91
lanılmaya başlamıştır (ülkemizde olduğu gibi). Artık dünyada birçok meslektaşımız bu uygulamanın ru-tinden kaldırılıp sadece gerekli olduğu durumlarda ICSI uygulanması gerektiğini savunmaktadır. Bunun altında yatan sebep ise ICSI uygulamasının konje-nital doğum defektlerinde artış (2) ve imprinting bozuklukları (3) ihtimaliyle ilişkilendirilmiş olmasın-dandır. Daha da kaygılandırıcı olan ise, Avrupa’daki tüm YÜT tedavilerinin %66’dan fazlasında ICSI tercih edilmektedir (4). Amerika’da ICSI %65.6, Avustralya ve Yeni Zelanda’da ise %72.9 oranında YÜT tedavi-lerinde ICSI tercih edilmektedir (4). Fakat, şaşırtıcı bir şekilde ICSI kullanımda yıllar içerisindeki bu artış male faktör tanısından bağımsız bir şekilde gerçek-leşmiştir (5). Ülkemizde de neredeyse tüm YÜT teda-vilerinde ICSI kullanıldığını düşünürsek male faktör tanısının dikkate alınmadığını anlamamız mümkün-dür. Bu durumun önüne geçilebilmesi için kilit nok-ta, sperm fonksiyonlarının doğru ve tutarlı bir şekil-de ölçebilecek testler geliştirilmesidir.
Dünya sağlık örgütü sperm fonksiyon testlerini deneysel olarak değerlendirmektedir. Bu testler ilk zamanlarda gebeliğin oluşmasından ziyade fertili-zasyonun prognozunda kullanılmaktaydı fakat gün-cel bilgiler bu fonksiyonların canlı doğum oranları üzerinde de etkili olduğunu söylemektedir.
Sperm Fonksiyon Testleri
Memeli spermleri ejekülasyondan hemen sonra oo-sitleri dölleme yetisine sahip değildirler. Bu dölleme kapasitesine ulaşmaları için kadın üreme kanalında Amaç
Literatürde detaylı araştırma konusu olan ve özellik-le ICSI kullanılması sınırlı olan ülkeözellik-lerde son derece önem verilen sperm fonksiyonlarının ölçülmesi ve fertilizasyon potansiyelinin değerlendirilmesi için kullanılan testler aktarılacak ve limitasyonları belir-tilecektir. Mümkün olduğu kadar pratik uygulamaya yönelik olacak bu derlemede testlerin nasıl yapılacağı da yalın bir dille aktarılacaktır.
Giriş
İnfertilite tanısında ve prognozunda semen anali-zi kilit bir öneme sahiptir. Fakat, hem doğal yollar-la gebelik prognozunda hem de YÜT tedavilerinde semen analizinin prognostik değeri oldukça dü-şüktür (1). Dolayısıyla, semen analizini genişleterek ve sperm fonksiyonlarını daha detaylı araştırmakla spontan veya YÜT gebelik prognozuna başarılı bir şekilde ulaşmak özellikle geçtiğimiz yıllarda daha da önem kazanmıştır. Androloji laboratuvarında rutin semen analizine ek olarak sperm fonsiyon testlerinin kullanımıyla klinisyenlerin uygun tedavi belirlemesi ve gebelik öngörüsünün daha verimli bir şekilde ya-pılabileceği öngörülmektedir.
1992 yılında ICSI tekniğinin gelişmesi ile birlikte rutin IVF inseminasyonuna alternatif olarak erkek faktör infertilite vakalarında daha yüksek döllenme oranı ve daha yüksek gebelik oranı elde edilebil-mektedir. Fakat, günümüzde ICSI artık sadece erkek faktör infertilite tedavisinde değil de rutin olarak
kul-13
belli bir süre geçirmeleri gerekmektedir. Neredeyse 70 yıl önce iki farklı ve bağımsız deney ile gösteril-miştir ki tavşan spermleri, fallop tüplerindeki yumur-ta hücrelerini ancak dişi üreme kanalında belirli bir süre geçirdikten sonra fertilize edilebilmektir (6, 7).
Sperm hücreleri kadın üreme kanalında belirli bir süre geçirmesiyle birlikte sperm hücrelerinde son derece komplike fiziksel ve biyokimyasal değişimler gerçekleşir ve bu süreç sperm kapasitasyonu olarak adlandırılır. Sperm kapasitasyonunun birincil belir-teçleri membran lipid organizasyonları, iyon kanalla-rındaki aktivite değişiklikleri ve membran potansiye-lindeki değişiklik, akrozom reaksiyonu ve hiperaktif sperm hareketliliği için gerekli proteinlerdeki tyrosin fosforilasyonunda artıştır. Sonuç olarak, sperm kapa-sitasyonu tüm sperm fonksiyon testlerinin merkezin-de yer alır ve sperm fonksiyon testlerinin neremerkezin-deyse tümü sperm hücreleri kapasite edildikten sonra ya-pılmalıdır. Aksi taktirde sonuçlar yanıltıcı olacaktır.
