Sperm Kuyruk Hareketinin Etkinlik Mekanizması

2. KURAMSAL TEMELLER

2.7 Sperm Kuyruk Hareketinin Etkinlik Mekanizması

Sperm hücrelerinin hareketliliğinde sperm kuyruğunun fizyolojik ve fonksiyonel özelliklerinin yanı sıra seminal plazmanın bileşenleri de önem taşır. Sperm kuyruğunun atım hareketinin düzenlenmesinde cAMP, cGMP, Ca²⁺ ve H⁺ gibi ikincil mesajcılar görev yapmaktadır. Pek çok çalışmada özellikle cAMP/cGMP yolağının kuyruk proteinlerinin fosforilasyonu üzerindeki etkinliği ve sperm hareketliliğindeki rolü ortaya konulmuştur (Vijayaraghavan vd. 1997, Buffone vd. 2014, Pereira vd. 2017). cAMP’nin aksonemde lokalize olan PKA’yı aktive etmek suretiyle, cGMP’nin ise PKA ve PKG aracılığıyla Kuyruk Atım Frekansını (KAF) artırdığı ileri sürülmektedir. Hücre içinde artan pH düzeyinin kuyruktaki dynein kollar üzerindeki etkinliğiyle KAF’ın da arttığı bildirilmiştir (Salathe 2007). Sperm proteinlerinin fosforilasyonunun düzenlenmesinde kinaz ve fosfatazların aktivitesi etkilidir. Bunlardan PKA’lar, AC enzimini aktive ederek ATP’den bir fosfatın salınmasına ve cAMP yapımına neden olurlar. Benzer şekilde hücre içinde cAMP ve PKA artışına neden olan çeşitli maddelerin de aksonem ve fibröz kılıf proteinlerinin fosforilasyonuna neden olarak spermlerin hareketliliğinde artışa yol açtığı bilinmektedir (Leclerc vd. 1996). Kuyruktaki dynein kollar ATP varlığında konformasyonel değişime uğrayarak B tübülünden ayrılır ve biraz daha aşağıdan yine aynı tübüle bağlanmak suretiyle kayma hareketini gerçekleştirir.

Tübüldeki bu harekete neksin bağlantılar ve radyal uzantılar direnç gösterdiği için oluşan kayma hareketi bükülmeye dönüşmektedir. Kuyruk hareketi sırasında aksonemdeki dyneinlerin bir kısmı aktifken, diğer kısmı gevşeme halinde bulunmaktadır (Goodman 2011).

Şekil 2.12 Sperm hareketinin etkinlik mekanizması (İnaba 2003)

Memelilerdeki AC enzimleri tmAC (transmembran Adenylyl Cyclase) ve sAC (soluble Adenylyl Cyclase) olmak üzere 2 tiptir. Bunlardan sAC direkt olarak Ca²⁺ ve HCO3−

(Bikarbonat) ile aktifleşirken, tmAC’ler heterotrimetrik G proteinleri tarafından aktive edilir. Serin-treonin kinaz özellikteki PKA’lar bazı ara tirozin kinazları aktive etmek suretiyle serin/ treonin rezidülerini fosforile eder ve komşu proteinlerdeki fosforilasyon kaskadını başlatarak kuyruk hareketini artırıcı etki gösterir (Bajpai ve Doncel 2003, Dey vd. 2014).

Sperm hücrelerinin motilitesinde etkinlik gösteren bir diğer alternatif yolağın da PI3K‘nın inhibisyonu ve HCO3− düzeyinin artışıyla sAC‘nin aktive olması sonucu hücre içi cAMP miktarının artması olduğu düşünülmektedir. cAMP artışı sperm kuyruk proteinlerinden AKAP3 (A Kinaz Anchoring Protein3)’ün fosforilasyonuna neden olarak hareketlilik artışını sağlamaktadır (Luconi vd. 2006). Sperm kuyruğundaki lokalizasyonu nedeniyle AKAP3’ün fosforilasyonu motilitenin artışıyla sonuçlanmakla birlikte, AKAP3-PKA etkileşiminin bozulması motilitenin inhibisyonuna neden olur (Luconi vd. 2005). AKAP3 ve AKAP4’ün insan spermatid ve spermatozoonundaki varlığının belirlenmesiyle birlikte, yoğunlukla kuyrukta yerleştikleri ve sperm hareketliliğinin yanı sıra AR oluşumunda da etkinlik gösterdikleri düşünülmüştür

