorreu na presença da proteína LigB (CHOY et al., 2011; LIN et al., 2011), os resultados apresentados pela figura 35 mostram inibição na formação do coágulo de fibrina exercido pela presença da proteína Lsa33. Esta inibição foi estatisticamente significante já a partir de 2 minutos, com redução de 44% na formação do coágulo ao final do ensaio.

Os dados obtidos sugerem que esta proteína pode estar envolvida então na patogenicidade das leptospiras, já que, ao se ligar ao Fg, a Lsa33 provocou inibição da conversão deste componente em fibrina, interferindo no processo de coagulação e facilitando a disseminação da bactéria.

Figura 35 - Efeito da proteína recombinante Lsa33 na formação do coágulo de fibrina

induzido por trombina

Após pré-incubação do Fg (1 mg/mL) com a proteína Lsa33 (3 µM) por 2 horas a 37 ºC, adicionou-se Tb (10 U/mL) para análise da formação do coágulo, o qual foi quantificada pelo aumento da densidade ótica durante 45 minutos. Os dados são representativos de dois experimentos independentes. Cada ponto foi realizado em triplicata, e expresso como o valor médio de absorbância a 595 nm ± desvio padrão para cada ponto (A). Porcentagem da formação do coágulo de fibrina após 45 minutos. Barras representam a absorbância a 595 nm  o desvio padrão de três replicatas e são representativas de dois experimentos independentes (B). Significância estatística em relação ao controle positivo avaliada por Student´s two tailed

4.21 Ensaio de inibição da ligação das proteínas recombinantes aos componentes pela incubação destas proteínas com antissoro específico

Foi avaliada a possível inibição da interação entre as proteínas recombinantes e seus ligantes por meio da incubação das proteínas com antissoro gerado contra cada uma destas.

A pré-incubação da proteína recombinante Lsa33 com seu antissoro específico inibiu totalmente a interação entre a proteína e os componentes (Figura 36A). Este efeito inibitório da ligação exercido pela pré-incubação da proteína com seu antissoro específico também foi verificado para a proteína Lsa25 e o C4bp. Somente a interação entre a proteína Lsa25 e a laminina ainda se manteve de forma significativa mesmo após o tratamento, apesar de ter ocorrido também certo efeito inibitório considerável na ligação (Figura 36B). Estes dados sugerem que alguns epítopos antigênicos contidos nestas proteínas recombinantes estão envolvidos na interação com os componentes ou localizados próximos das regiões de interação.

Figura 36 - Efeito na ligação das proteínas recombinantes aos componentes pela incubação

destas proteínas recombinantes com antissoro específico

As proteínas recombinantes Lsa33 (A) e Lsa25 (B) foram incubadas com os antissoros específicos e então adicionadas à placa de ELISA para interação com os componentes previamente imobilizados: laminina, PLG, C4bp e Fg. A interação foi detectada pela incubação com anticorpo monoclonal anti-His conjugado com peroxidase. A média dos valores de absorbância obtidos pela ligação das proteínas previamente tratadas com antissoros específicos aos componentes foi comparada com a média dos valores de absorbância obtidos pela ligação das proteínas as quais não sofreram tal tratamento, pelo Student´s two tailed t test (* P <0,05, ** P <0,005).

4.22 Ensaio de inibição da ligação das proteínas recombinantes aos componentes por desnaturação térmica destas proteínas recombinantes

A importância da estrutura das proteínas recombinantes na interação com os componentes também foi avaliada por tratamento por fervura das mesmas para que ocorresse a desnaturação, e, então, incubação com o componente de interesse, para verificar a ligação.

Para ambas as proteínas recombinantes, houve uma redução expressiva e significativa nas interações com a laminina e com o C4bp, o que evidencia a importância estrutural das proteínas nas interações com estes componentes, ou seja, os domínios de ligação são preferencialmente conformacionais (Figuras 37A e 37B).

Verificou-se reduções significativas também nas interações entre Lsa33 e PLG e Lsa33 e Fg (Figura 37A), porém foram pouco expressivas, sugerindo que estas interações se dá principalmente por domínios lineares.

Figura 37 - Efeito na ligação das proteínas recombinantes aos componentes por desnaturação

proteica

As proteínas recombinantes Lsa33 (A) e Lsa25 (B) foram fervidas por 10 minutos e então adicionadas à placa de ELISA para interação com os componentes previamente imobilizados. A detecção da ligação foi realizada por antissoro específico contra cada proteína recombinante. As médias da ligação foram comparadas com a situação onde as recombinantes não foram aquecidas, considerada o máximo de ligação, pelo Student´s two tailed t test (* P <0,05).

4.23 Inibição da ligação das leptospiras vivas aos componentes que se ligam às proteínas