Konvansiyel elektroforez; ay›r›m, boyama, tespit ve miktar tayini bafll›klar›ndan oluflur. Bunlara ilave olarak elektroforeze dayanan farkl› blotlama teknikleri gelifl-tirilmifltir.
Elektroforetik ay›r›m› gerçekleklefltirmek üzere, ya önceden ticari olarak ha-z›rlanm›fl agaroz veya poliakrilamid jeller kullan›l›r ya da uygun ekipmanlar ile elektroforez öncesi laboratuvarda haz›rlan›r. Her ikisinde de jelde hava
kabarc›-¤› olmamas›na ve s›v› içeri¤inin fazla olmamas›na dikkat edilmelidir. Daha sonra örnek, destek materyaline uygulan›r ve destek materyali daha önceden doldurul-mufl tampon hazneleri ile temas ettirilir. Elektroforez sabit ak›m ya da voltajda belirli bir süre ile uygulan›r.
Elektroforez tamamland›ktan sonra, destek ortam› elektroforezin yap›ld›¤› böl-meden al›n›r ve tamponu uzaklaflt›r›larak, birbirinden ayr›lan komponentlerin dif-füzyonunu önlemek amac›yla tespit çözeltisine aktar›l›r. Bu aflamadan sonra boya-narak bireysel protein alanlar›n›n görüntülenmesi sa¤lan›r. Fazla boya materyali y›-kanarak uzaklaflt›r›ld›ktan sonra destek ortam› kurutulur.
Elektroforetik ay›r›m ve boyaman›n ard›ndan oluflan gözle görünür protein alanlar›n› direk dansitometri ile yüzde olarak ya da örne¤in toplam protein mikta-r› bilindi¤i taktirde, mutlak de¤er olarak belirtmek mümkün olabilmektedir. Dan-sitometrede jel veya di¤er destek ortam› ölçüm yapan optik sistem taraf›ndan tara-n›r. Her pike ait absorbans, uygun araçlar ile ya ka¤›t çizelgeye aktar›l›r ya da elek-tronik olarak gösterilir. Miktar belirlemenin güvenilirli¤i; uygun dalga boyunun se-çilmesine, cihaz›n verdi¤i do¤rusal cevaba ve jel ya da strip artalan›n flefafl›¤›na ba¤l›d›r.
fiekil 6.3 Poliakrilamid jel elektroforez cihaz›
S O R U
D ‹ K K A T SIRA S‹ZDE
DÜfiÜNEL‹M
SIRA S‹ZDE
S O R U
DÜfiÜNEL‹M
D ‹ K K A T
SIRA S‹ZDE SIRA S‹ZDE
AMAÇLARIMIZ
AMAÇLARIMIZ
N N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E T
Yukar›da aç›kland›¤› üzere hassasiyeti artt›rmak için baz› örnekleri konsatre etmek (de-riflik hale getirme) gerekmektedir. Örnekle beraber ortamda bulunan di¤er iyonlar›n so-nuç üzerine nas›l bir etkisi olabilir ?
KROMATOGRAF‹
Kromatografi, birbiri ile yak›n benzerli¤i ve iliflkileri olan analitlerin, ayr›m› ve miktarlar›n›n belirlenmesine yönelik kullan›lmaktad›r. Çözünmüfl haldeki madde-lerin, hareketli faz ve sabit faz aras›nda farkl›l›k gösteren da¤›l›mlar›na göre ayr›l-mas›n› kromatografik sistemler sa¤lar. Bu ifllem s›ras›nda hareketli faz arac›l›¤›yla örnek, sabit faz› bar›nd›ran katman veya kolondan geçer. Mobil faz sabit faz üze-rinden ilerledikçe, çözünen maddeler ya sabit faza tutunur ve hareket etmeyebilir veya sabit faza hiç tutunmadan mobil fazla beraber hareket edebilir. Di¤er bir se-çenekte ise örnek her iki faz ile birden etkileflir ve iki faz aras›nda da¤›l›m göste-rir. Sabit faza ilgisi daha çok olan analitler daha yavafl göç ederken, az olanlar da-ha h›zl› da-hareket ederler. Analitlerin mobil faza ilgisi artt›kça göç etme h›z› artar.
Kuvvetli ba¤lanan analitler, sabit fazdan ancak mobil faz›n kimyasal özelli¤i de¤ifl-tirilerek ayr›labilirler.
