• Sonuç bulunamadı

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ"

Copied!
125
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

İNSAN SPERMLERİNDE KRİYOPREZERVASYON SONRASI PAPAVERİN UYGULAMASININ SPERM PARAMETRELERİ VE APOPTOZ ÜZERİNE

ETKİSİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Ebru İBİŞ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ANKARA 2020

Her hakkı saklıdır

(2)

ii ÖZET

Doktora Tezi

İNSAN SPERMLERİNDE KRİYOPREZERVASYON SONRASI PAPAVERİN UYGULAMASININ SPERM PARAMETRELERİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİSİNİN

DEĞERLENDİRİLMESİ

Ebru İBİŞ

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Nursel GÜL

Sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu (KP), fertilite koruma ve Üremeye Yardımcı Tedaviler sırasında sıklıkla başvurulan yöntemlerden biridir. Ancak KP ve çözme işlemleri sonrasında sıcaklık değişimleri, ozmotik şok, Reaktif Oksijen Türlerinin (ROT) oluşumu, Lipit Peroksidasyonu gibi etkenler spermlerde geriye dönüşümsüz hasarlar oluşturmaktadır.

Mitokondriyal membran potansiyelindeki azalmaya ve membran hasarına bağlı olarak hücredeki Na+, K+, H+, HCO3- ve Ca2+ iletimini sağlayan CNG, voltaj bağımlı kanallar, CATSPER gibi kanalların ve membran reseptörlerinin işlevinde değişimler olmaktadır. KP’nin en yaygın olumsuz etkisi sperm canlılığı ve hareketliliğindeki azalmadır. Çalışmamızda Fosfodiesteraz10A (FDE10A) spesifik inhibitörü olan Papaverin (PAP) kullanılarak hücre içindeki cAMP ve cGMP yıkımının inhibisyonuyla sperm hareketliliğinde artış sağlanmıştır.

Normozoospermik 20 kişinin sperminin hareketlilik, Akrozom Bütünlüğü (AB), Fosfatidil Serin Translokasyonu (FST), canlılık ve DNA hasar oranı belirlenerek hücreler dondurulmuştur. KP sonrası çözdürülen spermlere PAP uygulanmış, 30. ve 60. dakikalarda motilite aktivasyonu, canlılık oranı, Akrozom Reaksiyonu (AR), apoptoz, ve DNA hasarı oluşumu incelenmiştir. PAP etkinliğinin tespitinde immünfloresan boyamayla Floresan Mikroskopta görüntüleme sonrası Flow Sitometri yöntemi kullanılmıştır. Bulgularımız KP işleminin sperm hücrelerinin canlılık ve hareketliliğinde azalmaya ve DNA hasarında artışa yol açtığını göstermektedir. KP sonrası AB ve erken apoptoz oluşumu belirteçlerinden FST oranlarında değişim gözlenmemiştir. PAP uygulanan spermler kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, total sperm motilitesi 30.

(%32,14±6,90 ve %25±6,15; p<0,001) ve 60. dakikada (31,84±7,32 ve 25,72±6,23; p=0,001) artmıştır. PAP varlığında 30-60 dakika arasında AB, FST ve DNA hasarı oranlarında değişim olmamıştır. Ancak PAP varlığında 30. dakika ile karşılaştırıldığında 60. dakikada AnneksinV(- )/ Propidium Iodide(-) hücrelerde azalma (%32,64±12,88 ve %29,29±11,78; p=0,019) ve PI(+) hücre sayısında istatistiksel olarak anlamlı olmasa da hafif artış olduğu belirlenmiştir (p=0,066).

Temmuz 2020, 110 sayfa

Anahtar Kelimeler: Papaverin, sperm, kriyohasar, apoptoz, DNA fragmantasyonu, floresan mikroskop, flow sitometri.

(3)

iii ABSTRACT

Ph.D. Thesis

EVALUATION OF THE EFFECT OF PAPAVERINE APPLICATION AFTER CRYOPRESERVATION ON SPERM PARAMETERS AND APOPTOSIS IN HUMAN

SPERM Ebru İBİŞ

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology

Supervisor: Prof. Dr. Nursel GÜL

Sperm cell cryopreservation (KP) is one of the methods frequently used during fertility preservation and reproductive aids. However, factors such as temperature changes, osmotic shock, formation of Reactive Oxygen Species (ROT), and Lipid Peroxidation cause irreversible damage to spermatozoa. Due to the decrease in mitochondrial membrane potential and membrane damage, there are changes in the function of channels and membrane receptors such as CNG, voltage dependent channels, CATSPER, which provide the transmission of Na +, K +, H +, HCO3- and Ca2 + in the cell. The most common negative effect of KP is the decrease in sperm viability and motility. In our study, an increase in sperm motility was achieved by inhibition of the destruction of cAMP and cGMP in the cell using Papaverine (PAP), a specific inhibitor of Phosphodiesterase10A (FDE10A). Cells were frozen by determining the motility, Acrosome Integrity (AB), Phosphatidyl Serine Translocation (FST), viability and DNA damage rate of 20 normozoospermic sperm. PAP was applied to the thawed sperm after KP, and motility activation, Acrosome Reaction (AR), viability rate, apoptosis and DNA damage formation were examined at 30 and 60 minutes. For determining PAP effectiveness, Flow Cytometry method was used after imaging under fluorescent microscopy by immunofluorescence. Our findings show that KP treatment leads to a decrease in viability and motility of sperm and an increase in DNA damage. There was no change in FST rates, which are among the markers of AB and early apoptosis formation after KP. Compared with the control group of sperm administered with PAP, total sperm motility was 30 (32.14 ± 6.90% and 25 ± 6.15%; p <0.001) and 60 minutes (31.84 ± 7.32 and 25.72 ± 6.23; p = 0.001). In the presence of PAP, there was no change in the rates of AB, FST and DNA damage between 30-60 minutes. However, in the presence of PAP, compared to the 30th minute, in the 60th minute, AnneksinV (-) / Propidium Iodide (-) cells decreased (32.64 ± 12.88% and 29.29 ± 11.78; p = 0.019) and although it is not statistically significant (p = 0.066) the number of PI (+) cells slightly increased.

July 2020, 110 pages

Key Words: Papaverine, sperm, cryodamage, apoptosis, DNA fragmentation, fluorescent microscope, flow cytometry.

(4)

iv TEŞEKKÜR

Doktora eğitimim boyunca bana rehberlik eden, bilgi ve tecrübeleriyle yol gösteren, ilgisi ve manevi desteğiyle her zaman yanımda olan ve öğrencisi olmaktan mutluluk duyduğum çok değerli danışman hocam Prof. Dr. Nursel GÜL’e, (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı),

Tez çalışmamda eş danışmanlık yapan, deneylerin yürütülmesinde bütün laboratuvar imkanlarından faydalanmamı sağlayan, pratik çözümleri, engin bilgisi ve deneyimi ile yoluma ışık tutan ve her koşulda bilgisini ve desteğini esirgemeyen değerli hocam Doç.

Dr. Sinan ÖZKAVUKÇU’ya, (Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı),

Laboratuvar çalışmalarım sırasındaki yardımlarıyla hep yanımda olan Dr. Derya ÖZDEMİR TAŞ’a ve Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Tüp Bebek Merkezi Kliniğindeki değerli çalışma arkadaşlarıma,

Eğitimimin her aşamasında varlıklarını yanımda hissettiğim, maddi manevi destekleriyle beni bir an bile yalnız bırakmayan canım annem, babam ve kardeşime sonsuz teşekkür ederim.

Ebru İBİŞ

Ankara, Haziran 2020

(5)

v

İÇİNDEKİLER

TEZ ONAYI

ETİK ... i

ÖZET ... ii

ABSTRACT ... iii

TEŞEKKÜR ... iv

SİMGELER DİZİNİ ... ix

ŞEKİLLER DİZİNİ ... xiii

ÇİZELGELER DİZİNİ ... xv

1. GİRİŞ ... 1

2. KURAMSAL TEMELLER ... 5

2.1 Erkek Üreme Sistemi ... 5

2.1.1 Testisler ... 5

2.1.1.1 Seminifer tübüller ... 6

2.1.1.2 Sertoli hücreleri ... 6

2.1.1.3 Leydig Hücreleri ... 7

2.1.2 Genital kanal sistemi ... 8

2.1.2.1 Epididimis ... 8

2.1.2.2 Vas deferens ... 9

2.1.3 Aksesuar cinsiyet bezleri ... 9

2.1.3.1 Veziküla Seminalis (seminal vezikül) ... 9

2.1.3.2 Prostat bezi ... 10

2.1.3.3 Cowper bezleri ... 10

2.1.4 Penis ... 10

2.2 Spermatogenez... 11

2.2.1 Spermatogonyal faz ... 12

2.2.2 Spermatosit (Mayoz) fazı ... 13

2.2.3 Spermiyogenez ... 13

2.2.3.1 Golgi fazı ... 14

2.2.3.2 Başlık fazı ... 15

2.2.3.3 Akrozom fazı... 15

2.2.3.4 Olgunlaşma fazı ... 15

(6)