a. Servikal mukus penetrasyonu ve hareketlilik
Bilindiği üzere sperm hücreleri sadece hareketli değillerdir ve farklı anlarda farklı hareketlilik çeşit-leri gösterebilirler (bkz. Aktif hareketlilik, progresif hareketlilik, hiperaktif hareketlilik). Sperm kalite kriterleri servikal mukus penetrasyon indeksi ile ko-relasyon içerisindedir ve özellikle sperm hareketlilik parametrelerinde “average path velocity (ortalama sperm yolu hızı)”, “straightness (düzlük)” ve “ampli-tude of lateral head displacement (lateral baş salın-ma amplitüdü)” özellikle mukus penetrasyonu için önemli bulunmuştur (9-11). Daha da önemlisi ise insan ve hayvan spermlerinin servikal mukus pe-netrasyon oranları, hem in vitro fertilizasyon oran-ları hem de in vivo gebelik oranoran-ları ile pozitif olarak ilişkili bulunmuştur (12-15). Kaliteli ve fonksiyonu ispatlanmış insan servikal mukus tedarikinin zor olacağından dolayı alternatif viskoz sıvılarla yapı-lan çalışmalar da yine servikal mukus çalışmaları ile benzer sonuçlar ortaya koymuştur (16). Bu konuda şüphesiz en yaygın kullanılan yapay servikal mukus olan metilselüloz ile yapılan Kremer penetrasyon testidir.
Bu testte kültür medyumuna eklenen 10mg/ml metilselüloz viskozite olarak 4000cp (MC4000)’lik bir oran vermekte ve bu oran fertil periyodda servi-kal mukus yoğunluğuna eşdeğer bir yoğunluk ver-mektedir. Yoğunlaştırılmış kültür medyumu sonra-sında ise düzleştirilmiş kapiler tüplere yüklendikten sonra yaklaşık 30x106/ml sperm süspansiyonlarına
daldırılmaktadır. Yaklaşık 2 saatlik inkübasyon son-rası ışık mikroskopu altında kapiler tüpün 1 cm’lik ve 2 cm’lik kısımlarına penetre olmuş spermler sayılır ve sonuçlar WHO öneri değerlerine göre değerlen-dirilir.
Kremer penetrasyon testinin yapay mukus ile kullanılması hem kullanılacak viskoz sıvının standar-dize edilmesi hem de sürekli el altında olabilecek bir çözüm olmasından dolayı ve de klinik parametreler ile korelasyon içerisinde olduğundan dolayı basit ve efektif bir sperm fonksiyon testidir.
b. Hiperaktif Hareketlilik
Sperm hücrelerinin hiperaktif hareketlilik şekli ilk olarak 1970 yılında Yanagimachi ve arkadaşları ta-rafından tanımlanmıştır (17). Bu hareketlilik şekli sperm fl agellasının asimetrik bir şekilde bükülme-siyle elde edilir ve sperm hücrelerinin itişinde artış sağlar. Hiperaktif hareketlilik böylelikle viskoz mat-rixlere (servikal mukus, kümülüs matrix vb) penet-rasyonu sağlar. Dolayısıyla, bu hareketlilik biçimi IVF inseminasyonu göz önüne alındığında sperm hücrelerinin en önemli fonksiyonudur (18). Yapılan çalışmalarla sperm hiperaktivasyonunun hem bazal hem de uyarılmış şekilleri IVF inseminasyon siklusla-rında fertlizasyon oranları ile pozitif olarak ilişkilen-dirilmiştir (19, 20).
Hiperaktif sperm hareketliliği etkin şekilde “Com-puter Assissted Sperm Analyzer (CASA)” sistemleri ta-rafından kantifiye edilebilir. Kantifikasyona ulaşmal için sperm gezingeleri CASA sisteminin kamerası tarafında saniyede 60 kare alacak şekilde minimum 0.5 saniye boyunca kaydedilir ve sperm başının iz-lediği gezingeler her karede belirlenilir. Hiperaktif sperm hareketliliği kriterine uyan spermler (VCL
≥ 150 μm/s, linearity ≤ 50%, and ALH ≥ 7, bkz 21).
Dünyaca kabul edilen bir cut-off değeri olmamakla birlikte %15’ oranında spontan hiperaktivasyon nor-mal değer sayılmaktadır.