Düzlemsel ve kolon kromatografi kromatografinin iki temel formudur. Düzlem-sel kromatografide sabit faz bir ka¤›t yapra¤a (ka¤›t kromatografi) veya kat› yüze-ye tutturulur (ince tabaka kromatografi). Ka¤›t kromatografide sabit faz suyun veya polar bir çözücünün ka¤›d›n liflerine tutturulmas› sonucu oluflturulur (fiekil 6.4). ‹nce tabaka kromatografide silika jel gibi partiküllerin ince tabaka halinde cam levha, plastik ya da aluminyum katmanlar üzerine düzgünce yay›larak kaplan-mas› ile oluflturulur. ‹nce tabaka küçük çapl› partiküllerden flekillendi¤i durumlar-da tekni¤e yüksek performansl› ince tabaka kromatografisi denilmektedir.
Kolon kromatografide, sabit faz saf silika veya polimer olabilir. Destek ortam›-na ya kaplanmakta ya da kimyasal flekilde ba¤lanmaktad›r. Sabit faz tüp içine dol-durulabilir veya tüp iç yüzeyine kaplanabilir. Hareketli faz›n gaz ya da s›v› olmas›-na göre kolon kromatografi gaz veya s›v› kromatografi olarak adland›r›l›r. Her
S O R U
D ‹ K K A T SIRA S‹ZDE
DÜfiÜNEL‹M
SIRA S‹ZDE
S O R U
DÜfiÜNEL‹M
D ‹ K K A T
SIRA S‹ZDE SIRA S‹ZDE
AMAÇLARIMIZ
AMAÇLARIMIZ
N N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E T
2
fiekil 6.4
‹nce tabaka kromatografinin flematik olarak gösterilmesi
iki teknik kütle spektrometresi ile beraber kullan›l›rsa buna birlefltirilmifl teknikler denir ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi veya s›v› kromatografi-kütle spek-trometresi tan›mlar›ndan bahsedilir.
Hareketli faz, sabit faz içerisinden geçer. Bu s›rada analitin kolondaki sabit fazla etkileflimleri sonucu, molekül özelliklerine göre bir s›ralanma oluflur (fiekil 6.5).
Analitik gaz kromatografi veya s›v› kromatografide (fiekil 6.6), hareketli faz ko-londan ç›kar ve dedektörden geçerek; zaman›n, mesafenin veya hacmin fonksiyo-nunda elektronik sinyal oluflturur (fiekil 6.7). Elde edilen grafik kromatogram ola-rak adland›r›l›r. Tutulma zaman› veya hacmi ise, analitin enjekte edildi¤i andan bafllay›p kolondan geçerek dedektörü terk etmesi için gereken süre veya hareket-li faz miktar›d›r. Kromatogram taraf›ndan sa¤lanan veri, anahareket-litlerin tan›mlanmas›n›
ve miktarca belirlenmesini sa¤lar. Kolondan ayr›lan (elüe olan) çözünmüfl madde-ler grafikte pikmadde-ler halinde görülür. Bu nedenle bunlara kromatografik pik denil-mektedir. Düzlemsel kromatografide ayr›lan alanlar ya kendine özgü renkler ara-c›l›¤› ile ya da kimyasal de¤ifliklik sonucu elde edilmifl renkli odaklar veya bantlar halinde görüntülenir. Bu sayede analitlerin niteliksel olarak identifikasyonu yap›-labildi¤i gibi miktar analizi de yap›labilir.
fiekil 6.5 Kolonda moleküllerin ay›r›m›n›n flematik olarak gösterilmesi
Kromatografik Ay›r›m›n S›n›fland›r›lmas›
Kromatografik ay›r›m›n s›n›fland›r›lmas›, çözünen maddelerin fiziksel veya kimya-sal özelliklerine göre yap›lmaktad›r. Bunlar iyon de¤iflim, bölümleme (partisyon), so¤urma (adsorbsiyon), boyut d›fllama (jel filtrasyon) ve affinite kromatografileri-dir. Klinik laboratuvar uygulamalar›nda en çok iyon de¤iflim ve partisyon kroma-tografi teknikleri kullan›lmaktad›r.