vi

2.2.3.5 Sperm kapasitasyonu ve akrozom reaksiyonu ... 16

2.2.4 Sperm hücresinin yapısı ... 17

2.2.4.1 Baş yapısı ... 18

2.2.4.2 Kuyruk yapısı ve hareketlilik ... 18

2.3 Semenin Yapısı ve Semen Analizi ... 21

2.3.1 Semen analizi ... 21

2.3.1.1 Sperm Sayısı ve hareketliliği ... 22

2.3.1.2 Sperm canlılığı ... 24

2.3.1.3 Sperm Morfolojisi ... 24

2.3.1.4 Sperm Fonksiyonu ... 25

2.3.1.5 Sperm DNA hasarı ... 26

2.4 Kriyoprezervasyon ... 27

2.4.1 Kriyoprotektan maddeler ... 29

2.4.1.1 Hücre içine nüfuz eden KPM’ler ... 29

2.4.1.2 Hücre içine nüfuz etmeyen KPM’ler ... 29

2.4.2 Sperm kriyoprezervasyonu ... 30

2.4.2.1 Kontrollü yavaş dondurma ... 30

2.4.2.2 Vitrifikasyon ... 30

2.4.2.3 Azot buharında dondurma ... 30

2.4.3 Çözdürme prosedürü ... 31

2.5 Kriyohasar ... 31

2.5.1 Membran hasarı ... 32

2.5.2 Mitokondriyal hasar ... 33

2.5.3 ROT oluşumuna bağlı hasarlar ... 34

2.5.4 Apoptoz ... 35

2.5.4.1 Hücre dışı yol ... 35

2.5.4.2 Hücre içi yol ... 35

2.5.4.3 Spermde apoptoz oluşumu ... 37

2.5.5 DNA hasarı oluşumu ... 38

2.6 Fosfodiesterazlar ve İnhibitörleri ... 39

2.6.1 FDE etki mekanizmaları ve sınıflandırılmaları ... 39

2.6.2 FDE inhibitörleri ... 44

2.6.2.1 Papaverin ... 46

(7)

vii

2.7 Sperm Kuyruk Hareketinin Etkinlik Mekanizması ... 47

3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 50

3.1 Materyal ... 51

3.1.1 Sperm hücrelerinin ayrıştırılması ... 51

3.1.2 Sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu ve çözdürülmesi ... 51

3.1.3 PAP uygulaması ... 51

3.1.4 CASA ile semen analizi ... 51

3.1.5 Peanut Agglutinin-Fluorescein İsothociyanate (PNA-FITC) boyama ile AB tespiti, FM ve FLS tekniği ... 51

3.1.6 AnnexinV-FITC/PI boyama ile apoptoz ve canlılık tespiti, FM ve FLS tekniği ... 52

3.1.7 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Transferase Mediated Nick End-Labeling (TUNEL) boyama ile DNA hasarı tespiti, FM ve FLS tekniği ... 52

3.2 Yöntem ... 52

3.2.1 Ön deneyler ... 52

3.2.2 Deneyler ... 53

3.2.2.1 KP ve çözme prosedürü ... 54

3.2.2.2 PAP uygulaması ... 54

3.2.2.3 CASA ile hareketlilik ölçümleri ... 54

3.2.2.4 PNA-FITC boyama yöntemi ile AB’nin tespiti ... 55

3.2.2.5 AnnexinV-FITC/PI boyama ile apoptoz ve canlılık tespiti ... 55

3.2.2.6 TUNEL boyama ile DNA hasarı tespiti ... 56

3.2.2.7 İstatistiksel analiz ... 57

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ... 58

4.1 Ön Deney Bulguları: ... 58

4.2 Deney Bulguları ... 59

4.2.1 CASA motilite ölçümleri... 59

4.2.2 PNA-FITC boyama yöntemi ile AB tespiti deneylerinde FM ve FLS bulguları ... 62

4.2.3 AnV-FITC/PI boyama yöntemi ile apoptoz oluşumu ve canlılık deneylerinde FM ve FLS bulguları ... 66

4.2.4 TUNEL boyama yöntemi ile DNA hasarı oluşumu tespitinde FM ve FLS bulguları ... 72

5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 77

(8)

viii

KAYNAKLAR ... 92 EK 1 ETİK KURUL ONAYI ... 108 ÖZGEÇMİŞ ... 110

(9)

ix

SİMGELER DİZİNİ

% Yüzde

cm Santimetre

ml Mililitre

µ Mikro

µm Mikrometre

μM Mikromolar

μl Mikrolitre

g Merkezkaç kuvveti

°C Santigrat derece

pH Bir çözeltinin asit veya bazlık derecesini belirten ölçü birimi e- Elektron

Ca⁺² Kalsiyum

CHO3- Bikarbonat

K+ Potasyum

Na+ Sodyum

O2 Oksijen

H+ Hidrojen

O2⋅ Süperoksit radikali • OH Hidroksil radikali H2O2 Hidrojen Peroksit

ΔΨm Mitokondriyal membran potansiyeli Km Michaelis sabiti

Vmax Sistemden elde edilebilecek en yüksek reaksiyon hızı

Kısaltmalar

AB Akrozom Bütünlüğü ABP Androjen Bağlayıcı Protein AC Adenilat Siklaz

(10)

x AI İntak(bütün) Akrozom

AIF Apoptoz indükleyici faktör AKAP A Kinaz bağlayıcı protein

ALH Lateral düzlemde başın yer değiştirme büyüklüğü AOT Akridin Oranj Testi

APAF Apoptotik proteaz aktive edici faktör AR Akrozom Reaksiyonu

ATP Adenozin Trifosfat BCF Çapraz geçiş freaknsı CAD Kaspaz aktive edici Dnase cAMP Döngüsel Adenozin Monofosfat CASA Bilgisayar destekli sperm analizi CAT Katalaz

CATSPER2 Sperm katyon kanalı CBF Kuyruk atım sıklığı

cGMP Döngüsel Guanozin Monofosfat CMA3 Kromomisin A3

COMET Tek hücre elektroforezi DAG Diaçil Gliserol

DISC Death Inducing Signal Complex DNA Deoksiribo Nükleik Asit

ERK Reseptör Tirozin Kinaz ETC Elektron taşıma zinciri FDE Fosfodiesteraz

FDE-İ Fosfodiesteraz inhibitörü FISH Foresan Insitu Hybridization FITC Floresan izotiyosiyanat FLS Flow Sitometri

FS Fosfatidil Serin

FST Fosfatidil Serin Translokasyonu GnRH Gonadotropin salgılayıcı hormon GPXs Glutatyon Peroksidaz

(11)

xi HOS Hipoozmotik şişme testi

IP3 Inositol-3-Fosfat KP Kriyoprezervasyon KPM Kriyoprotektan Madde LIN Doğrusallık

LPO Lipit Peroksidasyonu PAF Platelet aktive edici faktör PAP Papaverin

PAS Periyodik Asit Schiff

PBS Fosfat tamponlu tuz çözeltisi PFA Paraformaldehit

PIP2 Fosfoinozitolbifosfat PKA Protein Kinaz A PKC Fosfokinaz C PKG Fosfokinaz G PLC Fosfolipaz C PNA Peanut Agglutinin PRDXs Peroredoksinler

PSA Prostat Spesifik Antijen PUFA Çoklu doymamış yağ asidi ROT Reaktif Oksijen Türleri sAC Çözünebilir Adenilat Siklaz SCD Sperm kromatin saçılım analizi SCSA Sperm kromatin yapı analizi sER Granüllü endoplazmik retikulum SOD Süperoksit Dismutaz

STR Ortalama yörünge doğrusallığı TEKT2 Tektin2

TESA Testiküler Sperm Aspirasyonu TESE Testiküler Sperm Ekstraksiyonu tmAC Transmembran Adenilat Siklaz TNFR Tümör Nekroz Faktör Reseptörü

(12)

xii TNFα Tümör Nekroz Faktörü α

TRAIL Tümör nekroz faktörü apoptoz kaynaklı indükleyici faktör TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling VAP Ortalama yol hızı

VCL Eğriçizgisel hız VSL Doğrusal hız WOB Dalgalanma

(13)

xiii

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Erkek üreme sistemi ... 5

Şekil 2.2 Testis’in yapısı ... 6

Şekil 2.3 Spermatogenez ... 12

Şekil 2.4 Spermiyogenez ... 14

Şekil 2.5 İnsan sperminde kuyruk yapısı (A) ve elektron mikroskop görüntüsü (B) ... 20

Şekil 2.6 CASA motilite parametreleri ... 24

Şekil 2.7 Sperm hücrelerinde kriyohasar oluşumu ... 32

Şekil 2.8 Sperm hücrelerinde apoptoz oluşumu: A- ROT ve apoptotik yolağın aktivasyonu, B- serbest radikallerin oluşumu ... 37

Şekil 2.9 Döngüsel nükleotid yapısı ve FDE bağlanma bölgesi ... 39

Şekil 2.10 FDE’lerin yapısal olarak sınıflandrılması ... 40

Şekil 2.11 PAP ve kimyasal yapısı ... 46

Şekil 2.12 Sperm hareketinin etkinlik mekanizması ... 48

Şekil 3.1 Deney planı şeması ... 53

Şekil 4.1 CASA motilite tespiti ve farklı PAP dozlarının zamana bağlı ileri motilite (%) değişim grafiği. ... 58

Şekil 4.2 Deney gruplarının A, B, C, TM grup hareketlilik ortalamaları. ... 60

Şekil 4.3 PNA boyama sonrası FM görüntüleri. ... 62

Şekil 4.4 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 Deney gruplarının AB oranları ... 62

Şekil 4.5 Deney gruplarının AB ortalama değerleri... 65

Şekil 4.6 AnV/PI boyama sonrası FM görüntüleri. ... 66

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. ... 67

Şekil 4.8 Deney gruplarının apoptoz ve canlılık oranları dağılımı. ... 70

Şekil 4.9 TUNEL boyama sonrası FM görüntüleri. ... 72

(14)

xiv

Şekil 4.10 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 deney gruplarının DNA

hasarı oranları ... 73 Şekil 4.11 Deney gruplarının DNA hasarı oranları. ... 76 Şekil 5.1 Hamster sperm hücreleri üzerinde PF’nin etkinlik mekanizması ... 85

(15)

xv

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1 WHO (World Health Organization) 2010’a göre sperm normal

değerleri ... 23 Çizelge 4.1 Deney gruplarının A, B, C grup hareketlilik ortalamaları. ... 59 Çizelge 4.2 Deney gruplarının CASA hareketlilik parametrelerinin ortalama

değerleri. ... 61

(16)

1 1. GİRİŞ

Fertilizasyonun gerçekleşmesi için en önemli faktörlerden biri sperm hücrelerinin hareketliliğidir. Farklı nedenlerle sperm hücrelerinin hareketlilik özelliklerinde ortaya çıkan kayıplar nedeniyle kişilerin üreme sağlığı olumsuz etkilenmekte ve üremeye yardımcı çeşitli tedavi yöntemlerinin kullanımına ihtiyaç duyulmaktadır. Düzenli cinsel ilişkiye rağmen 1 yıl boyunca gebelik elde edilememesi durumu olarak tanımlanan infertilite, dünya genelinde evli çiftlerin yaklaşık % 15’ini etkileyen bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Tüm infertilite olguları göz önüne alındığında bölgesel farklılıklara bağlı olarak erkek infertilitesinin katkısının yaklaşık % 20-70 aralığında değişim gösterdiği düşünülmektedir (Agarwal vd. 2015).

