Kalitatif amaçl› kullan›lan bafll›ca immunokimyasal yöntemler pasif jel difüzyon, immunelektroforez ve Western blottur.
Pasif Jel Difüzyon
Jel difüzyon testlerinde antijen antikor çökme reaksiyonlar› s›v› yerine jel ortamda flekillenir. Jelin farkl› noktalar›nda kuyucuklar aç›larak, bu noktalara antijen ve an-tikorlar ilave edilir. Ozmoz ile jel boyunca ilerlerken aç›lan kuyucuk etraf›nda ken-di seri suland›rmalar›n› halkalar halinde olufltururlar. Agar içeren ortamda flekille-nen difüzyon s›ras›nda antijen ve antikorun miktarca eflit oldu¤u noktada çökme halkalar› flekillenir. Jel difüzyon teknikleri asl›nda hem niteliksel hem de nicelik-sel olarak kullan›labilir. Oudin ve Ouchterlony tekniklerinde çoklu antijen ve an-tikor sistemleri niteliksel olarak identifiye edilebilir. Radial Immunodifuzyon tek-ni¤inde ise tek antijen ve antikor sistemi kullan›lmakta ve niceliksel analiz müm-kün olmaktad›r.
fiekil 6.10 Çökme testinde antijen ve antikor konsantrasyon iliflkisi
Oudin Jel Difüzyonu
Oudin Jel difüzyon sisteminde tek difüzyon-tek boyut sistemi kullan›lmaktad›r.
Reaksiyona giren maddelerden biri (ör. antijen) agaroz jele dahil edilir. Jel s›v› hal-de iken fleffaf bir hal-deney tüpüne aktar›l›r ve donmas› sa¤lan›r. Bu ifllemhal-den sonra antikor solüsyonu (serum) jelin üst k›sm›na tatbik edilir. Antikor jelde diffüzyona u¤rar ve ilerlerken konsantrasyonu azal›r. Antikor ve antijenin konsantrasyonunun eflit oldu¤u noktada çökme görülür.
Bu teknikte jelin bafllang›c› (üst k›sm›) ve çökmenin oldu¤u nokta aras›ndaki mesafe al›narak ölçümler yap›labilir. Bilinmeyen örne¤in de¤eri farkl› düzeylerde haz›rlanm›fl standartlar ile karfl›laflt›r›larak niceliksel ölçümler yap›labilir.
Ouchterlony Tekni¤i
Çift difüzyon-çift boyut sistemi 1960 y›l›nda Organ Ouchterlony taraf›ndan geliflti-rilmifltir. Agaroz petride haz›rland›ktan sonra petride önceki metodlarda oldu¤u gi-bi kuyucuklar aç›l›r. Aç›lan kuyucuklar ya antijen ya da antikor çözeltisi ile doldu-rulur. Antijen ve antikorlar molekül büyüklüklüklerine oranla her yöne da¤›lmaya bafllarlar. Karfl›laflt›klar› optimum noktada çökme meydana gelir. Çökme çizgileri-nin dikkatli incelenmesi çözeltide bulunan bireysel komponentlerin identifikasyo-nunu ve bir antijenin di¤erleri ile iliflkisini ortaya koyabilir.
Çizgilerin yorumlanmas› çoklu antijen-antikor iliflkilerini ortaya koyabilece¤i gi-bi, oluflan mesafelerden antijen ve antikorun göreceli konsantrasyonunu belirlene-bilir. Bunun yan›nda antijen-antikor aras› oluflan reaksiyon özdefllik, k›smi özdefl-lik veya özdefl olmama hakk›nda bilgi sa¤layabilir.
Radial ‹mmunodifüzyon
Radial immunodifüzyon tekni¤i tek difüzyon-çift boyut sistemidir. Reaksiyona gi-ren maddelerden biri agaroza dahil edilir (ör: antikor) ve agarozun petri kab›nda donmas› sa¤lan›r. Agarozda kuyucuklar aç›ld›ktan sonra bu noktalara antijen tat-bik edilir. Antijenin radial difüzyonu sonucu antijen ve antikor konsantrasyonunun eflitlendi¤i noktada çökme görülür. Dairenin çap› antijen konsantrasyonu ile do¤-fiekil 6.11
‹mmunodifüzyon reaksiyon tipleri
ru orant›l›d›r. Örnekteki antijen miktar›n› belirlemek için, refe-rans antijenin bir seri suland›r-mas› yap›l›r ve bundan elde edi-len zon çaplar› ile standart e¤ri elde edilir. Standart e¤ri için re-ferans antijenin konsantrasyon-lar›na denk gelen çaplar yar› lo-garitmik ka¤›da aktar›l›r. Stan-dart e¤ri örnek ile karfl›laflt›r›la-rak örne¤in miktar› elde edilmifl olur (fiekil 6.12).
