İbn Ebî İsba‘ın Kaynak Aldığı Şairler

Para a identificação dos homólogos do gene PRP1 de L. major em diferentes espécies de Leishmania (Fig. 5), os iniciadores degenerados (NBD1F e NBD1R) baseados nas regiões codificantes do 1º domínio de ligação de ATP de diferentes transportadores ABC, incluindo a PRP1 de L. major, foram utilizados em reação de PCR. Conforme demonstrado na Figura 5, esses iniciadores foram capazes de amplificar um produto de DNA específico de cerca de 0,6 kb em L. major conforme esperado e também em L. amazonensis e L. braziliensis, mas não em L. chagasi (Fig. 5). Esses iniciadores amplificaram também fragmentos de DNA específicos de

Resultados pouco menos de 0,5 kb (Fig. 5). Os fragmentos de 0,6 kb foram clonados no vetor pUC19 e em seguida seqüenciados. A análise da seqüência de nucleotídeos dos clones obtidos de aproximadamente 600 pb mostrou que estes correspondiam aos respectivos ortólogos do gene PRP1 de L. major. A análise da seqüência de nucleotídeos dos respectivos clones constituídos por 600 e 615 pares de base para L. amazonensis e L. braziliensis respectivamente indicaram que estes continham uma única fase de leitura aberta contida em ambos os fragmentos clonados. A análise da seqüência de aminoácidos da fase de leitura contida nos respectivos clones indicou que estes apresentavam identidade de cerca de 80% quando comparados com a PRP1 de L. major, previamente caracterizada (Tab. 5 e Fig. 6). No alinhamento da seqüência de aminoácidos observou-se a presença de 6 aminoácidos entre o motivo Walker A e a assinatura dos transportadores ABC (motivo C) na PRP1 de L. braziliensis, aminoácidos estes não presentes nas outras espécies, todas elas do subgênero Leishmania (Fig. 6). Buscas em banco de dados do projeto Genoma de outros tripanossomatídeos (T. brucei e T. cruzi) indicaram a ausência de seqüências relacionadas a PRP1, o que mostra que a PRP1 é específica do gênero Leishmania (LEPROHON et al., 2006).

Os fragmentos de cerca de 0,5 kb, cuja amplificação ocorreu nas três espécies estudadas (Fig. 5), inclusive em L. major, demonstrou pela clonagem e posterior sequenciamento dos fragmentos, que estes correspondem a genes de um outro transportador ABC de Leishmania, a MRPA (PGPA) envolvida na resistência aos antimoniais e ao arsênito (CALLAHAN; BEVERLEY, 1991; PAPADOPOULOU et al., 1994). Os valores de identidade entre os transportadores ABC MRPA (PGPA) entre as diferentes espécies de Leishmania e T. brucei, correspondentes a esse fragmento de 0,5 kb, são apresentados na Tabela 6 e variaram entre 94,2 e 62,8% entre seus

Resultados membros. Na Figura 7, está representado o alinhamento da seqüência de aminoácidos da fase de leitura contida nos clones obtidos das três espécies estudadas. Foram acrescentados ainda a esse alinhamento a MRPA (PGPA) de L. tarantolae, L. infantum e de T. brucei, cujo ortólogo já foi caracterizado e associado com a resistência à drogas (Fig. 7) (SHAHI; KRAUTH-SIEGEL; CLAYON, 2002).

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose a 1,2% corado com brometo de etídio contendo os produtos

de amplificação por PCR utilizando os iniciadores NBD1F e NBD1R a partir de DNA genômico de L. major (1), L. amazonensis (2), L. braziliensis (3) e L. chagasi (4). (-) Controle negativo da PCR.

Resultados

Tabela 5. Identidade de aminoácidos (%) entre os transportadores ABC PRP1 de L.

amazonensis (La PRP1), L. braziliensis (Lb PRP1), L. infantum (Li PRP1) e L.

major (Lm PRP1) (AAP79578).

La PRP1 Lb PRP1 Li PRP1 Lm PRP1

La PRP1 - 80 89 90,5

Lb PRP1 - - 81 78

Li PRP1 - - - 91

Figura 6. Alinhamento da seqüência de aminoácidos do 1º domínio de ligação de ATP da PRP1 de

Leishmania spp. utilizando o algoritmo ClustalW (DNASTAR, Inc.). Os aminoácidos

idênticos estão em cinza e os motivos Walker A e B relacionados com a ligação de ATP e a assinatura dos transportadores ABC estão em caixas nomeados por A, B e C respectivamente. Está representado a La PRP1 de L. amazonensis, a Lb PRP1 de L.

Resultados

Tabela 6. Identidade de aminoácidos (%) entre os transportadores ABC MRPA (PGPA) de

L. amazonensis (La MRPA), L. braziliensis (Lb MRPA), L. infantum (Li MRPA), L.

major (Lm MRPA) (CAJ03979), L. chagasi (Lc MRPA), L. tarentolae (Lt MRPA)

(P21441) e T. brucei (Tb MRPA) (CAC83020).