Sperm hücrelerinin dondurularak saklanması infertilite tedavileri sırasında sık kullanılan bir yöntemdir. Kanser hastalarında kemoterapi ve radyoterapi öncesi üreme hücrelerinin korunması amacıyla, diyabet, otoimmün hastalıklar gibi testiküler hasara yol açabilecek hastalıklarda, oligospermi ve ejekülatör düzensizliklerde, sperm bankası-donasyon uygulamalarında ve ejekülatında hücre bulunmayıp testiküler sperm elde edilebilen (azoospermi) hastalarında sonraki ÜYTE (Üremeye Yardımcı Tedavi) uygulamalarında kullanılmak üzere sperm hücreleri dondurularak uzun yıllar saklanabilmektedir (Hamada vd. 2014, Costa vd. 2019).

Ancak çeşitli nedenlerle dondurulduktan sonra infertilite tedavilerinde kullanılmak üzere çözülen spermlerde canlılık ve motilite kaybı başta olmak üzere apoptoz ve DNA hasarı oluşumunda artış gibi olumsuz etkilerin ortaya çıktığı bilinmektedir. Günümüzde sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonunda farklı prosedürler ve çok sayıda Kriyoprotektan Maddenin (KPM) kullanılması söz konusudur. KP ve çözme işlemi sonrasında sperm hücrelerinin sağkalım oranları ve hareketlilik özelliklerinde ortaya çıkan olumsuz ve çoğu zaman geriye dönüşümsüz etkileri en aza indirgemek için bu alanda yapılan çalışmalar gücelliğini korumaktadır. KP sonrasında hücrelerde ortaya çıkan kriyohasar; tercih edilen KP yöntemi, KPM etkinliği ve ortama ilave edilen bazı koruyucu maddelerin (antioksidanlar, vitaminler vb.) etkilerinin yanı sıra dondurulan spermlerin fizyolojik özellikleriyle de yakından ilişkilidir. Özellikle normozoospermik

(17)

2

örneklere kıyasla, düşük kalitedeki sperm hücrelerinin dondurulmasının canlılık oranlarında daha fazla azalma ve DNA fragmantasyonu oluşumunda artış olduğunu bildiren çalışmalar vardır (Said vd. 2010, Paoli vd. 2014).

Sperm hücrelerinin dondurulması esnasında hücre içinde ve hücre dışında buz kristallerinin oluşumuyla birlikte ortaya çıkan ısı şoku, hücre dehidrasyonu ve ozmotik stres membran stabilitesini etkileyen faktörlerdir. KP işlemi membran lipitlerinin yanı sıra iyon transferi ve metabolizmasından sorumlu olan çeşitli membran proteinlerinin de fonksiyonlarında kayba yol açmaktadır (Rossato vd. 2000, Hamada vd. 2014). Bununla birlikte spermlerin mebran içerikli yapılarında da membran şişmesi, akrozomal sızıntı ve dejenerasyon gibi geriye dönüşümsüz değişimlerin olduğu gözlenmiştir (Royere vd.

1996). KP’nin olumsuz etkileri olarak çeşitli araştırmalarda apoptoz belirteçlerinden Fosfatidil Serin Translokasyonu (FST), kaspaz aktivasyonu ve DNA hasarı oluşumunda artışın olduğu açıklanmıştır (Glander ve Schaller 1999, Grunewald vd. 2005, Kalthur vd. 2008, Thomson vd. 2009a, Pini vd. 2018).

Literatürde KP işleminin en belirgin etkisi olarak çözme sonrası hücrelerin özellikle canlılık oranlarındaki %30-50‘ye varan düşüşe dikkat çekilmektedir (Esteves vd. 2000, Donnelly vd. 2001, Nijs ve Ombelet 2001, O'connell vd. 2002, Ozkavukcu vd. 2008).

Çözme sonrası membran bütünlüğünde kayıplar, ikincil mesajcıların işlevinde ve iyon transportunda değişim, mitokondriyal hasar, DNA ve nükleer proteinler arasındaki düzensiz iletişim ve aksonemal yapıdaki bozulmaların ortaya çıktığı bilinmektedir.

Sperm plazma membranına benzer şekilde mitokondriyel membranlar da KP’ye karşı hassastır. Mitokondrilerde oksidatif fosforilasyon veya glikolizis yoluyla üretilen ATP mikrotübüllere iletilerek sperm motilitesini sağlamaktadır. Bu nedenle mitokondriyal membranlarda oluşacak hasarın sperm hareketliliğinde azalmaya yol açtığı saptanmıştır (Marchetti vd. 2002, Wang vd. 2003a, Amaral vd. 2013, Agnihotri vd. 2016).

Üremeye Yardımcı Tedavilerde sperm motilitesini artırıcı maddelerin kullanılması aşılama uygulamasında (İntrauterin insemination, IUI) sperm hücrelerinin yumurtaya ulaşma şansını artırırken, ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) uygulamalarında canlı ve hareket kinematiği yüksek sperm hücrelerinin tespiti için de önemlidir. In vitro

(18)

3

koşullarda motilite aktivatörü olarak çeşitli Fosfodiesteraz İnhibitörü (FDEİ) maddeler kullanılmaktadır. Sperm hücrelerindeki cAMP (3',5'-cyclic adenosine monophosphate) veya cGMP’nin (3',5'-cyclic guanosine monophosphate) hidrolizine yol açan Fosfodiesterazların (FDE) inhibe edilmesi suretiyle hücre içindeki ikincil mesajcıların artışı hedeflenmektedir. Bu sayede cAMP ve cGMP’nin katalize ettiği sinyal yolaklarının ve buna bağlı gelişen hücresel yanıtların devamlılığı sağlanır. Bir FDE10A inhibitörü opoid alkoloid olarak tanımlanan PAP; sperm hücrelerinde hem cAMP, hemde cGMP'nin FDE’ler tarafından hidrolizini engelleyerek, döngüsel ikincil mesajcıların hücre içi konsantrasyonunun artışını sağlamada etkilidir. PAP’ın insan spermleri üzerindeki etkinlik mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte FDE’lerin inhibisyonu sonucu hücre içi konsantrasyonu artan cAMP'nin Protein Kinaz A’yı (PKA) aktive ederek tirozin fosforilasyonunu artırması ve progesteron bağımlı Ca⁺² kanallarının açılmasına neden olduğu düşünülmektedir (Bergeron vd. 2017). Hücre içinde cGMP’nin artışıyla, CNG (Cyclic Nucleotide Gate) kanallarının açılmasına bağlı olarak hücre içi Ca⁺² düzeyinde artış gerçekleşir. Bu aşamada hücre içindeki çözünebilir Adenil Siklazların (sAC, soluble Adenylyl Cyclase) aktivasyonu neticesinde ATP’den (Adenosine Triphospate) cAMP oluşumu artmakta ve kuyruk hareketliliğinde etkili olan proteinlerin fosforilasyonundaki artışı takiben spermlerde motilite artışı gerçekleşmektedir (Luconi vd. 2006, Pereira vd. 2017). İnsan sperm hücrelerinde cAMP düzeyindeki artışla birlikte, PKA’nın R2 alt ünitesi aracılığıyla kuyruk fibröz kılıf proteinlerinden hAKAP82 ve pro-hAKAP82’ye bağlanması ve artan tirozin fosforilasyonu sonucunda spermin kapasitasyon-hiperaktivasyonunu tetikleyici etki göstermektedir (Turner vd. 1999, Signorelli vd. 2012).

PAP, düz kaslar üzerinde spazmolitik etki göstermesi nedeniyle erektil disfonksiyonun tedavisinde klinik olarak kullanılmaktadır. Ancak literatürde PAP’ın in vitro koşullarda insan ve hayvan sperm hücreleri üzerindeki etkinliğini irdeleyen çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. İnsan spermlerinde tespit edilmiş olan çeşitli tipteki FDE’lerin sperm hücrelerinin farklı bölgelerinde, sitoplazma ve membranın yanısıra seminal plazmada da bulunduğu bilinmektedir (Fisch vd. 1998, Lefievre vd. 2000). Yakın zamanda insan seminal plazmasındaki FDE’ler içinde en yaygın olarak FDE 4 ve 11’in varlığı tespit edilmiştir. Aynı çalışmada insan spermlerinde en fazla eksprese edilen grubun ise FDE

(19)

4

10 olduğu açıklanmıştır (Marechal vd. 2017). Biz de spesifik bir FDE10 inhibitörü olması nedeniyle insan spermlerinde motilite artışını sağlamada PAP’ın etkili bir aktivatör olacağını düşünmekteyiz. KP sonrası hareketliliği arttırmak için ÜYTE uygulamalarında kullanılan maddelerin hücrede toksik etki yaratmaması fertilizasyon başarısı ve oluşacak embriyoların gelişimi için en önemli koşuldur. Bu nedenle KP sonrası spermlere uyguladığımız PAP‘ın, kriyohasara uğramış hücrelerdeki etkinliğinin yanı sıra fizyolojik veya fonksiyonel olarak istenmeyen etkilere de yol açıp açmayacağını belirlemek amacıyla çalışmamızda sperm hücrelerinde Akrozom Bütünlüğü (AB), FST ve DNA hasarı oluşumu da incelenmiştir.