Immunelektroforez
Proteinlerin elektroforez tekni¤i ile ay›r›m›n› takiben antikorlar ile reaksiyona gir-mesine dayanan biyokimyasal yöntemlere genel olarak immunelektroforez denil-mektedir. Immunelektroforezin tüm çeflitleri immunglobulinlere yani antikorlara gereksinim duyar. Immunelektroforez tekni¤inin gelifltirilmesi 20. yüzy›l›n ikinci yar›s›na rastlamaktad›r.
‹mmunelektroforez tekniklerin günümüzde kullan›m›n›, iki önemli neden s›n›r-lam›flt›r. ‹lk neden yo¤un iflgücüne ve ileri düzey el prati¤ine gereksinimi olmas›-d›r. ‹kinci önemli neden ise yüksek miktarda poliklonal antikor kullan›m›na gerek-sinim göstermesidir. Günümüzde jel elektroforezi takiben immunofiksasyon testi (Western blot) kolayl›¤›, hassasiyetinin yüksek oluflu ve az miktarda antikora ge-reksinim duyulmas› gibi nedenler ile daha çok tercih edilmeye bafllanm›flt›r.
Immunofiksasyon Testi (Western Blot)
Klinik uygulamalarda immunofiksasyon testi belirli anijene karfl› antikorun varl›¤›-n› göstermede kullavarl›¤›-n›lmaktad›r. Bu teknik ayvarl›¤›-n› zamanda apolipoprotein E (apoE) gibi spesifik proteinlerin tespitinde de kulan›lmaktad›r.
Metot üç aflamada gerçeklefltirilmektedir. ‹lk aflamada uygun destek ortam›nda (Ör: agaroz, poliakrilamid) antijen kar›fl›m›n›n elektroforezi gerçeklefltirilir. Önce-den tarif edildi¤i gibi elektroforezdeki ay›r›m yük-kütle oran›na dayanmaktad›r.
Elektroforez tamamland›ktan sonra destek ortam› nitrosellüloz veya PVDF tabanl›
membran ile temas haline getirilir. ‹kinci elektroforez ifllemi ile proteinler destek ortam›ndan al›narak membrana aktar›l›r. Bu özel filtreler proteinleri geri dönüflüm-süz olarak ba¤lar. Daha sonra membran protein çözeltisi ile muamele edilerek ser-best olan tüm bölgelerin proteinle kaplanmas› sa¤lan›r. Bloklama ad› verilen bu aflaman›n önemi bir sonraki basamakta ilave edilecek olan antikorun özgül olma-yan flekilde ba¤lanmas›n› engellemektir. ‹lgilenilen proteine özgü antikor çözeltisi veya hasta serumu ilave edildikten sonra belirli bir süre inkübasyona tabii tutulan membran y›kan›r. Y›kama aflamas›nda ba¤l› olmayan antikorlar uzaklaflt›r›lm›fl olur. Bu aflamadan sonra ilk antikora karfl› spesifiteye sahip iflaretli antikor ilave edilir. ‹lave edilen ikinci antikor önceden oluflan antijen-antikor kompleksini gös-termekte kullan›lmaktad›r. Kullan›lan ikinci antikor enzim iflaretli ise uygun subs-trat ilave edilerek antijen-antikor kompleksi gösterilmifl olmaktad›r (fiekil 6.13).
fiekil 6.12 Radial
Immunodifüzyon testinin görünümü
ELISA
Enzimle iflaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyo-na girmesi ve oluflan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spe-sifik substrat varl›¤›nda ortaya konmas› esas›na dayanan ölçüm tekni¤idir.
Test polistren mikrotitrasyon plakalar›nda gerçeklefltirilir. Plakalarda yer alan kuyucuklar› kaplamada antijen veya antikor çözeltileri kullan›l›r. ‹ncelenen örnek-ler bu kuyucuklarda inkübe ediörnek-lerek antijen-antikor kompleksi flekillenmesi sa¤la-n›r. Y›kama iflleminin ard›ndan enzimle iflaretli antijen veya antikor ilave edilir. ‹fla-retlemede kullan›lan enzime özgü substrat›n ilavesi sonucu reaksiyon flekillenme-siyle elde edilen renkli ürünlerin absorbans› ölçülerek aran›lan antijen veya anti-korun miktar› belirlenmifl olur.
ELISA çeflitleri iki grupta incelenebilmektedir.
1. Yar›flmal› teknikler
a) Antijen-enzim konjugat›n› kullanan teknik b) Antikor-enzim konjugat›n› kullanan teknik 2. Yar›flmal› olmayan teknikler
a) Çift antikor sandviç tekni¤i
b) Modifiye çift antikor sandviç tekni¤i c) ‹ndirekt teknik