Anlaşılacağı üzere hiperaktif sperm hareketliliği-ni ölçebilmek CASA sistemi olmadan oldukça zah-metli ve verimsiz bir metottur.
c. Akrozom reaksiyonu
Sperm hücrelerinin zona pelusida ile temasa geç-tiğinde akrozom reaksiyonu tetiklenir ve akrozom içerisindeki proteolitik enzimler dışarıya salınır ve zona pelusida penetrasyonuna hiperaktif sperm hareketliliği ile birlikte yardımcı olur. Dahası sperm akrozom membranının ortadan kalkması ile sperm
BÖLÜM 13 • Sperm Fonksiyon Testleri 93 hücreleri oosit ile birleşme için tekrardan
modellen-miş olur. Sperm akrozom reaksiyonu Pisum Sativum Agglutinin ve benzeri akrozomal boyalar kullanılarak tanımlanabir. Fakat, akrozom reaksiyonu testlerinin en büyük sıkıntısı spontan olarak sadece %4 sperm hücresinde akrozom reaksiyonu görülür. Dolayısıy-la, akrozom reaksiyon potansiyelini ölçebilmek için A23187 (kalsiyum iyonofor), yüksek konsantrasyona projesteron gibi sperm akrozom tetikleyicileri kulla-nılabilir. Bu akrozom reaksiyonu tetikleyici ajanlarla birlikte kullanıldığında insan spermi üzerinde yapı-lan in vitro deneylerde gösterilmiştir ki akrozom re-aksiyonu potansiyeli fertilizasyon oranlarıyla pozitif olarak ilişkilidir (22). Fakat yine de en optimal ajan insan zona pelusida proteinleri olacaktır ki temini son derece zordur.
d. Hyaluronik Asit Bağlanma Testi
Akrozomu mevcut olan matür sperm hücrelerinin, hyaluronik asit moleküllerine bağlandığı bilinmek-tedir. Bu bağlanmayı sadece matürasyonunu tam olarak tamamlamış ve spesifik reseptöre sahip olan sperm hücreleri yapabilir (23, 24). Hyaluronik asit bağlanma testi sonuçları fertilizasyon oranları ile ilişkili olduğu gibi sperm DNA fragmantasyonu ile de ilişkilidir. Yapılan çalışmalar hyaluronik asit bağ-lanma kapasitesinin abortus oranları ile de alakalı olduğunu işaret etmektedir (25). Daha da önemlisi ise hyaluronik asit bağlanma kapasitesi diğer rutin semen analizi parametreleri ile herhangi bir korelas-yonu bulunmamasıdır. Dolayısıyla bu test nispeten daha kolay standardize edilebileceğinden basit ve etkili bir şekilde klinik pratiğe geçebilir (bağlanma oranları sıcaklık ile ilişkilidir ve sıcaklık kalibrasyonu doğru yapılmalıdır).
Sonuç
Sperm hücrelerinin yumurtayı dölleyebilmesini efektif ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülebilmesini sağlayan ve standardize edilmiş sperm fonksiyon testlerine ihtiyaç vardır. Anlaşılacağı gibi yukarıda tarif edilmiş sperm fonksiyon testlerinin tümünün standardizasyona ihtiyacı vardır ve WHO tarafından deneysel testler olarak adlandırılmaktadırlar. Fakat, literatür bilgilerinden de görüleceği gibi fonksiyon testleri sperm hücrelerinin birincil görevi olan ferti-lizasyonu başarılı bir şekilde ölçebilmektedirler. Yine de unutulmamalıdır ki rutin semen analizi halen kilit bir öneme sahiptir.
KAYNAKLAR
1. Weber RF, Dohle GR, Romijn JC. Clinical laboratory evaluation of male sub- fertility. Adv Clin Chem 2005;40:317–64.
2. Davies MJ, Moore VM, Willson KJ, Essen VP, Priest K, Scott H, Haan EA, and Chan A (2012) Reproductive technologies and the risk of birth defects. N Engl J Med 366: 1803-1813.
3. Cox GF, Burger J, Lip V, Mau UA, Sperling K, Wu BL and Hors-themke B (2002) Intracytoplasmic sperm injection may increa-se the risk of imprinting defects. Am. J. Hum. Genet. 71:162-164.
4. Ferraretti AP, Goossens V, Kupka M, Bhattacharya S, de Mo-uzon J, Castilla JA, Erb K, Korsak V and Nyboe Andersen A (2013) Assissted reproductive technology in Europe, 2009: re-sults generated from European registers by ESHRE. Hum. Rep-rod. 28: 2318-2331.
5. Jain T and Gupta R S (2007) Trends in the use of ICSI in the USA. N Engl J Med 357: 251-257.
6. Chang MC (1951) Fertilizing capacity of spermatozoa deposi-ted into the fallopian tubes. Nature 168: 697-698.
7. Austin CR (1951) Observations on the penetration of the sperm in mammalian egg. Aust. J. Sci. Res. (B)4: 581-596
8. Visconti PE, Krapf D, Vega-Baltran JLV, Acevedo JJ and Dars-zon A (2011) Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian J. Androl. 13: 395-405.