Çalışmamızdaki hedeflerimiz;

• Dondurma-çözme işlemi sonrası sperm hücrelerinde meydana gelebilecek canlılık ve hareketlilik oranlarındaki değişimi saptamak ve PAP’ın sperm kalitesini etkileyen bu değişimler üzerindeki etkinliğini ölçmek,

• İlk defa insan sperm hücrelerinde PAP uygulamasının sperm DNA hasarı oluşumu üzerindeki etkisini tespit etmek,

• KP sonrası insan ejekülat sperminde bir FDE10A spesifik inhibitörü olarak kullanılacak olan PAP’ın, hücre zarında ortaya çıkabilecek hasara bağlı olarak Akrozom Reaksiyonu (AR) ve FST oluşumuna etkisi olup olmadığını belirlemek,

• Sperm hücrelerinde FST ile erken apoptoz oluşumu ile DNA hasarı oluşumu arasındaki korelasyonun değerlendirilmesi bakımından literatürdeki çelişkili bulgulara katkıda bulunmak,

• In vitro koşullarda insan spermlerinde motilite artışını sağlamak için PAP uygulamasının güvenilirliği konusunda elde edilecek veriler ışığında In Vitro Fertilizasyon (IVF) laboratuvar uygulamalarına katkı sunmaktır.

(20)

5 2. KURAMSAL TEMELLER

2.1 Erkek Üreme Sistemi

Erkek üreme sistemi, skrotum içinde iki testis, epididim, genital kanallar, çeşitli salgı bezleri ve penisten oluşmaktadır. Bu sistemin işleyişiyle, spermatogenezle haploid kromozomlu germ hücresi olan spermatozoonun üretilerek depolanmasının yanı sıra steroidogenez olarak adlandırılan androjen hormonların sentezi gerçekleştirilmektedir.

Şekil 2.1 Erkek üreme sistemi (Ross vd. 2016)

2.1.1 Testisler

Yetişkin erkeklerde testisler,Tunika albuginea adı verilen bağ doku kapsülü tarafından çevrilmiş oval şekilde bir çift organ olup, 10-15 gr ağırlıkta ve skrotumda yerleşiktir.

Tunika albugineanın testisin arka duvarında kalınlaşması mediastnum testis yapısını meydana getirirken, fibröz uzantıların bez içine girmesi de lobüler bir yapının oluşmasına neden olur. Testisteki yaklaşık 250 civarı lobülün her birinde bağ dokuyla çevrili, kıvrımlı yapıda 1-4 seminifer tübül ve Leydig hücreleri yer almaktadır.

(21)

6

Şekil 2.2 Testis’in yapısı (Kierszenbaum ve Tres 2016)

2.1.1.1 Seminifer tübüller

Sperm hücrelerinin üretildiği bölüm olan seminifer tübüller, çok katlı epitelle döşeli ve ortada bir lümene açılmaktadırlar. Her testiste 250-1000 tane bulunan seminifer tübülün toplam uzunluğu yaklaşık 250 metredir. Tübüller sonlanmaya yakın daralmak suretiyle tubuli rekti adı verilen yapıyı oluştururlar. Düz tübüller ise, ağsı-boşluklu yapıya sahip epitel döşeli kanallar olan Rete testise bağlanır. Rete testisi epididime bağlayan 10-20 adet boşaltım kanalı duktus efferentes olarak adlandırılır. Seminifer tübüller içindeki çok katlı epitel, Sertoli hücreleri ve spermatogenik hücre serisini ihtiva etmektedir (Ross vd. 2016).

2.1.1.2 Sertoli hücreleri

Sertoli hücreleri seminifer tübül bazal laminasında, prizmatik epitel şeklindeki görüntüsü ile ilk olarak Enrico Sertoli tarafından tanımlanmıştır. Puberteden sonra replikasyona girmeyen Sertoli hücreleri, seminifer epitel hacminin %30’unu oluşturur ve bazal laminaya yapışık şekilde lümene kadar devam ederler. Her Sertoli hücresi 30- 50 kadar germ hücresinin gelişimine katkıda bulunmaktadır. Bol sayıda granüllü endoplazmik retikulum (gER), Golgi kompleksleri, lizozom ve mitokondri ihtiva eden Sertoli hücrelerinin çekirdekleri oval veya üçgensi görünümde ve oldukça belirgindir.

(22)

7

Sertoli hücreleri yanlara uzanan sitoplazmik uzantılarla birbirlerine tutunurken bu uzantılar arasında yerleşen germ hücrelerini de izole ederler. Yan yana dizilmiş Sertoli hücreleri sıkı bağlantılarla birbirlerine bağlanıp kan-testis bariyerini oluştururlar ve seminifer tübüllerin germ hücreyle döşenmiş olan duvarını bazal ve luminal kompartman olarak 2 bölüme ayırırlar. Spermatogonyumlar ve genç spermatositler bu bariyerin altındaki bazal kompartmanda yerleşirken; spermatositler, spermatidler ve spermatozoa luminal kompartmanda yer alır. Mayozun ilerleyen safhalarında spermatositler haploid hale gelirken luminal bölgeye doğruda ilerleme gösterirler.

Burada kan-testis bariyerinin işlevi dış ortamdan farklı bir mikroçevre yaratarak farklılaşmakta olan spermatositlerin immün yanıta maruz kalmalarını önlemektir.

Sertoli hücreleri arasındaki bağlantılar (gap-junction) ise hücreler arasındaki iyon ve kimyasalların geçişine olanak sağlamaktadır. Ortamdan izole edilen germ hücrelerinin beslenme ve hormonal etkileşimi sertoli hücreleri tarafından sağlanmaktadır.

Spermatogenik serinin hücreleri birbirlerine sitoplazmik köprülerle bağlı bir ağ şeklinde olup, Sertoli hücrelerinin sitoplazmik dallanmalarıyla desteklenirler. Sertoli hücreleri tarafından salgılanan Androjen Bağlayıcı Protein (ABP) testosterona bağlanarak lümene ve epididime taşınmasına ve spermatogenezin devamlılığı için gerekli olan yüksek testosteron konsantrasyonuna ulaşılmasına aracılık etmektedir. Sertoli hücrelerinden salgılanan İnhibin de FSH salınımının düzenlenmesinde etkilidir. Bu hücreler ayrıca tübül boyunca spermlerin ilerlemesini kolaylaştıran sıvı salgılamak ve spermatidlerin farklılaşması sırasında ortaya çıkan debrisi fagosite etmek gibi farklı işlevlerden de sorumludurlar (Junqueria vd. 2009, Kierszenbaum ve L.L. 2016, Ross vd. 2016).

2.1.1.3 Leydig Hücreleri

Testis ve seminifer tübüller arasındaki interstisyel dokuda fibroblast içeren bağdoku, lenf ve kan damarları ile Leydig hücreleri bulunur. Leydig hücreleri, büyük yuvarlak veya poligonal hücreler olup pubertede gelişirler. Eozinofilik sitoplazmalarında küçük lipit damlacıklar ihtiva eden bu hücrelerde santral bir çekirdek bulunur. Bu hücreler, ikincil seks karakterlerinin gelişmesini sağlayan testosteron hormonunun üretilmesinden sorumludur. Testosteron sentezi hipotalamustan GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone) salgılanmaya başlayan puberte döneminde başlamaktadır. Testosteronun

(23)

8

sentezi için gereken enzimler, salgı yapan diğer hücrelere benzer şekilde Leydig hücrelerinin granüllü endoplazma retikulumu ve mitokondri kristalarında bulunur.

Yetişkin erkeklerde dolaşımdaki testosteron düzeyi 300-1200 ng/dl civarındayken, intratestiküler alanda biraz daha yüksektir. Testislerde en yüksek testosteron seviyesi bazal membran ve seminifer tübüllerdedir (Junqueria vd. 2009, Ross vd. 2016).

2.1.2 Genital kanal sistemi

Testis içindeki genital kanalların işlevi, seminifer tübüllerden gelen spermatozoayla birlikte sıvıları duktus epididime iletmektir. Bu kanallar; tubuli rekti, rete testis ve duktuli efferentestir. Kıvrımlı yapıdaki seminifer tübüller, tubuli rekti aracılığıyla rete testise bağlanırlar. Rete testis, silindirik epitel hücrelerle döşeli kanallar ağından oluşmaktadır. Rete testisten çıkan 10-20 kadar duktuli efferentes kanalı, spermlerin epididime doğru ilerlemesinde aracılık etmektedir. Ayrıca seminifer tübüllerde salgılanan sıvının büyük kısmının geri emilimi duktuli efferenste gerçekleşir (Clulow vd. 1998).

Sperm hücrelerini testislerden penise doğru taşıyan kanal yapıları; epididimis, duktus deferens (vas deferens) ve üretradır.

2.1.2.1 Epididimis

Baş, gövde ve kuyruk bölümlerinden oluşan ve testislerin arka-üst bölümü üzerinde yerleşim gösteren 5-6 cm uzunlukta ay şeklindeki yapı epididimis olarak adlandırılır.

Baş kısmı duktuli efferentesten, gövde ve kuyruk kısmı ise duktus epididimisten meydana gelir. Testisten epididimise ulaşan spermatozoanın fertilizasyon kapasitesi ve hareketlilik kazandıkları kısım duktus epididimistir. Duktus epididimisteki esas hücreler glikoprotein, glikofosfokolin ve siyalik asit salgılamanın yanı sıra, Sertoli hücreleri tarafından elimine edilemeyen rezidüel cisimle birlikte suyu da absorbe ederler.

