Bu spektroskopi dal›, maddenin üzerine gelen elektromanyetik ›fl›ma ile uyar›lma-s› ve temel haldeki elektronlar›n uyar›lm›fl enerji seviyesine geçmesi, daha sonra bu seviyede kararl› kalamad›klar›ndan, tekrar temel enerji düzeyine geri dönmele-ri ve bu esnada ortama verdi¤i ›fl›man›n ölçülmesi ilkesine dayanmaktad›r.
Metal iyonlar›n›n analizi, bunlar›n oluflturduklar› baz› floresan kompleksleri yar-d›m›yla yap›labilmektedir. Baz› amino asitler florometrik yoldan tayin edilebilir.
Di-¤er taraftan baz› biyokimyasal bileflikler bir floresan madde ile tepkimeye sokulup yeni bir floresan ürün veya etiketlenmifl ürün oluflturularak tayin edilebilmektedir.
Yaklafl›k 30 y›ld›r floresans ve fosforesans gibi yöntemler ilaç, hormon ve ben-zeri analitlerin düzeylerinin saptanmas›nda klinik laboratuvarlarda kullan›m alan›
bulmufltur. Hassas, güvenilir, h›zl› ve basit olmas› nedeniyle flurometri ak›m sito-metri, raman spektroskopi gibi geliflmifl yöntemlerin geliflmifl yöntemlerin temelini oluflturmaktad›r.
Atomda ayn› yörüngede bulunan elektronlar, birbirine z›t yönde veya ayn› yön-de dönebilirler. Bir atomda ayn› yörüngeyön-de bulunan elektronlar birbirinin aksi yö-nünde hareket ediyor ise buna temel singlet; uyar›ld›¤›nda aksi yönde hareket et-meye devam edip üst yörüngeye geçerse uyar›lm›fl singlet denmektedir. Bir ato-mun iki farkl› yörüngesinde ayn› yönde dönen birer elektron varsa buna temel tripletdenir. Temel triplet durumundan uyar›lm›fl triplet durumuna geçifl elektro-nun bir üst yörüngeye ç›kmas› sonucu görülür.
Uyar›lm›fl singlet sistemden, temel haldeki singlet sisteme geçifl s›ras›nda yay›-lan ›fl›¤a fluoresans; uyar›lm›fl triplet sistemden temel haldeki singlet bir sisteme geçifl s›ras›nda yay›lan ›fl›¤a ise fosforesans ad› verilmektedir.
Luminometri
Luminometri, luminesans olarak adland›r›lan; kimyasal reaksiyon sonucu a盤a ç›km›fl görünür ›fl›¤›n enerji düzeyine karfl›l›k gelen emisyonunun ölçülmesidir.
Kemilüminesans uyar›lm›fl elektronlar›n kararl› hale döndü¤ü s›rada görülür. ‹lk uyar›m floresan ürünün oluflmas› sonucu oluflur. Örne¤in, luminolün oksijen ile reaksiyona girmesi sonucu 3-aminonaftalen oluflur ve floresans spektrum ortaya koyar. Bu kemiluminesans olarak gözlemlenir. Di¤er bir ifade ile reaksiyonun ke-miluminesans spektrumu ile ürünün floresans spektrumu ayn›d›r.
90° dedektör
Geçen ›fl›¤› ölçen dedektör
Örne¤in bulundu¤u
hücre Lamba Lens
fiekil 5.2 Turbidimetrik yöntemin flematik olarak gösterilmesi
Biyoluminesans ayn› fenomeni tan›mlar; fakat floresans ürünü oluflturan sade-ce enzimatik reaksiyondur. En s›kl›kla kullan›lan enzim lusiferazd›r. Biolumine-sans oldukça duyarl› bir yöntemdir. Baz› lusiferaz sistemleri % 100 verimle çal›fl-maktad›r. Kabaca örnek vermek istersenirse, evlerde kullan›lan ampul enerjinin ancak % 10 kadar›n› ›fl›¤a çevirebilmekte geri kalan k›sm› ›s› olarak a盤a ç›kmak-tad›r. Luminesans herhangi bir optik uyar›ma ba¤›ml› olmad›¤›ndan testlerde ken-dili¤inden floresan oluflturma gibi problemler ile karfl›lafl›lmaz.