fiekil 6.6 S›v›kromatografinin flematik olarak gösterilmesi
fiekil 6.7
min
AU
Örnek kromatogram
‹yon De¤iflim Kromatografi
‹yon de¤iflim kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun z›t yüküne sahip hareketli faz aras›nda iyonlar›n yer de¤iflimi esas›na dayan›r. fiartla-ra ba¤l› olafiartla-rak çözünmüfl maddeler ya katyon (art› yüklü) ya da anyon (eksi yük-lü) olarak bulunurlar. Ay›r›m, tafl›nan yüklerin fark ve miktar›na dayan›r. ‹fllemsel olarak sabit faz olarak görev yapan silika parçac›klar› veya reçinenin yüzeylerine, anyonik veya katyonik yükleri sa¤layan fonksiyonel gruplar ba¤lan›r. Elektrokim-yasal nötrlü¤ü sa¤lamak için ters iyon (counter ion) olarak tan›mlanan takas iyo-nu, sabit yüklere çok yak›n konumda bulunur ve hareketli fazda yer alan çözün-müfl iyonlar ters iyonlar ile yer de¤ifltirirler.
Katyon de¤iflim partikülleri, negatif yüklü fonksiyonel gruplar› bar›nd›r›r ve katyonik karakterdeki çözünen maddeleri ay›rmak için kullan›l›r. Sülfonat iyonla-r›, kuvvetli asit gruplara örnek olarak verilebilirken, karboksilat iyonlar› veya kar-boksimetil, fosfat, sülfometil veya sülfopropil gruplar› zay›f asidik gruplara örnek verilebilir.
Anyon de¤iflim dolgu materyalleri anyonik karakterdeki çözünmüfl maddelerin ay›r›m›nda kullan›l›r. Pozitif yük tafl›yan ve kuvvetli bazik kuarterner aminleri bu-lunduranlara örnek olarak trietilaminoetil gruplar› verilebilirken; zay›f bazik olan-lara ise aminoetil, diaminoetil, guanidoetil veya epiklorohidrin-trietanolamin grup-lar› verilebilir.
‹yon de¤iflim kromatografisi çok say›da uygulama alan› bulmufltur. Aminoasit-lerin, peptitAminoasit-lerin, proteinlerin ve nükleotidAminoasit-lerin, oligonükleotidlerin ve nükleik asitlerin ay›r›m›nda yo¤un olarak kullan›lmaktad›r. ‹yon de¤iflim kromatografinin di¤er bir uygulama alan› ise s›v› çözeltilerden inorganik iyonlar›n uzaklaflt›r›lmas›-d›r. Örne¤in anyon ve katyon de¤iflim reçinelerini birlikte bar›nd›ran kompozit dolgu materyalleri ile deiyonize su haz›rlanabilmektedir.
Partisyon Kromatografi
Çözünen maddelerin birbirine kar›flmayan iki s›v› aras›nda da¤›l›m› partisyon kro-matografinin temelini oluflturur. ‹fllemsel olarak s›v›lardan bir tanesi sabit faz› olufl-turur. Bu faz›n oluflturulmas› için ince tabaka s›v› destek materyali üzerine veya ka-piller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ay›r›m çözünen maddelerin sabit ve hare-ketli faz aras›nda göreceli çözünme yetene¤ine ba¤l› olarak flekillenir.
Partisyon kromatografi s›v›-s›v› kromatografi ve gaz-s›v› kromatografi fleklinde s›n›fland›r›labilir. S›v›-s›v› kromatografi ise normal faz kromatografi ve ters faz kro-matografi olarak ikiye ayr›l›r. Normal faz krokro-matografide sabit faz olarak polar s›-v› kullan›l›rken göreceli olarak apolar çözücü veya çözücü kar›fl›m› hareketli faz olarak kullan›l›r. Ters faz kromatografide, sabit faz apolar olup hareketli faz göre-celi olarak polard›r.
Elinizde iki farkl› maddeyi ters faz kromatografi tekni¤i ile ay›rmak istiyorsunuz. Bunlar-dan bir tanesi daha polar olup kolonu önce terk etme e¤ilimindedir fakat ay›r›m›n iyi ol-mad›¤›n› gördü¤ünüzde ilk hareket noktan›z ne olabilir?