Epididimisin baş ve gövde kısmındaki düz kaslara, kuyrukta iç ve dış longitudinal tabakalar eklenmektedir. Baş ve gövdede yer alan düz kasların peristaltik kasılmaları,

(24)

9

sperm hücrelerini ileriye doğru iter. Düz kaslardaki şiddetli kasılmalar sonucunda olgun sperm hücreleri vas deferense doğru taşınmaktadır (Gartner ve Hiatt 2014, Ross vd.

2016).

2.1.2.2 Vas deferens

Epididim ile üretra arasındaki çok katlı prizmatik epitelle döşeli, kalın müsküler duvarlı düz kanal vas deferens olarak isimlendirilir. Bu kalın düz kaslı katman, ejakülasyon sırasında spermlerin ivmeli bir hızla çıkışına yol açan peristaltik hareketin oluşmasında etkilidir. Bu kısımda yerleşik prizmatik hücrelerin uzun mikrovillusları lümene doğru uzanmaktadır. Vas deferensin ampulla kısmı veziküla seminalisle birleşerek prostat bezinin içinde duktus ejekularyus olarak üretraya doğru ilerleme gösterir (Junqueria vd.

2009, Eroschenko ve Di Fiore 2013).

2.1.3 Aksesuar cinsiyet bezleri

Semene sıvı bileşenini veren aksesuar bezler; bir çift seminal vezikül, prostat bezi ve bulboüretral bezlerdir (Cowper bezleri).

2.1.3.1 Veziküla Seminalis (seminal vezikül)

Bir çift olarak bulunan seminal vezikülün boşaltım kanalı, duktus deferensin ampullasıyla birleşerek ejekulatör kanalın oluşmasını sağlar. Seminal vezikül duvarında mukoza, ince düz kas ve fibröz kılıf tabakaları yer almaktadır. Duvardaki mukoza örtüsü çok sayıda katlanmalarla salgı yüzeyini arttırmakla birlikte oluşan salgının da lümene akışını sağlamaktadır. Üretilen beyazımsı sarı renkli visköz yapıdaki salgının içeriğinde basit şekerler, fruktoz, aminoasitler, prostoglandinler ve askorbik asit bulunmaktadır. Sperm hareketi için gerekli olan enerji fruktozun metabolize edilmesiyle sağlanırken, düz kaslarda gerçekleşen kasılmalar da kanal içine boşaltılmış olan salgının üretradan dışarı çıkmasını kolaylaştırmakta etkilidir.

(25)

10 2.1.3.2 Prostat bezi

Mesanenin altında, pelvis içerisinde yer alan ceviz şeklindeki prostat bezi, 30-50 civarında tübüloalveolar bezden oluşmakla birlikte şeffaf ve hafif alkali bir sıvı salgılamakla görevlidir. İçten dışa mukozal tabaka, submukozal tabaka ve prostatik bezleri ihtiva eden periferik tabaka olmak üzere 3 katmandan meydana gelir. Prostat bezinin epitel hücreleri PSA (Prostat Spesifik Antijen), Prostatik Asit Fosfataz, Fibrinolizin ve Sitrik Asit enzimlerini salgılar. Fibrinolizin enzimi ejekulasyon sonrasında likefaksiyonun gerçekleşmesinde etkilidir.

2.1.3.3 Cowper bezleri

Bezelye büyüklüğünde, salgı yapmakla görevli bir çift bezden oluşan Cowper bezleri tübüloalveolar özelliktedir. Bağ dokudan oluşan fibroelastik kapsül ve interlobüler bağ doku septumunda düz kas ve iskelet kası lifleri içeren Cowper bezleri asiner yada tübüler salgı ünitelerine sahiptir. Salgı yapan hücreler küboidal, silindirik ya da yassı epitel olmakla birlikte, küçük salgı kanalları sekretuar hücrelerle, büyük kanallar ise tabakalı silindirik epitelle döşenmiştir. Bu bezlerden salgılanan mukus benzeri preseminal sıvı laktoz, galaktozamin, galakturonik asit, sialik asit ve metil pentoz içerikli olup, şeffaf renkli ve kayganlaştırıcı özelliğe sahiptir (Eroschenko ve Di Fiore 2013).

2.1.4 Penis

Dıştan deriyle sarılı olan penis, dorsal olarak yerleşik erektil doku tabakası iki korpus kavernozum ve ventral olarak yerleşimli bir korpus spingozum tabakalarından meydana gelmektedir. Korpus kavernozum endotel hücreleriyle döşeli olmakla birlikte düz kas hücreleri ve bağ doku lifleri içeren bir yapıdadır. Üretrayı çevreleyen korpus spingozum ise sona doğru genişleyerek çok katlı yassı epitel hücrelerden oluşan glans penisi oluşturur. Penil üretranın büyük kısmı ise çok katlı silindirik epitelle döşenmiştir.

Peniste vasküler boşlukların duvarındaki düz kaslar ve arteriyal kasların uyarımıyla

(26)

11

ereksiyon gerçekleşir. Vazodilatasyona neden olan parasempatik uyaranlar aracığıyla kavernöz boşluklar ve penil arterler genişler. Bu genişleme sonucunda kan akışı artarak boşluklar kanla dolmakta ve dolayısıyla ereksiyon gerçekleşmektedir. Hücre içindeki cGMP ve Ca+2 düzeyinin korpus kavernozumların kasılma ve gevşemesinde etkili rolü olduğu bilinmektedir (Junqueria vd. 2009).

2.2 Spermatogenez

Spermatogenez, mitoz ve mayoz bölünmeler sonucunda spermatogonyal kök hücrelerden spermatozoon olarak adlandırılan sperm hücrelerinin oluşum süreci olarak tanımlanmaktadır.

(27)

12

Şekil 2.3 Spermatogenez (Moore vd. 2016)

2.2.1 Spermatogonyal faz

Seminifer tübül içerisinde bazal laminanın hemen üzerinde yer alan yaklaşık 12µm çapta hücreler olan spermatogonyumlar, puberteden hemen önce hipofizden

(28)

13

gonadotropinlerin salınmasıyla mitoz bölünmeyle sayılarını artırırlar. Oluşan yeni hücreler ya bölünmeyi sürdürerek A tipi spermatogonyumları, ya da devam eden mitoz bölünmeler sonrası farklılaşarak B tipi spermatogonyumları meydana getirir. İnsanda Tip A açık ve Tip A koyu olmak üzere iki tip spermatogonyal kök hücre bulunur. Tip A koyu spermatogonyumlar seminifer tübüllerin kök hücreleri olarak işlev gören oval çekirdekli bazofilik hücrelerdir ve bölünerek Tip A açık spermatogonyumları oluştururlar. Soluk boyanan bir çekirdek ve bol miktarda ribozoma sahip olan Tip A açık spermatogonyumlar ise mitozla çoğalarak ya aynı tip hücreleri yada yuvarlak çekirdekli, yoğunlaşmış kromatine sahip B tipi spermatogonyumları meydana getirirler.

Tip B spermatogonyumlar, primer spermatositlere farklılaşacak olan öncül hücrelerdir (Gartner ve Hiatt 2014, Ross vd. 2016).

2.2.2 Spermatosit (Mayoz) fazı

İlk mayoz bölünme başlamadan önce DNA’larını eşleyen primer spermatositler 46 kromozom (44+XY) ve 4n DNA‘ya sahip olmakla birlikte spermatogenik serinin en büyük hücreleridir. Birinci mayoz bölünme sonunda haploid sayıda kromozom (22+X veya 22+Y) ve 2n miktarda DNA‘ya sahip sekonder spermatositler oluşur. Sekonder spermatositler ise çok kısa süre interfaz evresinde kaldıktan sonra 2.mayoz bölünmeyi geçirir ve haploid spermatidler oluşur (Moore vd. 2016).

2.2.3 Spermiyogenez

Spermatidlerden spermatozoonların oluşumu için spermatogenez adı verilen bir olgunlaşma evresinin tamamlanması gereklidir Spermiyogenez 4 evrede tamamlanır;

1- Golgi fazı 2- Başlık fazı 3- Akrozom fazı 4- Olgunlaşma fazı.

(29)

14

Şekil 2.4 Spermiyogenez (Gartner ve Hiatt 2014)

2.2.3.1 Golgi fazı

Bu fazda karakteristik olarak spermatid içindeki çok sayıda Golgi kolmpleksinin birikmesiyle oluşan periyodik asit-Schiff (PAS) pozitif olan granüllerin varlığı saptanmıştır. Glikoprotein içeriği yönünden zengin olan proakrozomal granüller birleşerek, membranla sınırlandırılmış bir akrozomal vezikül içinde bulunan akrozomal granülü meydana getirirler. Akrozomal vezikülün bulunduğu kutup gelişmekte olan

(30)

15

sperm hücresinin baş kısmının belirleyicisidir. Spermatidin arka kısmına doğru göç eden sentriyoller de plazma membranına dik açı yapacak şekilde konumlanırlar. Distal sentriyol, 9 periferal mikrotübül çifti ve 2 santral mikrotübülden oluşan sperm kuyruk aksonemini meydana getirir (Junqueria vd. 2009, Elder ve Dale 2011).

2.2.3.2 Başlık fazı

Akrozomal vezikülün genişlemesi sonucunda nükleusun ön yarısını kaplayan akrozomal başlığın oluştuğu evre başlık fazı olarak adlandırılmıştır. Akrozom başlığı iç ve dış zarları oluştururken, çekirdekle iç akrozom zarı arasında granüler bir yapı ortaya çıkar.

Akrozoma yakın olan çekirdek zarının porlarını kaybederek kalınlaşmasının sonrasında ise çekirdek kromatininin yoğunlaştığı gözlenmektedir.