9. Aitken, R. J., Sutton, M., Warner, P. & Richardson, D. W. (1985) Relationship between the movement characteristics of human spermatozoa and their ability to penetrate cervical mucus and zona-free hamster oocytes. Journal of Reproduc- tion and Fer-tility, 73, 441–449.
10. Jeulin, C., Feneux, D., Serres, C., Jouannet, P., Guillet-Rosso, F., Belaisch-Allart, J., Frydman, R. & Testart, J. (1986) Sperm fac-tors related to failure of human in-vitro fertiliza- tion. Journal of Reproduction and Fertility 76, 735–744.
11. Mortimer, D., Pandya, I. J. & Sawers, R. S. (1986) Relationship between human sperm motility characteristics and sperm pe-netration into human cervical mucus in-vitro. Journal of Rep-roduction and Fertility 78, 93–102.
12. Sharara, F. I., Illions, E. H., Coddington, C. C., 3rd & Scott, R. T., Jr. (1995) Evaluation of the Tru-Trax cervical mucus penetrati-on test in predicting fertilizatipenetrati-on and pregnancy rates in in-vitro fertilization. Human Reproduction 10, 1481– 1485.
13. Eggert-Kruse, W., Leinhos, G., Gerhard, I., Tilgen, W. & Runne-baum, B. (1989) Prognostic value of in vitro sperm penetration into hormonally standardized human cervical mucus. Fertility and Sterility 51, 317–323.
14. Beltsos, A. N., Fisher, S., Uhler, M. L., Clegg, E. D. & Zinaman, M. (1996) Th e relationship of the postcoital test and semen cha-racteristics to pregnancy rates in 200 presumed fertile couples.
International Journal of Fertility and Menopausal Studies 41, 405–411.
15. Hull, M. G. R., Savage, P. E. & Bromham, D. R. (1982) Prog- nostic value of the postcoital test: prospective study based on time-specific conception rates. British Journal of Obste- trics and Gynaecology 89, 299–305.
16. Aitken, R. J., Bowie, H., Buckingham, D., Harkiss, D., Richard- son, D. W. & West, K. M. (1992) Sperm penetration into a hya-luronic acid polymer as a means of monitoring func- tional competence. Journal of Andrology 13, 44–54.
17. Yanagimachi R. (1970). Th e movement of golden hamster sper-matozoa before and aft er capacitation. J. Reprod. Fertil 23: 193-196
18. Sukcharoen, N., Keith, J., Irvine, D. S. & Aitken, R. J. (1995) De-finition of the optimal criteria for identifying hyperacti- vated spermatozoa at 25 Hz using in vitro fertilization as a functional end-point. Human Reproduction 10, 2928–2937.
reaction following ionophore challenge (ARIC). Rela- tionship to fertility and other seminal parameters. Journal of Andrology 12, 98–103.
23. Cayli S, Jakab A, Ovari L, Delpiano E, Celik-Ozenci C, Sakkas D, et al. Biochemical markers of spermatozoa function: male fertility and spermato- zoa selection for ICSI. Reprod Biomed Online 2003;7:462–8.
24. Cayli S, Sakkas D, Vigue L, Demir R, Huszar G. Cellular matu-rity and apoptosis in human spermatozoa: creatine kinase, cas-pase-3 and Bclx expression in mature and diminished maturity sperm. Mol Hum Reprod 2004;10:365–72.
25. Worrilow KC, Eid S, Matthews JM, Pelts EJ, Khoury C, Lie-berman J. A multi- site clinical trial evaluating PICSI® versus intracytoplasmic spermatozoa injection (ICSI): positive clinical outcomes observed in a prospective, randomized and double-blinded study. Fertil Steril 2009;92:S36–7.
19. Alasmari W1, Barratt CL, Publicover SJ, Whalley KM, Foster E, Kay V, Martins da Silva S, Oxenham SK (2013). Th e clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Hum Reprod. 28 (4): 866-76.
20. Ruso H (2013). Investigating the clinical value of hyperactivation and intracellular calcium signalling of human spermatozoa and the-ir value in drug screening. Published online (MSc thesis). Accessed from http://discovery.dundee.ac.uk/portal/en/theses/investigating- the-clinical-value-of-hyperactivation-and-intracellular-calcium- signalling-of-human-spermatozoa-and-their-value-in-drug-screening (c568dd26-c9c1-460a-b412-1e7e95b47fe1).html.
21. Mortimer ST, Swan MA, and Mortimer D (1998) Eff ect of se-minal plasma on capacitation and hyperactivation in human spermatozoa. Hum. Reprod. 13: 2139-2146.
22. Cummins, J. M., Pember, S. M. Jequier, A. M., Yovich, J. L. &
Hartmann, P. E. (1991) A test of the human sperm acro- some