(Luconi vd. 2011). Benzer şekilde Carr ve arkadaşları yaptıkları çalışmada da cAMP bağımlı PKA’nın R1 ve R2 alt üniteleri aracılığıyla AKAP’a bağlanarak özellikle sil (cilia) ve kuyruk gibi yapıların fonksiyonunda etkili olduğu bildirmiştir (Carr ve Newell 2007). Yapılan farklı çalışmalar da insan sperm hücrelerinde en fazla bulunan fibröz kılıf yapısal proteinleri olarak AKAP3 ve AKAP4’e ve bu proteinlerin sinyal molekülleriyle olan etkileşimine işaret etmektedir (Brown vd. 2003, Eddy vd. 2003).

Sperm hücresinin üzerindeki reseptörlere bağlanan uyarıcıların etkisiyle iyonik değişimler ortaya çıkar ve membran hiperpolarizasyonu, Ca²⁺ kanalları ile hücreye Ca²⁺

girişi ve pH’nin artışı gibi etkiler sonucunda sperm hareketliliğini aktive eden sinyal kaskadı başlatılır. Bu süreçte membran proteinleriyle birlikte voltaj bağımlı veya cGMP bağlı K kanalları, Na⁺/H⁺ – Na⁺/Ca²⁺ ve Na⁺/HCO3^- değiştirici kanalların görev yaptığı düşünülmektedir. Hücre içine Ca²⁺girişine olanak sağlayan Ca²⁺ kanalları ve Na⁺/ Ca²⁺

değiştirici kanallar aracılığıyla ya da hücre içi depolardan Ca²⁺salınımı yoluyla artmış olan Ca²⁺ diğer enzimlerin aktivasyonuna ve kuyruk hareketliliğinde asimetrinin oluşumuna yol açar. Kuyruk atım amplitüdündeki artış ve asimetriyle karakterize olan hiperaktif motilitenin oluşumu, spermin oosite doğru kemotaksisi için gereklidir (Inaba 2003).

50 3. MATERYAL ve YÖNTEM

Çalışmamıza infertilite tedavisi için Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Üremeye Yardımcı Tedavi ve Eğitim (ÜYTE) Merkezi’ne başvuran ve çalışma hakkında bilgilendirilerek onamları alınan 18-50 yaş aralığındaki 20 erkek hasta dâhil edilmiştir.

Sperm konsantrasyonu en az 15 milyon/ml olmakla birlikte progresif (ileri) hareketli sperm oranı % 32’nin ve total hareketli sperm oranı %40’ın üzerinde olan hastaların semen örneklerinden, tedavi için kullanılacak kısım ayrıldıktan sonra geriye kalan kısım çalışma için kullanılmıştır. Çalışma öncesinde Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İlaç Dışı Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’na başvurularak etik kurul onayı alınmıştır (Ek-1).

Çalışmaya dahil olan erkek hastalardan mastürbasyon yöntemiyle alınan semen örnekleri steril kapaklı kaplar içerisinde, 37ºC sıcaklıkta 30 dakika likefaksiyon için inkübasyona bırakılmıştır. Pastör pipeti yardımıyla semen viskozitesi değerlendirilmiş ve likefaksiyon görülmeyen semen örnekleri 30 dakika daha inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda da likefaksiyon oluşmayan numuneler çalışma dışı bırakılmıştır. Ayrıca likefaksiyon sonrası aglütinasyon veya agregasyon görülen numuneler de çalışmaya dâhil edilmemiştir.

