DNA hasarı oluşumu

KP sonrası ROT artışı ve membran hasarı etkisiyle sperm hücrelerinin mitokondrilerinde ortaya çıkan H2O2, kaspaz aktivasyonu ve FST’ye neden olarak apoptotik kaskadın oluşumuna yol açar (Lozano vd. 2009). Aynı zamanda mitokondrilerden salınan AIF, Kaspaz aktive edici DNase (CAD) ve endonükleaz G gibi bazı endonükleazların aktivasyonuyla çekirdeğe ulaşması da DNA hasarına neden olmaktadır. Ancak spermlerde somatik hücrelerden farklı olarak mitokondri ve çekirdeğin hücrenin farklı lokasyonlarında yer alması nedeniyle endonükleaz aktivasyonunun hemen ardından hızlı bir şekilde DNA fragmantasyonu gelişmeyebilir.

Apoptoz belirtileri oluşan spermlerde çeşitli fonksiyonel kayıplara bağlı olarak belirgin şekilde motilite kaybı oluşabilir. Bununla birlikte apoptotik bir sperm hücresinin hasarlı DNA‘ya sahip olması durumunda da oositi fertilize etmesi mümkündür (Sun vd. 1997, Aitken vd. 1998). FST, miyokondriyal membran potansiyeli düşüklüğü ve aktif kaspaz oluşumu gibi çok sayıda apoptotik belirteç varlığının gözlendiği sperm hücrelerinin oosit penetrasyonu yeteneğinde belirgin bir azalmanın olduğu saptanmıştır (Grunewald vd. 2008).

39 2.6 Fosfodiesterazlar ve İnhibitörleri

Şekil 2.9 Döngüsel nükleotid yapısı ve FDE bağlanma bölgesi (Bender ve Beavo 2006)

2.6.1 FDE etki mekanizmaları ve sınıflandırılmaları

FDE’ler, hücre içinde ikincil mesajcılar olarak adlandırılan döngüsel ikincil mesajcılardan cAMP ve cGMP’nin 3’-fosfat köprülerinin hidrolizine yol açan fosfohidrolaz enzimlerdir. Bu bakımdan cAMP ve cGMP sinyallerinin hücredeki devamlılığını veya sonlandırılmasını düzenlerler. Ancak FDE aktivitesinin inhibisyonuna neden olan bazı maddeler cAMP ve cGMP’nin yıkımını engellemek suretiyle hücredeki konsantrasyonlarını arttırırlar (Drobnis 2017). 1958’de Rall ve Sutherland’ın (Rall ve Sutherland 1958) karaciğer hücrelerinde ikincil mesajcı olarak cAMP’yi tanımlamasından 5 yıl sonra 1963’te bir diğer ikincil mesajcı olan cGMP de Ashman ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır (Ashman vd. 1963). Hücredeki cAMP-FDE etkinliği ise ilk olarak 1962 de yapılan çalışmayla ortaya konmuştur (Butcher ve Sutherland 1962). Günümüzde insan hücrelerinde 21 genin kodladığı 11 tane FDE ailesi tanımlanmış olmakla birlikte, bu enzimler hücredeki yerleşimleri, allosterik yapıları, aminoasit dizilimi, substrat spesifikliği, regülatör mekanizmaları ve farmakolojik özellikleri bakımından değişkenlik gösterirler (Bender ve Beavo 2006, Conti vd. 2014).

40

Şekil 2.10 FDE’ lerin yapısal olarak sınıflandrılması (Singh ve Patra 2014)

FDE’ler yapısal olarak 3 ana domainden oluşur; 270-300 aminoasit içeren sıkı korunmuş bir C-Terminal katalitik domain, Regülatör domain ve N-Terminal domain.

FDE aileleri regülatör domainlerindeki farklılıklara göre sınıflandırılmaktadır (Singh ve Patra 2014). Memelilerde %25-52 homoloji gösteren katalitik domainleri Mg veya Zn metal iyonuna sahiptir. Genellikle dimerler halinde bulunan FDE izozimleri substrat afinitesi bakımından ise aşağıdaki şekilde gruplandırılırlar;

cGMP’yi hidrolize edenler; FDE5, FDE6, FDE9

cAMP’yi hidrolize edenler; FDE4, FDE7, FDE8

Hem cAMP hem de cGMP’yi hidrolize edenler; FDE1, FDE2, FDE3, FDE10, FDE11.