2.2.3.3 Akrozom fazı

Sertoli hücrelerinin içine doğru gömülerek bazal lamina yönünde ilerlemeye başlayan spermatidlerin çekirdek, sitoplazma ve kuyruğunda ileri derecede farklılaşma başladığı safhadır. Akrozom, hyaluronidaz, asit fosfataz, akrozin, aril sülfataz, nöraminidaz gibi çeşitli hidrolitik enzimler içeren, lizozomun özelleşmiş bir benzeri durumundadır (Muciaccia vd. 2013). Spermatidin yoğunlaşarak uzamaya başlayan çekirdeği, hücre membranına doğru ilerlemiş, koyu renkli ve armut şeklinde bir görünüm almıştır. Bu fazda, gelişmiş sentriyollerden bir tanesi sperm kuyruğunu (flagellum) oluştururken;

mitokondriler de flagellumun proksimalinde birikerek kalınlaşmış orta parçayı meydana getirir. Sperm flagellumu keratinsi yoğun lifler, mitokondriyal kılıf, 9+2 merkezi mikrotübül çekirdeği içeren lifli kılıf ve bir aksonemden oluşan hareketli bir silium yapısındadır (Junqueria vd. 2009).

2.2.3.4 Olgunlaşma fazı

Sperm hücrelerinin olgunlaşma evresinde residüel cisimcik olarak isimlendirilen fazla sitoplazma, sertoli hücrelerindeki lizozomlar aracılığıyla fagosite edilir. Bölünme

(31)

16

sırasında sitoplazmik köprülerle birbirine bağlı olan spermatogonyumlar arasındaki köprüler, residüel cisimle birlikte fagosite edildiği için hücreler arsındaki bağlar kopar ve spermatidler seminifer tübül lümenine doğru bırakılırlar.

Spermatidlerin çekirdek yoğunlaşmasının (kondensasyon) gerçekleşmesi sırasında DNA’daki histonların yerini arjinin ve lizince zengin protaminler alır. Protaminlerdeki disülfid çapraz bağların varlığı hücre kromatininin stabil hale gelmesini sağlamaktadır.

Bu safhada nükleozomların kaybolmasıyla birlikte çekirdek materyalinin yoğunlaşmasında etkili düz kromatin liflerin yan yana dizildiği gözlenmektedir (Demir 2006, Ross vd. 2016).

2.2.3.5 Sperm kapasitasyonu ve akrozom reaksiyonu

Spermiyogenez sürecinin sonunda seminifer tübül lümenine geçen spermler buradaki kontraktil yapılar aracılığıyla epididime doğru ilerler ve burada depolanır. Epididimde hareketlilik kazanan sperm hücreleri oositi fertilize etme yeteneğini ise kapasitasyon adı verilen yaklaşık 7 saatlik bir süreçten sonra kazanmaktadır (Moore vd. 2016).

Ejakülasyon sonrasında dişi üreme kanallarına giren sperm hücrelerinin membran kolesterolü, folliküler sıvıda bulunan albümin tarafından bağlanarak membrandan ayrılır. Kolesterolün sperm membranından uzaklaştırılmasının ardından membran kompozisyonu değişerek membranın akışkanlığı artar. Membranda Ca2+ ve CHO3

geçirgenliğinin artışı, ikincil mesajcıların aktive olmasına neden olur. Bunlardan inaktif durumdaki protein kinazlar, G-proteinleri ve fosfofruktokinaz gibi sinyal moleküllerinin aktifleşmesiyle hücre içine Ca2+ girişi artar ve kapasitasyon süreci başlar. Membranın hiperpolarizasyonu Ca kanalları, voltaja duyarlı Na+ /H+ kanalları ve K+ kanalları gibi iyon kanallarını aktive ederek hücre içi Ca2+, K+ , Na+, H+, artışına yol açmakla motilitenin de artmasına neden olur. Hücre içindeki adenil siklaz (AC), fosfodiesteraz (FDE) ve fosfataz gibi enzimlerin aktivasyonunda hücre içi Ca2+ düzeyinin artışı anahtar rol oynamaktadır. AC’ler, ATP’den bir fosfat molekülünün aktarılmasıyla cAMP üretimini indüklemektedir. Artan cAMP, PKA’nın aktifleşmesine ve hücre içi tirozinleri fosforillemesine neden olur (Ho ve Suarez 2001a). Tirozin fosforilasyonunun artışı hücre içindeki aktin polimerizasyonunda da artışa yol açarak başarılı bir

(32)

17

fertilizasyon için hayati önem taşıyan hipermotilitenin oluşmasında etkilidir.

Hipermotilite özelliği kazanmış spermlerde kuyruk atım hareketi kıvrımlı bir şekil alıp hızlanırken, başın lateral hareket hızı da artmaktadır (Esteves ve Verza 2011, Signorelli vd. 2012).

Kapasitasyon sırasında membran karakteristiğinde, enzim aktivitesinde ve sperm motilitesinde ortaya çıkan değişimler, akrozom reaksiyonunun (AR) oluşması için başlatıcı etki göstermektedirler. Sperm hücresi, oositin zona pelusidasındaki ZP3 proteinine bağlandığında sperm proteinlerindeki tirozin fosforilasyonu artar. Tirozin fosforilasyonuyla aktive olan Fosfolipaz C’nin (PLC) işlevi fosfoinozitolbifosfatı (PIP2); inozitoltrifosfat (IP3) ve diaçil gliserol’e (DAG) parçalamaktır. DAG, Ca2+

varlığında Fosfokinaz C’yi (PKC) aktive etmektedir. IP3 ise akrozom reseptörlerine bağlanmak suretiyle Ca2+ salınımını uyarmaktadır. Tirozin fosforilasyonu ve Ca2+

düzeyindeki artışı takiben sperm plazma membranı ve dış akrozomal membranın birleşerek akrozom içeriğinin boşalmasına neden olur. AR’nin gerçekleşmesinde foliküler sıvı, progesteron ve progestin gibi doğal indükleyici maddeler de etkili olmaktadır. Akrozomda yer alan proteolitik enzimler zonayı eriterek sperm ve oositin kaynaşmasında görev yapmaktadırlar. Akrozomun yokluğunda (globozoospermi) veya işlevini kaybettiği durumlarda doğal yollarla fertilizasyonun gerçekleşmesi mümkün olamamaktadır (Baldi vd. 1996, Dimitriadis vd. 2008, Zhang vd. 2009, Ickowicz vd.

2012). Bu nedenle sperm hücrelerinin akrozom bütünlüğü fertilizasyon başarısı için oldukça önem taşımaktadır (Ickowicz vd. 2012).

2.2.4 Sperm hücresinin yapısı

İnsan sperm hücresinin başı 4-5 µm boyunda, 3 µm eninde ve toplamdaki uzunluğu yaklaşık 60 µm olup, baş ve kuyruk parçalarından meydana gelmektedir.

(33)

18 2.2.4.1 Baş yapısı

Bir sperm hücresinin baş yapısının büyük kısmını, içinde paternal DNA’nın yer aldığı kompakt bir çekirdek kaplamaktadır. Çekirdeğin ön yüzünü dış ve iç akrozomal membran arasındaki hidrolitik enzimlerden meydana gelen bir yapı olan akrozom çevrelemektedir. Golgiden köken alan akrozomda, akrozin ve hyaluronidaz esas iki enzim olmakla birlikte asit fosfataz, aril sülfataz, kollajen, fofolipaz C, β-galaktozidaz ve nöraminidaz gibi pek çok enzim bulunur. Bu enzimler oositin plazma membranı ile akrozom membranının birleşmesi sırasında serbestleşerek fertilizasyonda görev almaktadır (Elder ve Dale 2011).

2.2.4.2 Kuyruk yapısı ve hareketlilik

İnsan spermlerinde kuyruk; boyun, orta parça, esas parça ve son parça olmak üzere 4 kısımdan oluşur.

Sperm hücresinin baş ve kuyruk bağlantısını sağlayan boyun kısmı proksimal sentriyolden meydana gelir ve yoğun fibröz yapıdadır. Bu yapının varlığı, boyun bağlantısında gerilim yaratmadan bükülmeyi kolaylaştırmakta ve sperm hareketliliği esnasında esneklik sağlamaktadır.

Orta parça 7 µm uzunlukta heliks olarak sarılmış mitokondrilerin bulunduğu kısımdır.

Bu mitokondriler kuyruk hareketi için gerekli enerjiyi sağlamada görev alırlar (Ross vd.

2016).

Esas parça yaklaşık 40 µm uzunlukta ve 0,5 µm çapta olup, içten dışa doğru; aksonem, kalın dış fibriller, fibröz kılıf ve plazma membranından oluşmaktadır. Aksonem, sperm kuyruk hareketini oluşturan temel yapıdır. Dışta 9 tane tubulin dimerinden oluşan komplet A ve inkomplet B lifleri birbirlerine nexin adı verilen yapılarla bağlanmaktadırlar. Bu yapılar da birbirine çapraz köprülerle, merkezde yer alan 2 tane A lifine ise radial uzantılarla bağlanırlar. Mikrotübülleri sabitleyen dynein kollar

(34)

19

ATP’nin oluşturduğu enerjiyi mekanik enerjiye çevirerek kuyruk hareketinin sağlanmasında etkilidir. Dışta yer alan fibröz kılıf, dış yoğun fibrillerle aksonemi çevrelemekle birlikte içerdiği disülfit bağlar sayesinde oldukça dayanıklıdır ve spermin kuyruk hareketini desteklemektedir (Cooper ve Yeung 2010, Inaba ve Mizuno 2016).

Fibröz kılıfta kapasitasyon ve hiperaktif motilitenin oluşmasında etkinlik gösteren gliseraldehit 3 fosfat dehidrogenaz, hekzokinaz I, aldolaz I, laktat dehidrogenaz, trioz fosfat izomeraz, pirüvat kinaz, laktat dehidrogenaz C, sorbitol dehidrogenaz ve ADP/ATP taşıyıcı protein 4 gibi sinyal yolağı enzimlerinin varlığı tespit edilmiştir (Inaba 2011).

