125
çük hacimde toplanması için konik dipli steril tüpler-de santrifüj edilmesi yöntemidir. Ejekülat kültür sıvısı ile dilüe edildikten sonra (1/2 vol), santrifüj (300 g’de, 10 dk) neticesinde dipte kalan pellet bozulmayacak şekilde üst sıvı yavaşça ayrılır. Pellet üzerine tekrar alınan kültür sıvısı ile (3 ml) yavaşça karıştırılır. Tek-rar santrifüj uygulandıktan sonra dipte kalan pellet 0,5 ml kültür sıvısı ile dilüe edilir. Bu metodda erkek germ hücrelerinin daha sonra yeniden suspense edilmesi ile seminal plazma ortadan kaldırılır.
Sonrasında çeşitli protokollerin uygulanarak mo-til ve morfolojik olarak normal sperm popülasyonları-nın izolasyonu gerekmektedir. Bunun için de yıkama sonrasında swim-up ve swim-down gibi yüzdürme teknikleri kullanılabilir.
2. HAREKETLİ SPERM İZOLASYONU
Yıkama işlemi sonrasında tüm hücreler hazırlanmış olmasına ragmen, önemli olanı bu hücreler içerisin-den inseminasyon için gerekli olan motil ve morfo-lojik olarak normal sperm popülasyonunun izolas-yonudur. Bu amaçla, Swim-Up ve Swim-Down gibi yüzdürme teknikleri kullanılıyor.
2.a. Swim-Up Yüzdürme Tekniği
Bu metod dünyadaki birçok IVF ünitesinde yüksek fertilizasyon oranlarıyla uygulanmakta olup, IUI ve IVF’i de içeren ART tekniklerinin hepsinde hala kulla-nılan bir yöntemdir.
Yıkama sonrasında kalan 0, 5 ml lik örnek, pipetaj yapılarak homojen bir karışım elde edilir. 1 ml kültür Koitus sonrası vajinaya bırakılan semen içindeki
sperm hücreleri önce servikal mukus tarafından sü-zülür. Sonra da fertilizasyon potansiyeli en yüksek olan spermler fertilizasyonun gerçekleşeceği fallop tüplerine ulaşır. Sperm seçme yöntemlerinde de bu süreç in vitro olarak sperm hazırlama protokolleri ile sağlanır. Bu süreç yalnızca hareketli ve potansiyel olarak verimli spermleri ayırmakla kalmaz, aynı za-manda, kapasitasyon olarak adlandırılan fizyolojik değişikliklerle, döllenme süreci için erkek germ hüc-relerini hazırlar ve etkinleştirir. Kapasitasyon süreci, sperm plazma membranının değişen akışkanlığına yol açarak sonunda akrozom reaksiyona girilmesini ve dolayısıyla oositin döllenmesini sağlar.
İyi bir sperm seçilimi için belirlenmiş kriterler şunlardır.
• Seminal plazmanın, dekapasitasyon faktörlerinin ve döküntülerin atılması
• Disfonksiyonel ve ROS üretici spermlerin elen-mesi
• Lökositlerden ve bakterilerden arındırılması
• Fonksiyonel spermlerin motilite, DNA bütünlü-ğü, akrozom tepkimesi ve normal sperm morfo-lojisi açısından zenginleştirilmesi
• Maliyet-verimli olması
• Kolay uygulanabilir ve hızlı olması
• Yüksek volümlü ejakülatlarda çalışma olanağı sağlaması
1. YIKAMA (Washing)
Uygulanan en basit yöntemdir. İlk uygulanmaya baş-layan tekniktir. Spermlerin mümkün oldukça en
kü-22
ICSI’de kullanım için, hastaların sıvılaştırılmış eja-külatları 10-15 dakika santrifüje tabi tutulur. (300 X g) ve spermi içeren yaklaşık 0,3-0,5 ml pellet hariç sü-pernatant atılır. Bu konsantre ejakülat yukarıda tarif edildiği gibi Tea-Jondet tüpler içine doldurulur ve in-kübe edilir. Bununla birlikte, ICSI’ye uygulanması için semenin santrifüjleme için ortam ile seyreltilmemesi önemlidir. Çünkü seminal plazma, halen oksidatif strese karşı en azından bir miktar koruma sağlayabi-lir. Bu yöntem, spermin işlenmesindeki en kullanış-lı yöntemlerden biridir ve genellikle çok hareketli, fonksiyonel spermlerin çok temiz bir fraksiyonuyla sonuçlanır. Özgün protokolünde çok düşük kazanım oranı göz önüne alındığında, bu yöntem daha çok kaliteli ejaküller ile sınırlıdır. Teknik, aynı zamanda geleneksel yüzmeye göre biraz daha pahalıdır ve ge-lişmiş becerileri gerektirir.