FDE izozimleri insanda beyin, kalp, akciğer, böbrek, iskelet kası ve düz kaslar, hipofiz, karaciğer ve testis dokularında tespit edilmekle birlikte, her birinin hücreye göre farklı hücresel cevabın gelişimine aracılık ettiği belirlenmiştir (Dimitriadis vd. 2008, Keravis ve Lugnier 2012).

41

İnsan sperm hücrelerinde hem seminal plazmada hem de spermatozoonda farklı FDE ailelerin varlığı belirlenmiş olmakla birlikte, etkinlik mekanizmaları ve lokalizasyonlarıyla ilgili araştırmalar devam etmektedir. İmmünsitokimyasal çalışmalarda FDE1’in yoğunlukla spermatozoonun baş kısmında, FDE4’ün ise orta parça ve kuyrukta yerleşim gösterdiği saptanmıştır (Fisch vd. 1998). İnsan sperm hücrelerinden izole edilen mRNA transkriptlerinin RT-PCR yöntemiyle incelenmesiyle FDE1B, FDE3B, FDE4A, FDE4B ve FDE8 subtiplerine ait güçlü spesifik bantların varlığı ortaya konulmuştur (Richter vd. 1999). Ancak mRNA transkriptlerinin olgun sperm hücresinin de novo sentezinin bir ürünü olarak mı ortaya çıktığı yoksa erken spermatogenezde sentezlenerek ribonükleoprotein partiküllerinde mi depolandığı tam olarak açıklanamamıştır (Dimitriadis vd. 2008).

FDE’lerin isimlendirilmesinde ilk rakam FDE’nin ait olduğu aileyi, sonra gelen harf ailedeki geni, en son gelen rakam ise transkript varyantını belirtmek için kullanılır.

Günümüze kadar tespit edilmiş olan 11 FDE ailesinin genel özellikleri aşağıda açıklanmıştır; (Lerner ve Epstein 2006, Dimitriadis vd. 2008, Francis vd. 2011, Keravis ve Lugnier 2012).

FDE1 Ailesi:

3 gen tarafından kodlanan FDE1 ailesinin FDE1A, FDE1B, FDE1C olarak 3 izoformu vardır. Hem cAMP hem de cGMP’yi hidrolize eder. Kalp, beyin, iskelet kası ve düz kaslarda bulunur. Spesifik inhibitörü olarak Vinpocetine ve 8-methoxy-1-methyl-3-isobutylksantine (IBMX) tanımlanmıştır.

FDE2 Ailesi:

Tek gen tarafından kodlanan FDE2A ailesinin izoformlarından FDE2A1 hücrede sitozolde yer alırken, FDE2A2 ve FDE2A3 membrana bağlı yerleşim gösterir. Hem cAMP hemde cGMP hidrolizi yapan FDE2’nin inhibitörü EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine) dır.

42 FDE3 Ailesi:

3 tane gen tarafından kodlanan FDE3 ailesinin üyelerinden FDE3A platelet, düz kaslar, oosit ve kalp hücrelerinde, FDE3B ise adiposit, hepatosit ve spermatositte belirlenmiştir. Hem cAMP hemde cGMP hidrolizinde etkili olan FDE3’ün inhibitörleri arasında Cilostamide, Amrinone, Milrinone ve Enoximone tanımlanmıştır .

FDE4 Ailesi:

Dört gen tarafından kodlanan FDE4 ailesinin insanda 25’ten fazla izoformunun varlığı tespit edilmiştir. Seçici cGMP hidrolizi yapan FDE4’ün inhibitörü olarak Rolipram ve Roflumilast kullanılmaktadır.

FDE5 Ailesi:

Tek gen tarafından kodlanan FDE5 enziminin FDE5A1, FDE5A2 ve FDE5A3 izoformları saptanmıştır. Terminal N-domainlerinde GAFA ve GAFB bölgelerine sahip FDE5 enzim ailesinin kanser mekanizmasında etkinliği olduğu bilinmektedir.