Kullan›m›na örnek olarak adenozin-trifosfat (ATP) tüm canl›larda ortak enerji kayna¤›d›r. Ölümün ard›ndan iki saat içinde tamamen yok olur. Her hücre için ge-rekli miktar genellikle sabittir. Ekstrakte edilen hücresel ATP nin ölçümü bakteri miktar› hakk›nda fikir verebilir ve sanitasyonu de¤erlendirmede kullan›labilir. ATP düzeyini belirlemede en h›zl› ve en kolay yol atefl böce¤indeki ATP varl›¤›nda ›fl›k saç›lmas›na neden lusiferin-lusiferaz sistemini kullanmakt›r. ATP ekstrakte edildik-ten sonra bu enzim sistem eklenir ve saniyeler içerisinde oluflan ›fl›k luminometre veya sintilasyon cihaz› ile ölçülür. Oluflan ›fl›¤›n fliddeti bakteri miktar› ile do¤ru orant›l›d›r. Sonuçlar RLU (Relative light units-Göreceli ›fl›k ünitesi) cinsinden verilir.
Polarimetri
Polarimetri, transvers dalgalar›n polarize olmas›n›n ölçülmesi ve yorumlanmas›na yarayan yöntemdir. Ço¤unlukla elektromanyetik dalgalar›n ve ›fl›¤›n incelenmesin-de kullan›l›r.
Anizotropik kristal kat›lar ve çözeltide kiral bir moleküle ait bilinen bir enanti-yomerin bask›n olarak bulunmas›, polarize düzlemde bulunan ›fl›¤› sapt›r›r. Böyle maddeler optikçe aktif maddeler olarak adland›r›l›rlar. Polarizasyonun oryantasyo-nunun de¤iflimi polarimetri olarak adland›r›l›rken, kullan›lan cihaza polarimetre denilmektedir (fiekil 5.3, Resim 5.2). Bu özellik anizotropik yap›lar›n belirlenme-sinde ya da kiral moleküllerin safl›¤›n›n ortaya konmas›nda faydal›d›r.
Kiral molekülün tek örne¤ini içeren çözelti optikçe saf olarak kabul edilir.
Ifl›-¤›n seyri incelenirken, sapman›n saat yönünde ya da sa¤ tarafa flekillenmesi dek-sarotator veya (+) enantiyomer olarak adland›r›l›rken, tersine olmas› levorotator ya da (-) enantiyomer olarak aç›klan›r.
fiekil 5.3 Ifl›k
Kayna¤›
Polarize ›fl›k
Örnek tüpü
Ifl›¤›n sapma aç›s›n› ölçen düzenek
Gözlemci
Polarimetrik yöntemin flematik olarak gösterilmesi
Do¤rusal veya düzlemsel-polarize ›fl›k, sa¤a ve sola sirküler olarak polarize olan ›fl›¤›n eflit olarak çak›flmas› sonucu oluflur. Düzlemsel polarize ›fl›k optikçe ak-tif bir çözelti içerisinden geçerken sa¤ veya sol polarize ›fl›k farkl› h›zda seyreder.
Bu h›z fark› iki sirküler polarize ›fl›¤›n aras›nda faz oluflturur. Bu iki komponentin toplam› do¤rusal-polarize ›fl›k olufltursa da oluflan fazlar girifl noktas›ndan farkl›
konumda bulunurlar.
Atomik Spektroskopi
Alev Fotometri - Alev Atomik Emisyon Spektrometri
Alev fotometri atomik spektroskopinin bir dal›d›r ve spektrometrede incelenen türler sadece atomlard›r. Atomik spektroskopinin di¤er iki dal› atomik absorbsiyon spektrofotometri ve indüklenmifl plazma atomik emisyon spektrometrisidir. Indük-lenmifl plazma atomik emisyon spektrometresi pahal› bir analiz flekli oldu¤undan temel yöntem olarak yer almamaktad›r. Tüm ad› geçen yöntemlerde atomlar ›fl›k-la uyar›l›r. Absorbsiyon yöntemleri, elektron›fl›k-lar üst düzeye geçerken ›fl›¤› so¤urma-lar› esas›na dayan›rken, emisyon yöntemleri elektronso¤urma-lar›n kararl› hale dönerken yayd›klar› ›fl›¤›n ölçülmesini esas al›r.