4. GLASS WOOL FİLTRELEME
Farklı bir yaklaşım kullanarak Paulson ve Polakos-ki bu yöntemle immatür spermden motil spermi ayırmayı başardı. Immotil spermlerden, atıklardan ve lökositlerden; motil spermatozoa’nın ayrılması ilkesi, sperm hücrelerinin kendiliğinden hareket eden özelliğinden değil, aynı zamanda yüzeyin filt-releme etkisinden kaynaklanabilir. Ejakülatta daha büyük parçacıkların yanı sıra parçacıkların yüzeye yapışması ile mekanik olarakta tutunum gerçek-leşmektedir. Bu yapışma ve filtrasyon işlemi, iyi bir kromatin yoğunlaşması ile olgunlaşmış çekirdek-lerle spermlerin seçilmesine katkıda bulunabilecek yöntemdir.
Grunewald ve arkadaşları son zamanlarda sistem yüzeyine Anneksin V’i bağlamak için kimyasal olarak aktive olan bir sistem geliştirdi. Annexin V, fosfatidil serin ve apoptotik hücrelerin bir göstergesi ile bağ-lanır. Geleneksel glass wood filtrelemesi, birçok IVF merkezinde rutin olarak kullanılırken, bu yeni mole-küler aktif yüzey etkinliğini destekleyen klinik veriler çalışılmaya devam edilmektedir.
Prensip olarak bu metod, motilitesi iyi olan spermatozoa’nın iyileştirilmesine neden olan, uygu-lanması kolay bir yöntemdir. Tüm ejakülat filtrelendi-ğinden, oligozoospermi olan hastalardaki ejakülatlar işlenebilir. Buna ek olarak, teknik olarak semeni kir-leten lökositlerin%90’ını elimine eder ve bu nedenle ROS’u önemli ölçüde azaltır. Bir dezavantaj olarak, yüzme prosedürünün yaptığı gibi, filtrasyonun temiz fraksiyonlar olarak sonuçlanmadığı gözlemlenmiştir.
Örgüden geçebilecek her zaman atık veya immotil spermler de vardır.
sıvısı bu karışıma ilave edilerek 2 katmanlı bir yapı oluşturulmalıdır. Bu iki katmanın karıştırılmaması yöntemin başarısı açısından önemlidir. Hazırlanan sı-vıdaki, spermlerin yüzebileceği alanı sağlamak ama-cıyla, konik dipli tüpe 45°’lik eğim verilerek, %5’lik CO2 oranına sahip inkübatörde 1 saat bekletilir. Bu inkübasyon periyodundan sonra peleti bozmadan yavaşça üst sıvının ¾’ü alınır.
İdeal olarak, bu teknik ile %90 hareketliliğe sahip sperm fraksiyonları elde edilebilir.
2.b. Swim-Down Yüzdürme Tekniği
Bu metodta bu kez konik tüpler içerisine konulmuş 1 ml’lik kültür sıvısı üzerine, semen örneği katmanlan-dırılıp inkübe edilir ve dipte kalan sıvının ¾’ü alınır.