Akciğerler, düz kas hücreleri ve plateletlerde varlığı belirlenen PDE5 ailesinin inhibitörü olarak Sildenafil, Vardenafil, Tadalafil ve Zaprinast kullanılmaktadır.

FDE6 Ailesi:

Dört gen tarafından kodlanan FDE6 ailesinin FDE6A, FDE6B, FDE6C ve FDE6D olarak tanımlanmış izoformları cGMP üzerinde hidroliz etkisi göstermektedir. Gözde retinal fotoreseptörlerde bulunan FDE6’nın inhibitörleri Sildenafil, Vardenafil ve Tadalafil dir.

43 FDE7 Ailesi:

İki gen tarafından kodlanan FDE7 ailesinin iki izoformu olan FDE7A ve FDE7B‘nin N-terminal bölgelerinde regülatör bir kısım yoktur. cAMP hidrolizi yapan FDE7 ailesi enzimleri lenfositler, iskelet ve kalp kası hücrelerinde saptanmıştır ve inhibitor olarak Thiadozole kullanılmaktadır.

FDE8 Ailesi:

İki gen tarafından kodlanan FDE ailesi izomerlerinden FDE8A testis, göz, karaciğer, kalp, beyin ve iskelet kasında, FDE8B ise tiroit bezlerinde bulunmaktadır. cAMP‘nin hidrolizinde etkili FDE8’in inhibitörü olarak Dipyridamole tanımlanmıştır.

FDE9 Ailesi:

Tek gen tarafından kodlanan FDE9 enziminin beyin, kalp, plasenta, karaciğer, dalak, kolon ve prostat hücrelerinde varlığı saptanmıştır. Yüksek derecede spesifik cGMP hidrolizi yapan FDE9’un inhibitörü olarak Zaprinast ve Vardenafil etkinlik göstermektedir.

FDE10 Ailesi:

İnsanda FDE10 ailesine ait transkriptler testis, beyin, kalp, böbrek, plasenta hücrelerinde tespit edilmiştir. FDE2, FDE5 ve FDE6 ile homolog bir katalitik domaine sahip olmakla birlikte FDE10’un hem cAMP hem de cGMP’yi hidrolize ettiği bilinmektedir (Lerner and Epstein, 2006). Vmax (sistemden elde edilebilecek en yüksek reaksiyon hızı) değeri dikkate alındığında Vmax (cGMP), Vmax (cAMP)’den 2-5 kat daha fazladır. Ancak FDE10 için Km (Michaelis sabiti Km, reaksiyon hızının Vmax'ın yarısı olduğu substrat konsantrasyonu) değerinin cAMP için 0,05 µm ve cGMP için 3 µm olması nedeniyle, cAMP ve cGMP’nin kinetik özellikleri gereği cGMP’nin hidrolizinin cAMP tarafından engellendiği düşünülmektedir. Bu sistem FDE3

44

ailesindeki işleyişin tam tersidir (Soderling vd. 1999, Soderling ve Beavo 2000, Rodefer vd. 2005).

Sığır ejakülat sperm hücrelerinin baş ve kuyruk bölgelerinde FDE10A varlığı tespit edilmiş ve FDE aktivitesinin %44-57 oranında PAP’a karşı duyarlı olduğu saptanmıştır.

PAP ile FDE’lerin inhibe edildiği durumlarda sperm tirozin fosforilasyonu, ERK1 ve ERK2 fosforilasyonunda artışın yanı sıra Ca²⁺ depolarından Ca²⁺ salınımında da artış olduğu saptanmıştır (Bergeron vd. 2016). Goupil ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ise sığır sperm hücrelerinin akrozomunda FDE10A’nın 4 tip izoformu tespit edilmiştir.

Sığırlarda kauda epididimal ve ejekulat spermlerinin ana cAMP-FDE aktivitesinin PAP duyarlı olduğu açıklanmıştır (Goupil vd. 2016).