Son parça, fibröz kılıfın distal ucundan başlayan 5 µm uzunluktaki kısmıdır. Bu bölgede dynein kolların kaybolmasının hemen ardından merkezdeki mikrotübül çiftleri kaybolurken, dıştaki tübüllerden ikisi merkeze hareket eder. B tübüllerinin de açılmasıyla kuyruk ucuna doğru aksonemin tübüler yapısının sona erdiği görülmektedir (Ross vd. 2016).

(35)

20

Şekil 2.5 İnsan sperminde kuyruk yapısı (A) (Reynolds vd.2017) ve elektron mikroskop görüntüsü (B) (Linck vd. 2016)

(36)

21 2.3 Semenin Yapısı ve Semen Analizi

Semen epididimis, duktus deferens, veziküla seminalis, Cowper bezi ve prostattan gelen çeşitli salgı ürünleri ve beraberinde testislerden gelen sperm hücreleri ile salgılardan oluşmaktadır. Alkali özellik gösteren semen, erkek üretra ve dişi vajinal kanallarındaki asiditeyi nötralize etmek suretiyle ejakülasyon sonrasında sperm hücresinin aktivasyonunda etkilidir (Eroschenko ve Di Fiore 2013).

2.3.1 Semen analizi

Sperm hücrelerinin canlılık ve ileri hareketlilik oranları, morfolojik özellikleri ve seminal plazmanın içeriği spermlerin fertilizasyon kapasitesini belirlemektedir. Semen kalitesi spermatogenez sürecindeki aksaklıklar, geçirilen ateşli hastalıklar, enfeksiyon, varikosel gibi testis toplardamar anomalileri, hipotalamus-hipofiz etkileşiminde bozulmalara neden olan hormonal düzensizlikler, alkol, sigara ve uyuşturucu kullanımı, çevresel toksinlere maruziyet ve cinsel perhiz süresi gibi koşullardan etkilenir.

Semen analizi için 2-7 günlük cinsel perhiz gereklidir. Masturbasyon yoluyla steril kap içerisinde toplanan semen örneği 37°C‘lik bir inkübatörde veya oda sıcaklığında likefaksiyonun oluşması için bekletilir. Seminal bezlerdeki proteinlerin etkinliğiyle ejakülasyon sonrasında semende koagulasyon oluşumu gözlenir. Likefaksiyon gerçekleşmeden semenin değerlendirilmesi hatalı sonuçlar alınmasına neden olabilmektedir. Prostat kaynaklı proteazların 15-60 dakikadaki aktivasyonu ile birlikte semen likefiye olmaktadır. Steril plastik pipetler yardımıyla aspire edilen semen damlatılarak viskozitesi derecelendirilir. Damlalar halinde akan semen normal viskoziteye, 2 cm den uzun iplikler şeklinde akışkanlık gösteren semen ise anormal viskoziteye sahip olarak değerlendirilir. Normal koşullarda beyaz-açık gri opak renkteki semen, eritrosit ihtiva ettiği durumlarda kırmızı-kahverengi renk almaktadır. Semen hacminin ölçülmesi, toplam sperm konsantrasyonunu belirlemek için gereklidir. Ancak kanal obstrüksiyonu, androjen yetersizliği ve seminal vezikül gelişiminde yetersizlik gibi durumlarda semen hacminde azalma görülürken, aksesuvar bez anomalilerinde ise normalden fazla hacimde semen çıkışı gözlenmektedir. Semen pHsi normalde 7,2-7,8

(37)

22

aralığında olup 1 saat içinde ölçülmesi tavsiye edilir. Semen, hafif asidik karakterli prostat sıvıları (pH:6,4) ve alkali karakterdeki seminal vezikül sıvılarının (pH:7,4) karışımından meydana gelmektedir. Spermlerin hareketlilik ve kapasitasyon özellikleri pH değişimlerinden etkilenir. Makroskobik analiz yapılırken renk, hacim, pH, viskozite ve likefaksiyon süreleri değerlendirilir. Mikroskobik analizde ise sayı, hareketlilik, canlılık, morfoloji ve yuvarlak hücre sayısı gibi özellikler değerlendirilir.

2.3.1.1 Sperm Sayısı ve hareketliliği

Likefiye olmuş semendeki sperm hücresi konsantrasyonunu belirlemek için Makler sayım kamarası veya Neubauer hemositometre kamarası gibi araçlar yardımıyla, oda sıcaklığında, fazkontrast mikroskop altında x200 büyütmede sayım yapılır. Ayrıca bilgisayar destekli otomatik sayım analizörleri de (CASA-Computer Assisted Sperm Analysis) kullanılmaktadır. Sperm konsantrasyonu hesaplanırken mililitrede bulunan sperm hücresi sayısı tespit edilerek milyon/ml olarak değerlendirilir. Sperm sayısı için alt referans 15 milyon/ml, toplam sperm konsantrasyonu için ise alt referans 39 milyon/ml olarak belirlenmiştir. Ayrıca ejakülat içerisinde olgunlaşmamış germ hücreleri, genital kanaldan gelen epitel hücreleri ve lökositler bulunabilmektedir.

WHO 2010 kriterlerine göre sperm hareketliliği 3 kategoride incelenmektedir:

a) Progresif hareketli ( hızlı, yavaş veya duraksayarak ileriye doğru hareketli) b) Yerinde hareketli (ileriye doğru olmayan hareket veya yalnızca kuyrukta hareket) c) Hareketsiz

(38)

23

Çizelge 2.1 WHO (World Health Organization) 2010’a göre sperm normal değerleri

PARAMETRE REFERANS ALT LİMİTİ

Semen Hacmi 1.5 ml

Sperm Konsantrasyonu 15x10⁶ /ml

Total Sperm Sayısı 39x10⁶ /ejakulat

Progresif (ileri) Motilite 32 % (A)

Total Motilite 40 % (A+B)

Vitalite (canlılık) 58 %

Sperm Normal Morfoloji 4 %

pH ≥ 7.2

Lökosit < 1x10⁶

MAR < 50%

CASA cihazlarıyla yapılan bilgisayar destekli sperm analizinde alınan görüntülerin dijital ortama aktarılmasıyla sperm hareketinin kinematiği detaylı olarak belirlenebilmektedir.Bazı CASA motilite parametreleri aşağıda açıklanmıştır:

VSL (Straightline Velocity): Doğrusal Hız (μm/s). Sperm başının ilk konumu ile en son konumu arasındaki ortalama hızı.

VCL (Curvilinear Velocity): Eğrisel Hız (μm/s). Sperm başının eğrisel yoldaki ortalama hızı.

VAP (Velocity Average Path): Ortalama yol hızı (μm/s). Sperm başının ortalama yörüngedeki hızı.

ALH (Amplitude of Lateral Head Displacement) (μm): Sperm başının lateral düzlemde yer değiştirme büyüklüğü.

LIN (Linearity): Doğrusallık, VSL/ VCL.

STR (Straightness): Doğrusallık. Ortalama yörüngenin doğrusallığı, VSL/ VAP.

(39)

24 WOB (Wobble): Dalgalanma, VAP/VCL.

BCF (Beat Cross Frequency): Çapraz geçiş frekansı (Hz).

Şekil 2.6 CASA motilite parametreleri (http//norwegianred.com)

2.3.1.2 Sperm canlılığı

Semen analizinde hareketsiz (c) olarak saptanan sperm hücrelerinin hepsi ölü olmamaktadır. Canlı ama hareketsiz hücreleri saptamak için membran bütünlüğünün belirlenmesine yönelik Hipoosmotik Şişme Testi (HOS) veya Eosin-Nigrosin boyama gibi testler uygulanmaktadır.

2.3.1.3 Sperm Morfolojisi

Sperm hücrelerinin morfolojik yönden değerlendirilmesi için lam üzerine damlatılan sperm süspansiyonu ince bir tabaka halinde yayma yapılarak preparat hazırlanır. Diff Quick, Spermac, Papanicolau gibi boyalarla boyama sonrasında hücreler immersiyon objektifinde 100x objektifte incelenir. Günümüzde insan spermlerinin morfolojik değerlendirmesinde 1987’de Kruger tarafından tanımlanmış olan Kesin Morfolojik

(40)

25

Kriterler kullanılmaktadır. Normal morfolojiye sahip bir sperm hücresinin sahip olması gereken özellikler aşağıdaki gibi tanımlanmaktadır;

Baş: Düzgün sınırlı, genellikle oval şekilli sperm başının %40-70’ini akrozom oluşturmalıdır. Baş bölgesinde bulunabilecek vakuollerin büyüklüğü %20’den küçük olmakla birlikte post akrozom bölgesinde yer almaması gerekir. Baş anomalileri; küçük, büyük, yuvarlak, uzun, sivri, vakuollü, piriform, amorf, çok nükleuslu ve çift başlı olarak kategorize edilmektedir.

Orta Parça: İnce ve düzenli sınırlı orta parça kısmı yaklaşık olarak sperm hücresinin baş uzunluğuna yakın ölçülerdedir. Orta parça ve başın ana ekseni aynı hizada bulunmalıdır.

Bağlantı kısmının kalın, düzensiz, çok ince veya kıvrılmış olması, sperm başının 1/3’ü veya daha fazla oranda rezidüel sitoplazma bulunması anomali olarak değerlendirilir.

Ana Parça: Yaklaşık 50-55 µm. uzunlukta olmalı ve uzunluğu boyunca bu parçanın genişliği değişkenlik göstermemelidir. Kısa,sarmal veya uzun olması, sayıca birden fazla olması, keskin açılı bükülme veya kırık olması anomali olarak değerlendirilmektedir.