Alev fotometri, özellikle düflük alev ›s›s› ile yüksek enerji düzeylerine uyar›la-bilen metaller (Na, K, Rb, Cs, Ca, Ba, Cu) olmak üzere birçok katyonun kalitatif ve kantitatif de¤erlendirilmesine uygundur. Bu yöntemle alev çözücüyü uçururken, metalleri süblime ve atomize eder böylece valans elektron bir üst enerji düzeyine uyar›l›r. Elektronlar›n kararl› konuma dönerken yayd›klar› ›fl›¤›n dalga boyu meta-le özgü oldu¤undan kantitatif analiz mümkün olmaktad›r (fiekil 5.4).
Alev fotometrelerde ilgili analitin emisyonunu ölçmek için uygun filtreler kul-lan›lmaktad›r.
Bilinmeyene ait emisyon fliddetinin standart çözeltiler ile karfl›laflt›r›lmas› (ka-librasyon e¤risi arac›l›¤› ile) veya dahili standart arac›l›¤›yla ilgili metal kantitatif analizi yap›labilmektedir.
Emsiyonun fliddeti Scheibe-Lomakin denklemi ile aç›klanabilir.
I = k .c n
c = elementin konsantrasyonu k = orant› sabiti
n ~1 (kalibrasyon e¤risinin do¤rusal k›sm›)
Bu nedenle ›fl›¤›n emisyonu örne¤in konsantrasyonu ile do¤rudan iliflkilidir.
Resim 5.2 Polarimetri (solda manuel - sa¤da otomatik)
Gaz faz›ndaki atomlar›n kendilerine özgü ve oldukça dar bir aral›kta seyreden emisyon spektrumlar› oldu¤undan, alev fotometride etkileflimlere fazla rastlan›l-maz. Bu nedenle alev fotometri (di¤er atomik spetroskopi yöntemlerinde oldu¤u gibi) oldukça duyarl› bir yöntemdir (ppm düzeyi-mg/kg). Miktar tayini yap›lacak metal iyonlar›n çözeltideki konsantrasyonu 10-3-10-4 mol/dm3 civar›nda olmas›
idealdir.
Alev fotometreler oldukça basit cihazlard›r. Analizi yap›lacak maddenin kendi-si ›fl›k yayd›¤›ndan ›fl›k kayna¤›na da ihtiyaç duyulmamaktad›r. Uyar›m için gerek-li enerji, asetilen veya do¤al gaz›n yanmas› sonucu ortaya ç›kan yüksek s›cakl›kt›r (2000-3000 °C). Alevin yayd›¤› ›s› ve indirgeyici gaz›n (yak›t) etkisi ile örnek atom-lar›na ayr›fl›r. Gaz faz›ndaki atomlar›n verdi¤i spektrum hat fleklindedir. Kovalent ba¤lar olmad›¤›ndan bant fleklinde genifl spektrum görülmez.
Cihaz›n en duyarl› k›sm› aspiratör ve yakma k›sm›d›r (Resim 5.3). Gazlar aspi-rasyonda önemli rol oynar. Bernoulli prensibine dayanarak hava arac›l›¤› ile ör-nek emilir ve aspiratöre aktar›r. Burada büyük damlac›klar küçültülür hatta berta-raf edilir.
Monokromatör emisyona uygun dalga boyunun seçilmesini sa¤lar. Genel kul-lan›ma uygun optik filtreler de kullan›labilir. Emisyona u¤rayan ›fl›k dedektöre ula-fl›r. Burada ›fl›¤›n fliddeti orant›l› olarak elektrik sinyaline dönüfltürülürek cihazda-ki gösterge taraf›ndan okunmas›n› sa¤lar.
Elinizde böbrek hastal›¤›ndan flüphenilen bir kediye ait kan plazmas› bulunmaktad›r ve sizden Na ve K analizi istenmektedir. Bu örnekte protein ve di¤er minerallerin bulunmas›
sonuç üzerine olumsuz etki oluflturabilir mi ?