FDE11 Ailesi:

Tek gen tarafından kodlanan FDE11’in FDE11A1, FDE11A2, FDE11A3 ve FDE11A4 izozimlerinin N-terminal bölgelerinde 1 ya da 2 GAF bölgesi bulunmaktadır. Prostat, karaciğer, kalp ve salgı bezlerinde varlığı saptanmış olan FDE11 ailesi cAMP ve cGMP hidrolizi yapmaktadır. Zaprinast, Pyridamole ve IBMX maddeleri FDE11 inhibitörü olarak etkinlik göstermektedir.

2.6.2 FDE inhibitörleri

FDE inhibitörleri (FDE-İ), cAMP ve cGMP gibi ikincil mesajcıların hidrolizini engellemek suretiyle ortamdaki konsantrasyonlarında artışa neden olmaları bakımından pek çok hastalığın tedavisinde terapötik ajan olarak kullanılmaktadır. FDE işlevindeki bozulmalar otoimmün hastalıklar, şizofreni, depresyon, kardiyak yetersizlik ve hipertansiyon, erektil disfonksiyon gibi birçok hastalığın ortaya çıkmasında etkilidir (Francis vd. 2011). FDE-İ olarak tanımlanan ilk madde Teofilindir (Butcher ve Sutherland 1962). FDE’lerle yapılan ilk farmakolojik araştırmalar FDE benzeri özellikler gösteren ve Ksantinler olarak adlandırılan çay, kahve ve kakao üzerinde yoğunlaşmıştır. Günümüze kadar yapılan farmasötik çalışmalarda cAMP, cGMP veya

45

her ikisine de duyarlı özellikte, seçici ve potent çok sayıda FDE-İ sentezlenmiştir (Schudt vd. 2011).

Spermlerde FDE inhibisyonuna neden olan maddeler hücre içi sinyal iletim yolağının işleyişi üzerinde etkinlik göstermektedirler. FDE-İ varlığında hücredeki ikincil mesajcılardan cAMP /cGMP ve Ca²⁺ konsantrasyonu ve tirozin fosforilasyonunda artışa yol açmaktadır. Bu artış sonucunda sperm hücrelerinde kapasitasyon, AR ve hareketlilik gibi bazı fonksiyonlarının da artışı söz konusu olmaktadır. Bir metilksantin türevi olan Pentoksifilin’in (PF) hücre içindeki cAMP-cGMP artışıyla birlikte hücre içi Ca²⁺

depolarından Ca²⁺ salınımını uyardığı ve Ca²⁺ bağımlı sinyal yolaklarını aktifleştirdiği belirlenmiştir (Calogero vd. 1998). Hamster spermleriyle yapılan bir çalışmada PF varlığında 15-180 dakika aralığında hücre içi cAMP düzeyinde 2,8 kat artış olduğu saptanmıştır. Hücre içi cAMP düzeyindeki artışın fosfokinaz A (PKA) aktivasyonuna yol açtığı ve membran proteinlerinin fosforilasyonuyla birlikte sperm kapasitasyonunun artmasına neden olduğu belirlenmiştir. Aynı çalışmada hücre içinde artan Ca²⁺’un fosfolipaz A2’yi aktifleştirerek, AR oluşumu için gerekli Araşidonik asit ve Liyofosfolipidler gibi füzyonik bileşiklerin sentezine yol açtığı gözlenmiştir. PF etkisiyle ikincil mesajcıların işleyişindeki bu değişikliklerin spontan AR gelişimini artırabileceğine dikkat çeken çalışmada PF’nin olası etkinlik mekanizması da şematize edilmiştir (Ain vd. 1999).

Spermlerin hareketliliğini artırmada kullanılan FDE5 inhibitörlerinden Sildenafil’in FDE5 enziminin cGMP substrat bölgesi olan katalitik kısmına bağlanarak enzimin aktivitesini inhibe ettiği belirlenmiştir. cGMP direk olarak döngüsel nükleotid bağımlı kanalların açılmasına ve hücre içine Ca²⁺ girişine neden olmaktadır. Buna bağlı olarak hücre içinde artan Ca²⁺ konsantrasyonun etkisiyle kuyruk hareketliliğinde ve AR oluşumunda da artışın gerçekleştiği bildirilmiştir (Cuadra vd. 2000, Glenn vd. 2007).