Yüzdürme metodları, total motil sayısı düşükse ve/veya morfoloji %5’in altındaysa başarılı olamaz-lar. Yüzme sonrasında izole edilen sperm fraksiyo-nunun 0,5 ml’den fazla olmadığı durumlarda uterus içine verilmesi önemlidir. Ejakülatların kalitesiyle il-gili olarak, geleneksel yüzme tekniği, yüksek sperm konsantrasyonuna ve iyi hareketliliğe sahip kaliteli ejakülatlar ile sınırlıdır. Bu yöntemlerin verimi düşük-tür. Bunun yanı sıra, santrifüj esnasında hücrelerin yakın temasından dolayı, spermin, ROS tarafından tahrip olabileceğini de bilmeliyiz. Erkek genital sis-temi enfeksiyonu olan hastalarda bu durum özellikle geçerlidir.
3. MİGRASYON – SEDİMENTASYON
Diğer yöntemlere göre daha kompleks bir teknik-tir. Swim-Up tekniğindeki gibi sperm hücrelerinin, kendi motilitesine bağlıdır. Ancak sedimentasyon (çökelme) adımı ile de kombine edilmiştir. Gelenek-sel yüzme yönteminin aksine, sperm sıvılaştırılmış sperm örneğinden, doğrudan süpernatant ortamı-na kadar yüzer ve tortu, çökelti tüpün iç konisine birikir. Ticari ismi “Tea-Jones tubes” olarak bilinen özel tüpler kullanılmaktadır. Bu tüplere 1-2 ml ka-dar serum eklenmiş IVF solüsyonundan konulur.
Ardından 0, 5 ml sıvılaştırılmış olan sperm, koninin çevresindeki dış halkaya, iç koninin içine herhangi bir boşluğun girmediğine dikkat edilerek yerleştiri-lir. 37 °C’de 1-2 saat kadar tüp, inkübasyona bırakılır.
İç koninin içindeki ortamı içeren süpernatant orta-mı, boşluğun kalıntılarını aspire etmeden, pastör pipetle dikkatlice çekilir. Bu yöntemle tipik olarak,
%90’dan fazla motilite oranlarına sahip sperm frak-siyonları elde edilebilir ve doğrudan inseminasyon için kullanılabilirler.
BÖLÜM 22 • Sperm Seçme Yöntemleri 127 man konsantrasyon aralığı %72 ile 95 arasında de-nenerek eşik aralığı olarak %80 olarak bulunmuştur.
Santrifüj hızı 300Xg olarak uygulanmaktadır.
Degradeyi aşırı miktarda fazla hacimle veya fazla sayıda parçacıkla yüklemek yetersiz sperm ayrılma-sına neden olur. Öte yandan, oligozoospermi veya astenozoospermi vakalarında, dölleme için yetkin bir sperm elde etmek için birden fazla test tüpü ha-zırlanabilir.
Tekniğin bir diğer avantajı; lökositleri büyük oran-da ortaoran-dan kaldırıldığı göz önüne alındığınoran-da, ROS önemli ölçüde azaltılmış olur.
5. YOĞUNLUK-GRADİENT UYGULAMALARI En sık kullanılan yöntemdir. Bu teknikte Percoll, Al-bumin, Nycodenz, Ficoll ve sükroz polimerleri gibi malzemelerin kullanılmasıyla gradientler oluşturu-lup, sperm hücrelerinin santrifüj yardımı ile bu sıvı kolondan süzdürülmesidir. Özellikle suboptimal sperm örneklerinde tercih edilir.
Bu uygulamalarda 2 katman kullanılmaktadır.
Normal ve fonksiyonel olan spermler, daha yoğun oldukları için alt katman daha yüksek konsantras-yonlarda tutulmalıdır. Yapılan çalışmalarda alt