Alev fotometri pek çok avantaja sahiptir. Kullan›m› basittir ve testlerin maliyeti oldukça düflüktür. Biyolojik örnekler ve çevre analizi için birim zamanda oldukça yüksek say›da analiz yap›lmas›n› sa¤lar. Di¤er taraftan, analizdeki düflük ›s›, alevin
fiekil 5.4
Alev
Filtre
Dedektör
Hava
Yak›t
Aspire edilen örnek
Alev fotometrik yöntemin flematik olarak gösterilmesi
S O R U
D ‹ K K A T SIRA S‹ZDE
DÜfiÜNEL‹M
SIRA S‹ZDE
S O R U
DÜfiÜNEL‹M
D ‹ K K A T
SIRA S‹ZDE SIRA S‹ZDE
AMAÇLARIMIZ
AMAÇLARIMIZ
N N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
K ‹ T A P
T E L E V ‹ Z Y O N
‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E T
2
kararl›¤› ve aspirasyon flartlar› sonuçlar› etkilemektedir. Pek çok deneysel varyas-yon ›fl›¤›n emisvaryas-yonunu etkilemektedir. Yak›t ve okside edici ajanlar›n ak›fl h›z›, saf-l›¤›, aspirasyon oran› sonucu etkilemektedir. Bu nedenle en iyi sonuçlar› almak için cihaza s›kl›kla ve çok dikkatli kalibrasyon yap›lmal› ve standart ile örnek mümkün oldu¤unca ayn› flartlar alt›nda çal›fl›lmal›d›r.
Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi
Ifl›¤›n serbest atomlar taraf›ndan so¤urulmas› atomik absorbsiyon spektrometrisin-in (AAS) esas›n› oluflturur. Önceden bahsedildi¤i üzere alev fotometri gibi atomik spektroskopi yöntemidir. Farkl›l›k ise alev fotometrinin aksine emisyona u¤rayan
›fl›¤› de¤il so¤urulan ›fl›¤› ölçer (fiekil 5.5). Di¤er bir söyleyiflle uyar›lma reaksiyo-nun ilk k›sm› yöntemde kullan›l›r.
Atomik absorbsiyon spektrofotometresi oldukça pahal› bir cihazd›r (Resim 5.4).
Fakat kullan›m alan› oldukça yayg›nd›r. Atomik absorbsiyon spektrofotometresi sayesinde çok düflük konsantrasyonlarda olsa dahi 70 elementin (özellikle metal-ler) analizi yap›labilmektedir.
Örnek çok yüksek s›cakl›kta atomize edilir (2500-3000 °C) ve serbest atomlar›n spekturumu hat fleklindedir. Bu da elektronlar›n uyar›lmas›na göre sadece bilinen Resim 5.3
Alev Fotometresi
Lens Lens
Katot lamba Atomize örnek
Dedektör Monokromatör
Gösterge Amplifikatör fiekil 5.5
Atomik absorbsiyon spektrofotometri yönteminin flematik olarak gösterilmesi
enerji düzeyindeki ›fl›¤›n so¤urulabilece¤i anlam›na gelmektedir. Bu durumda uya-r›lma enerjisi, kararl› haldeki elektronlar›n enerjisi ile uyauya-r›lma durumundaki elek-tronlar›n enerjileri aras›ndaki farkt›r. Sadece belirli dalga boyundaki ›fl›k bahsedi-len uyar›lma enerjisine sahiptir. Bu dalga boyu so¤uruldu¤unda devaml› elektro-manyetik spektrumdaki yeri bofl kalacakt›r ve atom spekturumunda siyah bir hat olarak gözlenecektir.
Yukar›da bahsedildi¤i gibi atomik absorbsiyon yönteminde atomlar kendileri-ne özgü dalga boyunda monokromatik kayna¤› taraf›ndan oluflturulan ›fl›k ile uya-r›l›r. Bu ›fl›¤›, sadece incelenen atomlar so¤urabilir. So¤urulma sonucunda ›fl›¤›n fliddeti azalacakt›r. Bu düflüfl incelenen atomlar›n miktar› ile orant›l›d›r. Bu sayede oldukça duyarl› analizler yap›labilmektedir.