Erektil disfonksiyon tedavisi için oral kullanımında ise penisteki kas hücrelerindeki FDE’yi inhibe etmek suretiyle cGMP’nin yıkımını bloke etmektedir. Artan cGMP, Ca²⁺’un hücre içi depolara girmesine ve perisinüzoidal düz kas hücrelerinin gevşemesine yol açmaktadır. Bir diğer FDE5 inhibitörü Tadalafilin de in vitro

46

kullanımda doza bağlı olarak 2-3 saat süreyle spermatozoanın hareketliliğini artırdığı bilinmektedir (Mostafa 2007, Yang vd. 2014).

2.6.2.1 Papaverin

Şekil 2.11 Papaver somniferum bitkisi ve Papaverinin kimyasal yapısı (https://gobotany.nativeplanttrust.org/species/papaver/somniferum)

İlk olarak Merck tarafından 1848 yılında izokinolin sınıfı opoid bir alkaloid olarak tanımlanan PAP, Papaver somniferum (haşhaş) bitkisinden elde edilmektedir. PAP’ın sperm hücreleri üzerindeki etkinlik mekanizması tam olarak açıklanamamış olmakla birlikte, hücrelerdeki FDE inhibisyonu sonucu cAMP-cGMP konsantrasyonunda artışa yol açtığı bilinmektedir. Ayrıca hücre içi Ca²⁺ depolarından Ca²⁺ salınımını artırdığı belirlenmiştir (Bergeron vd. 2016). PAP bilinen ilk spesifik FDE10A inhibitörü olarak şizofreni hastalığı ve bilişsel defektlerin giderilmesinde, serebral-periferal iskemi durumunda ve üretral-gastrointestinal spazm giderici olarak, vazodilatör özelliği nedeniyle de erektil disfonksiyon klinik olarak tedavisinde kullanılmaktadır (Mooradian vd. 1989, Zhu vd. 2014, Jankowska vd. 2019). Ancak PAP’ın sperm hücreleri üzerindeki in vitro etkilerini inceleyen çalışma sayısı oldukça kısıtlıdır. Bergeron ve arkadaşlarının 2016 yılında yaptığı çalışmada sığır spermlerinde spesifik FDE10 inhibitörü olarak PAP‘ın, reseptör tirozin kinazlardan ERK1 ve ERK2 aracılığıyla çekirdek ve sitozoldeki hedef tirozinlerin fosforilasyonun artmasına yol açtığı açıklanmıştır (Bergeron vd. 2016). Ayrıca PAP varlığında hücre içi Ca²⁺ depolarından Ca²⁺ salınımının gerçekleştiği tespit edilmiştir. Sığır seminal plazmasında da saptanmış olan cAMP-FDE aktivitesinin %47,5’inin PAP‘a karşı duyarlı olduğunun anlaşılmasıyla birlikte hücre dışı ortamda bulunan FDE’lerin de sperm hücrelerinin fonksiyonları

47

üzerinde etkili olabileceğine dikkat çekilmiştir. Marechal ve arkadaşlarının 2017’de yaptığı çalışmada ise insan sperm hücrelerinde FDE10’un fonksiyonel olarak varlığı belirlenmiş ve total sperm FDE aktivitesinin yaklaşık %40’ının FDE10 kaynaklı olduğu bildirilmiştir. Çalışmada seminal plazmadaki en aktif FDE grubunun FDE4 ve FDE11, spermatozoada ise FDE10 olduğu tespit edilmiştir. İnsan sperm hücrelerindeki ana cAMP-FDE aktivitesinin PAP duyarlı olarak bulunması PAP’ın sperm fonksiyonlarını geliştirmek amacıyla kullanılabileceğini düşündürmektedir (Marechal vd. 2017).