Ön deneyler için 10 kişiden alınan sperm örneklerine PBS ile 50 μM, 100 μM ve 250 μM lık 3 farklı PAP konsantrasyonu uygulanarak 30, 60, 90 ve 120. dakikalarda CASA otomatik sayım cihazıyla sperm hareketliliğindeki değişimler tespit edilmiştir.

Gradientle ayrıştırma yöntemi sonrası sperm yıkama solüsyonu ile yıkanarak santrifüj edilen sperm örneklerinde CASA cihazıyla motilite ölçümlerinin yapılmasının ardından numuneler sıvı azot buharında dondurulmuştur. Standart çözme prosedürüyle çözme sonrası Kontrol (K) ve PAP (P) olarak 2 gruba ayrılan semen örneklerinden P grubundakilere 100 μM PAP uygulanmıştır. 30. ve 60. dakikalarda CASA cihazıyla hareketlilik, peanut agglutinin (PNA) boyamayla floresan mikroskop (FM) ve flow sitometri (FLS) tekniğiyle akrozom bütünlüğü, AnnexinV- Propidium Iodide (AnV/PI) boyamayla FM ve FLS tekniğiyle erken apoptoz ve canlılık, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Transferase Mediated Nick End-Labeling (TUNEL) FM ve FLS tekniğiyle DNA hasarı oluşumu değerlendirilmiştir.

51 3.1 Materyal

3.1.1 Sperm hücrelerinin ayrıştırılması

PureSperm 45/90 Dansite Gradiyent Medyum (Vitrolife), SpermRinse (Vitrolife, 10101), Santrifüj, İnkübatör (Nuaire, NU-5510).

3.1.2 Sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu ve çözdürülmesi

Kriyotüp, Metal taşıyıcı (Cane), Sperm Freezing Medium (Sperm Dondurma Solüsyonu, Vitrolife), Sıcak su banyosu, PBS (Sigma, P4417).

3.1.3 PAP uygulaması

Papaverin HCl (Galen, 50mg/2ml), PBS (Sigma, P4417).

3.1.4 CASA ile semen analizi

Makler sayım kamarası (Sefi-Medical Instruments), CASA (Hamilton Thorne/ Ceros II)

3.1.5 Peanut Agglutinin-Fluorescein İsothociyanate (PNA-FITC) boyama ile AB tespiti, FM ve FLS tekniği

Floresan mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 451485), Flow sitometri (CytoFLEX, A00-1-1102), Peanut agglutinin (PNA) (FL-1071), İnkübatör (Nuaire, NU-5510), PBS (Sigma, P4417), Lam (Sailbrand-7101), Lamel (Sailbrand), Poli-L-Lizin (Sigma, P8920), ), Hoechst 33258 boya (Abcam, ab228550),Eppendorf Tüp.

3.1.6 AnnexinV-FITC/PI boyama ile apoptoz ve canlılık tespiti, FM ve FLS tekniği

Floresan mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 451485), Flow sitometri (CytoFLEX, A00-1-1102), AnnexinV-FITC Apoptosis Kit (Biovision, K101-100), İnkübatör (Nuaire, NU-5510), PBS (Sigma, P4417), Lam (Sailbrand-7101), Lamel (Sailbrand), Poli-L-Lizin (Sigma, P8920)), Hoechst 33258 boya (Abcam, ab228550), Eppendorf Tüp.

3.1.7 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Transferase Mediated Nick End-Labeling (TUNEL) boyama ile DNA hasarı tespiti, FM ve FLS tekniği

Floresan mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 451485), Flow sitometri (CytoFLEX, A00-1-1102), In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche-11684795910), PBS (Sigma, P4417), %4 PFA, %0.1 Triton X-100 (Sigma, X100), Sodyum sitrat tri-basik dihidrat (Sigma-Aldrich 71405), İnkübatör (Nuaire, NU-5510), PBS (Sigma, P4417), Lam (Sailbrand-7101), Lamel (Sailbrand), Poli-L-Lizin (Sigma, P8920), Hoechst 33258 boya (Abcam, ab228550), Eppendorf Tüp.