‹yon bask›lama ve iyon-çifti kromatografisi, iyonik maddelerin ay›r›m›nda kul-lan›lan iki farkl› tür ters faz kromatografidir. ‹yon bask›lama kromatografisinde, iyonik karakterli zay›f asit veya baz olan mobil faz›n pH’s› de¤ifltirilerek nötralize edilir. ‹yonik grubun nötralize olmas›yla analit daha az polar hale gelir ve apolar
S O R U
D ‹ K K A T SIRA S‹ZDE
DÜfiÜNEL‹M
SIRA S‹ZDE
S O R U
DÜfiÜNEL‹M
D ‹ K K A T
SIRA S‹ZDE SIRA S‹ZDE
AMAÇLARIMIZ
AMAÇLARIMIZ
N N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E T
3
sabit faz ile daha iyi etkileflir. ‹yon çifti kromatografisinde ise ters iyon yani anali-te z›t kutuplu iyon mobil faza ilave edilir ve analit ile iyonik çift meydana getire-rek nötralize eder. Daha sonra bu çiftler ters faz kromatografi ile birbirilerinden ay-r›l›r. ‹yon çifti kromatografisi terapötik ilaç ve metabolitlerin ay›r›m›na önemli katk›lar sa¤lar.
Adsorpsiyon Kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografinin esas›n›, çözünmüfl maddelerin kat› yüzeyde so¤rul-ma (adsorpsiyon) ve sal›nso¤rul-ma olaylar› aras›ndaki fark oluflturur. Elektrostatik hidro-jen ba¤lar› ve da¤›l›msal etkileflimler bu tip kromatografiyi kontrol alt›nda tutan faktörlerdir. Bu çal›flma flekli ile gaz kromatografi kullan›larak düflük molekül a¤›r-l›k ve oda ›s›nda gaz formunda olan moleküller birbirinden ayr›labilmektedir.
Boyut D›fllama Kromatografisi (Jel Filtrasyon)
Bu kromatografi çeflidi ayn› zamanda jel filtrasyon, moleküler eleme, sterik eleme ve jel nüfuz kromatografisi olarak da bilinmekte olup moleküllerin büyüklüklerine göre ayr›m›n› sa¤lar. Molekülün flekli ve hidratize formda bulunmas› ifllemin so-nuçlar›n› etkilemektedir.
Sabit faz olarak çok çeflitli materyaller kullan›labilmektedir. Bunlar çapraz ba¤-l› dekstran, poliakrilamid, agaroz, polystrene-divinilbenzen gözenekli cam veya bunlar›n farkl› kombinasyonlar›d›r (fiekil 6.8). Bu materyallerin tanecikleri göze-neklidir ve küçük moleküller gözeneklerde geçici olarak yakalan›r. Gözeneklere giremeyecek kadar büyük olan moleküller ise tutulmadan mobil faz ile beraber kolonu terk eder. Orta boydaki moleküller gözeneklerin bir k›sm›nda geçiçi süre ile tutulurlar ve kolonu büyüklerden sonra, fakat küçük moleküllerden önce ter-kederler. Bu tip kromatografi analitik olmaktan çok örnek haz›rlamaya yöneliktir.
Yapaca¤›n›z çal›flmada molekül a¤›rl›¤› oldukça düflük bir protein ile ilgileniyor ve etki-leflime neden oldu¤unu bildi¤iniz yüksek molekül a¤›rl›kl› gama globulin fonksiyonunu uzaklaflt›rmak istiyorsunuz. Nas›l bir yol izlersiniz?
fiekil 6.8 Boyut d›fllama (Jel Filtasyon) kromatografi prensibinin flematik olarak gösterilmesi
S O R U
D ‹ K K A T SIRA S‹ZDE
DÜfiÜNEL‹M
SIRA S‹ZDE
S O R U
DÜfiÜNEL‹M
D ‹ K K A T
SIRA S‹ZDE SIRA S‹ZDE
AMAÇLARIMIZ
AMAÇLARIMIZ
N N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E T
4
Affinite Kromatografi
Affinite kromatografide analit ve ba¤lay›c› molekülün biribiri ile eflsiz bir biçimde ba¤lanmas› yöntemin esas›n› oluflturur. Enzim-substrat, hormon-reseptör veya an-tijen antikor etkileflimleri bu teknikte kullan›lmaktad›r (fiekil 6.9).
Affinite kromatografinin gücü tekni¤in seçicili¤inde yatmaktad›r. Klinik labora-tuvarlarda glike hemoglobini, düflük yo¤unluklu ve çok düflük yo¤unluklu lipop-roteinleri birbirinden ay›rmakta kullan›lm›flt›r. Bu teknik ayn› zamanda çok miktar-da protein veya antikor haz›rlanmas› çal›flmalar›nmiktar-da miktar-da kullan›lm›flt›r.
Affinite kromatografide hem etkileflim yönünden hem de saflaflt›r›lmas› planlanan biyo-molekülün biyolojik aktivitesi yönünden çal›flma s›ras›nda uygulanan pH ya çok dikkat edilmelidir.