2.7 Sperm Kuyruk Hareketinin Etkinlik Mekanizması

Sperm hücrelerinin hareketliliğinde sperm kuyruğunun fizyolojik ve fonksiyonel özelliklerinin yanı sıra seminal plazmanın bileşenleri de önem taşır. Sperm kuyruğunun atım hareketinin düzenlenmesinde cAMP, cGMP, Ca²⁺ ve H⁺ gibi ikincil mesajcılar görev yapmaktadır. Pek çok çalışmada özellikle cAMP/cGMP yolağının kuyruk proteinlerinin fosforilasyonu üzerindeki etkinliği ve sperm hareketliliğindeki rolü ortaya konulmuştur (Vijayaraghavan vd. 1997, Buffone vd. 2014, Pereira vd. 2017). cAMP’nin aksonemde lokalize olan PKA’yı aktive etmek suretiyle, cGMP’nin ise PKA ve PKG aracılığıyla Kuyruk Atım Frekansını (KAF) artırdığı ileri sürülmektedir. Hücre içinde artan pH düzeyinin kuyruktaki dynein kollar üzerindeki etkinliğiyle KAF’ın da arttığı bildirilmiştir (Salathe 2007). Sperm proteinlerinin fosforilasyonunun düzenlenmesinde kinaz ve fosfatazların aktivitesi etkilidir. Bunlardan PKA’lar, AC enzimini aktive ederek ATP’den bir fosfatın salınmasına ve cAMP yapımına neden olurlar. Benzer şekilde hücre içinde cAMP ve PKA artışına neden olan çeşitli maddelerin de aksonem ve fibröz kılıf proteinlerinin fosforilasyonuna neden olarak spermlerin hareketliliğinde artışa yol açtığı bilinmektedir (Leclerc vd. 1996). Kuyruktaki dynein kollar ATP varlığında konformasyonel değişime uğrayarak B tübülünden ayrılır ve biraz daha aşağıdan yine aynı tübüle bağlanmak suretiyle kayma hareketini gerçekleştirir.

Tübüldeki bu harekete neksin bağlantılar ve radyal uzantılar direnç gösterdiği için oluşan kayma hareketi bükülmeye dönüşmektedir. Kuyruk hareketi sırasında aksonemdeki dyneinlerin bir kısmı aktifken, diğer kısmı gevşeme halinde bulunmaktadır (Goodman 2011).

48

Şekil 2.12 Sperm hareketinin etkinlik mekanizması (İnaba 2003)

Memelilerdeki AC enzimleri tmAC (transmembran Adenylyl Cyclase) ve sAC (soluble Adenylyl Cyclase) olmak üzere 2 tiptir. Bunlardan sAC direkt olarak Ca²⁺ ve HCO3−

(Bikarbonat) ile aktifleşirken, tmAC’ler heterotrimetrik G proteinleri tarafından aktive edilir. Serin-treonin kinaz özellikteki PKA’lar bazı ara tirozin kinazları aktive etmek suretiyle serin/ treonin rezidülerini fosforile eder ve komşu proteinlerdeki fosforilasyon kaskadını başlatarak kuyruk hareketini artırıcı etki gösterir (Bajpai ve Doncel 2003, Dey vd. 2014).

Sperm hücrelerinin motilitesinde etkinlik gösteren bir diğer alternatif yolağın da PI3K‘nın inhibisyonu ve HCO3− düzeyinin artışıyla sAC‘nin aktive olması sonucu hücre içi cAMP miktarının artması olduğu düşünülmektedir. cAMP artışı sperm kuyruk proteinlerinden AKAP3 (A Kinaz Anchoring Protein3)’ün fosforilasyonuna neden olarak hareketlilik artışını sağlamaktadır (Luconi vd. 2006). Sperm kuyruğundaki lokalizasyonu nedeniyle AKAP3’ün fosforilasyonu motilitenin artışıyla sonuçlanmakla birlikte, AKAP3-PKA etkileşiminin bozulması motilitenin inhibisyonuna neden olur (Luconi vd. 2005). AKAP3 ve AKAP4’ün insan spermatid ve spermatozoonundaki varlığının belirlenmesiyle birlikte, yoğunlukla kuyrukta yerleştikleri ve sperm hareketliliğinin yanı sıra AR oluşumunda da etkinlik gösterdikleri düşünülmüştür

49

(Luconi vd. 2011). Benzer şekilde Carr ve arkadaşları yaptıkları çalışmada da cAMP bağımlı PKA’nın R1 ve R2 alt üniteleri aracılığıyla AKAP’a bağlanarak özellikle sil (cilia) ve kuyruk gibi yapıların fonksiyonunda etkili olduğu bildirmiştir (Carr ve Newell 2007). Yapılan farklı çalışmalar da insan sperm hücrelerinde en fazla bulunan fibröz kılıf yapısal proteinleri olarak AKAP3 ve AKAP4’e ve bu proteinlerin sinyal molekülleriyle olan etkileşimine işaret etmektedir (Brown vd. 2003, Eddy vd. 2003).