La MRPA Lb MRPA Li MRPA Lm MRPA Lc MRPA Lt MRPA Tb MRPA

La MRPA - 94,2 79,5 79,5 71,2 75,6 73,7 Lb MRPA - - 75,6 74,4 69,9 71,8 69,9 Li MRPA - - - 95,5 64,1 89,1 68,6 Lm MRPA - - - - 64,1 90,4 69,9 Lc MRPA - - - - - 62,8 67,3 Lt MRPA - - - - - - 69,9

Figura 7. Alinhamento da seqüência de aminoácidos do 1º domínio de ligação de ATP da MRPA

(PGPA) de Leishmania spp. e Trypanosoma brucei utilizando o algoritmo ClustalW (DNASTAR, Inc.). Os aminoácidos idênticos estão em cinza e os motivos Walker A e B relacionados com a ligação de ATP e a assinatura dos transportadores ABC estão em caixas nomeados por A, B e C respectivamente. Está representado a La MRPA de L.

amazonensis, a Lb MRPA de L. braziliensis, a Li MRPA de L. infantum, a Lm MRPA de L. major (CAJ03979), a Lc MRPA de L. chagasi, a Lt MRPA de L. tarentolae (P21441) e a Tb

Resultados A análise por Southern blot utilizando duas diferentes sondas do gene PRP1, mostrou que o gene PRP1 é de cópia única como nas demais espécies estudadas (Fig. 8). A sonda correspondendo a um fragmento de DNA 1,2 kb PvuII da região que codifica a 2ª região transmembrana da PRP1 detectou bandas únicas em L. amazonensis e L. chagasi, fracamente também detectadas em L. braziliensis (Fig. 8A). A segunda sonda correspondendo ao primeiro domínio de ligação de ATP da PRP1 detectou bandas em todas as espécies estudadas, inclusive em L. braziliensis (Fig. 8B). Considerando que esse experimento foi realizado em condições de moderada estringência, pode-se observar várias bandas já que os domínios de ligação de ATP são altamente conservados entre os membros dos transportadores ABC.

Nenhum transcrito do gene PRP1 foi detectado a partir de RNA total de formas promastigotas das três espécies de Leishmania estudadas em ensaios de Northern blot (dados não mostrados). Porém, em ensaios de RT-PCR, um teste mais sensível, os iniciadores descritos previamente, NBD1F e NBD1R foram capazes de amplificar cDNAs correspondentes ao gene PRP1 de Leishmania. Conforme a análise por RT- PCR em eletroforese em gel de agarose, verificou-se a presença de transcritos a partir de RNA total de formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis (Fig. 9A). Na Figura 9B, detectou-se ainda a presença de transcritos do gene PRP1 a partir de RNA total de fomas amastigotas de L. amazonensis. Os mesmos resultados foram observados a partir de RNA total de formas promastigotas e amastigotas de L. major, porém nesse caso a síntese de cDNA foi realizada a partir de oligodT (Fig. 9C), diferentemente dos dados observados nas Figuras 9A e 9B, cujos cDNAs foram sintetizados a partir de um iniciador interno do gene PRP1 de L. major. Nesse caso um fragmento específico de cerca de 80 pb foi amplificado por RT-PCR. Esses

Resultados dados indicam que o gene PRP1, assim como para outros genes dos transportadores ABC de Leishmania, apresentam baixos niveis de transcritos, sendo raramente detectados por Northern blot (HENDERSON et al., 1992; PAPADOPOULOU et al., 1994; KATAKURA et al., 1999; PARODI-TALICE et al., 2003) e que sua expressão ocorre em ambas as formas evolutivas do parasito. Dados recentes têm confirmado esses achados e mostram que não existe uma regulação estágio específica de sua expressão gênica em L. infantum (LEPROHON et al., 2006).

Figura 8. Análise por Southern blot do DNA genômico de Leishmania spp. Cerca de 5 µg de DNA

genômico foi digerido, fracionado em gel de agarose 0,9%, transferido para membrana de nylon e hibridizado com as seguintes sondas. (A) Fragmento de DNA de PvuII 1,2 kb correspondendo ao segunda região transmembrana da PRP1 de L. major. (B) Fragmento de DNA de PstI 0,8 kb correspondendo ao primeiro domínio de ligação de ATP da PRP1 de L. major (sonda NBDI) (Fig. 1D). Os marcadores de peso molecular são derivados do DNA do fago λ digerido com HindIII. Os números correspondem ao DNA genômico de (1)

Resultados

Figura. 9. Análise do RNAm do gene PRP1 em Leishmania spp. Produtos de RT-PCR amplificados

com os iniciadores degenerados NBD1F e NBD1R em (A) e (B) e os iniciadores PRP1F2 e PRP1R2 em (C), analisados em eletroforese em gel de agarose 1,2%. Para a síntese de cDNA foi utilizado um iniciador específico do gene PRP1 de L. major (PRP1R) em A e B e oligodT em C em presença de Transcriptase Reversa (+). Para o controle negativo da reação da Transcriptase Reversa, a mesma reação foi realizada em ausência de Transcriptase Reversa (-). Nenhuma amplificação foi obtida em ausência de cDNA. (A) RT- PCR realizado a partir de RNA total de formas promastigotas. (B) RT-PCR realizado a partir de RNA total de formas amastigotas. (C) RT-PCR realizado a partir de RNA total de formas promastigotas (1) e amastigotas (2). Legenda: La – L. amazonensis; Lb – L.

Resultados