2.3.1.4 Sperm Fonksiyonu

Sperm hücrelerinin fertilizasyon başarısında canlılık, hareketlilik ve morfolojik özelliklerinin yanısıra membran yapısı, akrozom reaksiyonu, oosit penetrasyonu ve çekirdek kondansasyonu gibi bazı fonksiyonel özelliklerinin de önemli etkisi bulunmaktadır. Sperm fonksiyonunu belirlemek için yapılan testler: Akrozom bütünlüğü testi, Akrozin tayini, Hipoozmolar şişme testi (HOS), Antisperm antikorları, Postkoital test, Hamster zona bağlanma testi, Hyaluronik asit bağlanma testi, Hemizona bağlanma testi, Servikal mukus bağlanma testi olarak sıralanabilir (Agarwal vd. 2008).

(41)

26 2.3.1.5 Sperm DNA hasarı

Fertil veya infertil erkeklerin ejakulat spermlerinde DNA hasarı görülmekle birlikte, hasarlı DNA’ya sahip spermlerin fertilizasyon oranlarında azalmaya ve erken dönem gebelik kayıplarına neden olduğu bilinmektedir (Sun vd. 1997, Lopes vd. 1998, Evenson vd. 1999). Sperm hücrelerinde ortaya çıkan DNA hasarı oluşumunun başlıca nedenleri; Spermatogenez sırasında kromatin paketlenmesi sırasındaki hatalar ve yanlış bağlanmalar, ejekülatta yüksek miktarlarda ROT varlığı, çevresel toksinlere maruziyet, sigara ve alkol kullanımı gibi ROT oluşumunu artırıcı yaşam şekli ve apoptozdur (Saleh ve Agarwal 2002, Moustafa 2004, Aitken ve Koppers 2011). Günümüzde DNA’daki hasar oranını saptamak için kullanılan farklı yöntemler bulunmaktadır;

1- DNA hasarını belirlemek için TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), Sperm kromatin yapı analizi (Sperm Chromatin Structure Assay- SCSA), Halo Sperm yöntemi (Sperm Chromatin Dispersion-SCD), Akridin Orange Testi (AOT), Tek Hücre Elektroforez (COMET) yöntemi, 8- hidroksi 2- deoksiguanozin (8-OHdG) ölçümü,

2- Sperm kromatini paketlenmesinde ortaya çıkan anormallikleri belirlemek için Kromomisin A3 (CMA3) boyama, Anilin Blue (AB) boyama, Toluidin Blue (TB) boyama yöntemleri

3- Kromozom anomalilerini tespit etmek için ise Floresan In-Situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi kullanılmaktadır.

Bu yöntemlerin uygulanması sırasında çeşitli denatürasyon, fiksasyon ve boyama prosedürleri uygulanarak ejakülattaki DNA hasarlı spermatozoa oranı belirlenmektedir (Zhang vd. 2010, Carrell ve Aston 2013, Cankut vd. 2019). Günümüzde DNA hasarını (anormal kromatin paketlenmesi, DNA fragmantasyonu ve protamin eksiklikleri) tespit etmek için kullanılan yöntemlerin referans arlıkları ve güvenilirlik düzeyleri hakkında tam olarak fikir birliğine varılamamıştır. Ancak sperm DNA bütünlüğü incelemelerinde en fazla tercih edilen yöntemler TUNEL, SCSA ve SCD olarak dikkat çekmektedir (Majzoub vd. 2017).

(42)

27 2.4 Kriyoprezervasyon

Kriyoprezervasyon işlemi, gelecekte kullanılması planlanan çeşitli hücrelerin ve dokuların biyolojik aktivitelerinin yavaşlatılması suretiyle 0°C’nin altındaki ısılara kadar soğutularak saklanmasıdır. Organ, doku, hücre ve organizmaların dondurulmasını inceleyen bilim dalı olarak kriyobiyoloji, farklı dondurma ve çözme prosedürleri, kriyoprotektan etkinliği ve hücrelerde meydana gelen fizyolojik-fonksiyonel özelliklerin belirlenmesi bakımından günümüzde de gelişimini sürdürmektedir.

Kriyobiyolojide kullanılan dondurma ve çözme prosedürleri hücreden hücreye değişim göstermekle birlikte hücrelerin sağ kalımı için en önemli etken buz kristali oluşumudur.

Dondurma işlemi yapılırken kullanılan KPM’ler, hücre içi su miktarını en aza indirgeyerek intraselüler buz oluşumunun engellenmesinde etkilidirler. KP sırasında ısının azalmasıyla birlikte su moleküllerinin sayısının azalması ve oluşan hipertonik ortamda hücrelerin dehidratasyonu gerçekleşir. Bu aşamada dehidratasyon hızı da hücre canlılığını etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Soğutma hızının çok hızlı olması, ani hücre içi buz oluşumuna yol açmaktadır. Soğutmanın yavaş gerçekleştirilmesi durumunda ise hücrelerin uzun süre yüksek ozmolariteye maruz kalması nedeniyle membran lipoproteinlerinin denatürasyonu söz konusu olmaktadır. Bu nedenle canlılığının devamlılığı bakımından hücrelerin soğutulma hızı KP sırasında göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktörlerdendir (Lovelock 1957).

Sperm KP işlemi ilk olarak 1949‘da Polge ve arkadaşları tarafından gliserol kullanılarak gerçekleştirilmiş, 1953’te ise dondurulmuş-çözülmüş spermlerden elde edilen ilk fertilizasyon Bunge ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir (Polge vd. 1949, Bunge ve Sherman 1953).

Günümüzde sperm hücrelerinin dondurulması, yardımla üreme tekniklerinin (YÜT) kullanıldığı alanlarda sıklıkla uygulanmaktadır. Fertilite potansiyelinin azalmasına veya tamamen ortadan kalkmasına yol açacak işlemlerden önce sperm hücrelerinin dondurularak saklanması oldukça önem taşımaktadır. Fertilitenin korunması amacıyla sperm hücrelerinin dondurulmasını gerektirecek durumlar aşağıda belirtilmiştir;

(43)

28

1- Kemoterapi, radyoterapi gibi çeşitli kanser tedavilerinin spermatogenezi kalıcı olarak yada birkaç yıl süreyle bozabildiği bilinmektedir. Özellikle testis kanseri, lenfoma, lösemi, santral sinir sistemi tümörleri gibi hastalıkların tedavisi öncesinde fertilitenin korunması gereken hallerde,

2- Spermatogenez üzerinde istenmeyen etkiler gösterecek özellikteki ilaçların (örneğin Nitrofurantoin, Sulfasalazin, Simetidin v.b ) kullanılması gerekliyse,

3- Ejakülasyonun doğal şekilde gerçekleştirilemediği durumlarda (Spinal kord hasarı veya seksüel disfonksiyon v.b.) ,

4- Testis cerrahisi gerektiren tedavilerden (variselektomi, total veya parsiyel orişektomi) önce,

5- İnfertilite tedavileri sırasında elde edilmiş olan testiküler spermlerin (TESE, TESA, MESA) sonraki tedavilerde de kullanılabilmesi amacıyla,

6- Sağlıklı ve fertil erkeklerden alınan örneklerden ÜYTE sürecinde kullanılmak üzere, 7- Sperm bağışı (donasyon) yapılacağı durumlarda,

8- Veterinerlik, hayvan yetiştiriciliği ve suni tohumlama uygulamalarında

sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu gerçekleştirilmektedir (Gupta vd. 2011, Hamada vd. 2014).

Ülkemizde sadece aşağıda belirtilen durumlarda erkek gonad ve üreme hücrelerinin dondurulmasına yasal olarak izin verilmiştir;

1- Çeşitli kanser tedavileri sırasında kemoterapi ve radyoterapi öncesinde,

2- Ejakülatta sperm hücresi bulunmayıp testislerden aspirasyon veya cerrahi yöntemlerle sperm hücresi elde edilmesi durumunda,

3- Testis cerrahisi gibi üreme fonksiyonunu etkileyecek ameliyatlar öncesinde.

Günümüzde testis dokusundan cerrahi yönemle veya ejakülasyonla elde edilen sperm hücrelerinin dondurulmasında pek çok farklı özellikte kriyoprotektan madde ve farklı dondurma çözme prosedürlerinin kullanılması sözkonusudur.

Referanslar

Benzer Belgeler

AB Kulisi’nin bu ayki sayısının Editör’den bölümü; AB ile müzakere sürecinin ilerlemesi için yerel seçimlerin ardından Türkiye’den beklenen reformları ve

Avrupa Parlamentosu, Binaların Enerji Performansı Yönetmeliği ve Ev Aletleri ve Ürünlerin Enerji Etiketlerine ilişkin Yönetmeliği kapsamında gözden geçirilmiş yasa

Başbakan Tayyip Erdoğan’ın eşi Emine Erdoğan ve Avrupa İşlerinden sorumlu Devlet Bakanı ve Başmüzakereci Egemen Bağış refakatinde, Türkiye iş, sanat, akademi ve sivil

-AB’nin Rekabet Konseyi gayri resmi toplantısı -AB’nin Siyasi ve Güvenlik Komitesi. 22 Temmuz

AB’nin Maliye Bakanları, 15 Mart tarihli Konsey toplantısında, AB’de özellikle Euro Bölgesi’nde ekonomik yönetimin sağlanması ve mali kriz ile oluşan ülke

-AB’nin Avrupa Bakanlarının Yoksulluk ve Sosyal Dışlanma ile Mücadele Konulu gayri resmi toplantısı -AB’nin Ekonomi ve Maliye Bakanları Konseyi, Lüksemburg. -AB’nin Siyasi

Avrupa Parlamentosu’nun (AP) Uluslararası Ticaret Komisyonu’nda geçtiğimiz ay oylanan, Eylül’de ise tavsiye kararına dönüşecek olan, Türkiye ve Avrupa Birliği’nin

AB'nin icra organı Komisyon'un yeni başkanının belirlenmesi konusu Avrupa Parlamentosu (AP) ve karar organı Konsey arasında siyasi ve yasal sorunlar yaratacak gibi