Sperm hücresinin üzerindeki reseptörlere bağlanan uyarıcıların etkisiyle iyonik değişimler ortaya çıkar ve membran hiperpolarizasyonu, Ca²⁺ kanalları ile hücreye Ca²⁺

girişi ve pH’nin artışı gibi etkiler sonucunda sperm hareketliliğini aktive eden sinyal kaskadı başlatılır. Bu süreçte membran proteinleriyle birlikte voltaj bağımlı veya cGMP bağlı K kanalları, Na⁺/H⁺ – Na⁺/Ca²⁺ ve Na⁺/HCO3^- değiştirici kanalların görev yaptığı düşünülmektedir. Hücre içine Ca²⁺ girişine olanak sağlayan Ca²⁺ kanalları ve Na⁺/ Ca²⁺

değiştirici kanallar aracılığıyla ya da hücre içi depolardan Ca²⁺ salınımı yoluyla artmış olan Ca²⁺ diğer enzimlerin aktivasyonuna ve kuyruk hareketliliğinde asimetrinin oluşumuna yol açar. Kuyruk atım amplitüdündeki artış ve asimetriyle karakterize olan hiperaktif motilitenin oluşumu, spermin oosite doğru kemotaksisi için gereklidir (Inaba 2003).

50 3. MATERYAL ve YÖNTEM

Çalışmamıza infertilite tedavisi için Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Üremeye Yardımcı Tedavi ve Eğitim (ÜYTE) Merkezi’ne başvuran ve çalışma hakkında bilgilendirilerek onamları alınan 18-50 yaş aralığındaki 20 erkek hasta dâhil edilmiştir.

Sperm konsantrasyonu en az 15 milyon/ml olmakla birlikte progresif (ileri) hareketli sperm oranı % 32’nin ve total hareketli sperm oranı %40’ın üzerinde olan hastaların semen örneklerinden, tedavi için kullanılacak kısım ayrıldıktan sonra geriye kalan kısım çalışma için kullanılmıştır. Çalışma öncesinde Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İlaç Dışı Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’na başvurularak etik kurul onayı alınmıştır (Ek-1).

Çalışmaya dahil olan erkek hastalardan mastürbasyon yöntemiyle alınan semen örnekleri steril kapaklı kaplar içerisinde, 37ºC sıcaklıkta 30 dakika likefaksiyon için inkübasyona bırakılmıştır. Pastör pipeti yardımıyla semen viskozitesi değerlendirilmiş ve likefaksiyon görülmeyen semen örnekleri 30 dakika daha inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda da likefaksiyon oluşmayan numuneler çalışma dışı bırakılmıştır. Ayrıca likefaksiyon sonrası aglütinasyon veya agregasyon görülen numuneler de çalışmaya dâhil edilmemiştir.

Ön deneyler için 10 kişiden alınan sperm örneklerine PBS ile 50 μM, 100 μM ve 250 μM lık 3 farklı PAP konsantrasyonu uygulanarak 30, 60, 90 ve 120. dakikalarda CASA otomatik sayım cihazıyla sperm hareketliliğindeki değişimler tespit edilmiştir.

Gradientle ayrıştırma yöntemi sonrası sperm yıkama solüsyonu ile yıkanarak santrifüj edilen sperm örneklerinde CASA cihazıyla motilite ölçümlerinin yapılmasının ardından numuneler sıvı azot buharında dondurulmuştur. Standart çözme prosedürüyle çözme sonrası Kontrol (K) ve PAP (P) olarak 2 gruba ayrılan semen örneklerinden P grubundakilere 100 μM PAP uygulanmıştır. 30. ve 60. dakikalarda CASA cihazıyla hareketlilik, peanut agglutinin (PNA) boyamayla floresan mikroskop (FM) ve flow sitometri (FLS) tekniğiyle akrozom bütünlüğü, AnnexinV- Propidium Iodide (AnV/PI) boyamayla FM ve FLS tekniğiyle erken apoptoz ve canlılık, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Transferase Mediated Nick End-Labeling (TUNEL) FM ve FLS tekniğiyle DNA hasarı oluşumu değerlendirilmiştir.

51 3.1 Materyal

3.1.1 Sperm hücrelerinin ayrıştırılması

PureSperm 45/90 Dansite Gradiyent Medyum (Vitrolife), SpermRinse (Vitrolife, 10101), Santrifüj, İnkübatör (Nuaire, NU-5510).

3.1.2 Sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu ve çözdürülmesi

Kriyotüp, Metal taşıyıcı (Cane), Sperm Freezing Medium (Sperm Dondurma Solüsyonu, Vitrolife), Sıcak su banyosu, PBS (Sigma, P4417).

3.1.3 PAP uygulaması

Papaverin HCl (Galen, 50mg/2ml), PBS (Sigma, P4417).

3.1.4 CASA ile semen analizi

Makler sayım kamarası (Sefi-Medical Instruments), CASA (Hamilton Thorne/ Ceros II)

3.1.5 Peanut Agglutinin-Fluorescein İsothociyanate (PNA-FITC) boyama ile AB tespiti, FM ve FLS tekniği

Floresan mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 451485), Flow sitometri (CytoFLEX, A00-1-1102), Peanut agglutinin (PNA) (FL-1071), İnkübatör (Nuaire, NU-5510), PBS (Sigma, P4417), Lam (Sailbrand-7101), Lamel (Sailbrand), Poli-L-Lizin (Sigma, P8920), ), Hoechst 33258 boya (Abcam, ab228550),Eppendorf Tüp.

52

3.1.6 AnnexinV-FITC/PI boyama ile apoptoz ve canlılık tespiti, FM ve FLS tekniği

Floresan mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 451485), Flow sitometri (CytoFLEX, A00-1-1102), AnnexinV-FITC Apoptosis Kit (Biovision, K101-100), İnkübatör (Nuaire, NU-5510), PBS (Sigma, P4417), Lam (Sailbrand-7101), Lamel (Sailbrand), Poli-L-Lizin (Sigma, P8920)), Hoechst 33258 boya (Abcam, ab228550), Eppendorf Tüp.

3.1.7 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Transferase Mediated Nick End-Labeling (TUNEL) boyama ile DNA hasarı tespiti, FM ve FLS tekniği

Floresan mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 451485), Flow sitometri (CytoFLEX, A00-1-1102), In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche-11684795910), PBS (Sigma, P4417), %4 PFA, %0.1 Triton X-100 (Sigma, X100), Sodyum sitrat tri-basik dihidrat (Sigma-Aldrich 71405), İnkübatör (Nuaire, NU-5510), PBS (Sigma, P4417), Lam (Sailbrand-7101), Lamel (Sailbrand), Poli-L-Lizin (Sigma, P8920), Hoechst 33258 boya (Abcam, ab228550), Eppendorf Tüp.

3.2 Yöntem

3.2.1 Ön deneyler

Semen örnekleri inkübatördeki likefaksiyon sürecinin ardından %45 ve %90’lık silika partikülü içeren gradient (aşamalı ayrıştırma) solüsyonu üzerine alınarak 300g hızda 10 dakika santrifüj yapılmıştır. Süpernatant kısmı uzaklaştırıldıktan sonra 2 ml sperm yıkama solüsyonu (Sperm Rinse) ilave edilerek yeniden 300g hızda 10 dakika santrifüj yapılmıştır. Üstte kalan kısmın ayrılmasının ardından dipte kalan pellet içindeki hücreler CASA cihazında sayı ve motilite yönünden değerlendirilmiştir. Optimal PAP dozunun ve optimal uygulama sürelerinin tespit edilmesi amacıyla yapılan ön deneylerde; 10 kişiden alınan sperm örneklerine PBS içinde hazırlanmış 50 μM, 100 μM ve 250 μM’lık 3 farklı PAP dozu uygulanmış, PAP ilave edilmeyen PBS grubu ise