3.2 Yöntem

3.2.1 Ön deneyler

Semen örnekleri inkübatördeki likefaksiyon sürecinin ardından %45 ve %90’lık silika partikülü içeren gradient (aşamalı ayrıştırma) solüsyonu üzerine alınarak 300g hızda 10 dakika santrifüj yapılmıştır. Süpernatant kısmı uzaklaştırıldıktan sonra 2 ml sperm yıkama solüsyonu (Sperm Rinse) ilave edilerek yeniden 300g hızda 10 dakika santrifüj yapılmıştır. Üstte kalan kısmın ayrılmasının ardından dipte kalan pellet içindeki hücreler CASA cihazında sayı ve motilite yönünden değerlendirilmiştir. Optimal PAP dozunun ve optimal uygulama sürelerinin tespit edilmesi amacıyla yapılan ön deneylerde; 10 kişiden alınan sperm örneklerine PBS içinde hazırlanmış 50 μM, 100 μM ve 250 μM’lık 3 farklı PAP dozu uygulanmış, PAP ilave edilmeyen PBS grubu ise

kontrol grubu olarak seçilmiştir. PAP uygulamasının ardından 30, 60, 90 ve 120.

dakikalarda CASA otomatik sayım cihazıyla motilitedeki artış oranları belirlenmiştir.

3.2.2 Deneyler

Ön deneylerden elde edilen CASA ölçüm verilerine göre 100 μM PAP dozunun diğer konsantrasyon grupları ile karşılaştırıldığında 30 dakika süreyle en yüksek hareketlilik oranının elde edildiği doz olması nedeniyle deneylerde kullanılacak olan PAP konsantrasyonu (PBS içinde) 100 μM olarak belirlenmiştir. Deney grupları aşağıdaki şekilde planlanmıştır:

1. Dondurma öncesi grup (1. grup-Taze semen) T

2. Dondurma-çözme sonrası grup (2. grup- Kontrol grubu) K 3. Dondurma-çözme sonrası Papaverin uygulanan grup (3. grup) P

Şekil 3.1 Deney planı şeması

Yıkanmış olan semen örneği 2 tüpe ayrılmış ve 1.tüptekilere KP işlemi uygulanırken, 2.

tüptekiler ise Taze semen (T) grubu olarak değerlendirilmiştir. T grubundaki hücrelerin CASA ile hareketlilik ölçümü yapılmış ve PNA boyama ile AB, AnnexinV-PI boyama ile FST oluşumu ve canlılık, TUNEL boyama ile de DNA hasar oranı belirlenmiştir.

3.2.2.1 KP ve çözme prosedürü

Yıkanmış sperm örnekleri 1/1 oranda kriyoprotektan solüsyon (Sperm Freeze Solution, Vitrolife) ile muamele edilerek kriyovial tüplerde oda sıcaklığında 5 dk bekletilmiş, ardından sıvı azot buharı üzerinde 20 dk tutulmuştur. Dondurulmuş olan numuneler -196°C'lik sıvı azot tanklarında, çözme sonrası deney aşamasına kadar 1 hafta saklanmıştır. Dondurulmuş spermlerin çözülmesi sırasında azot tanklarından çıkarılan kriyovial tüpler 37°C’lik sıcak su banyosunda 5 dk hafif hareketlerle çalkalanmıştır.

Santrifüj tüpüne alınan numunelerden kriyoprotektanın uzaklaştırılması için ise 2 ml PBS eklenerek 300g de 5 dk süreyle santrifüj edildikten sonra üstte kalan kısım uzaklaştırılmıştır. Çözme sonrası sperm süspansiyonu 4 farklı tüpe ayrılarak K30, K60, P30 ve P60 grupları oluşturulmuştur.

3.2.2.2 PAP uygulaması

Papaverin HCl flakon çözeltisi PBS ile karıştırılarak 100 μM PAP dozu hazırlanmış ve P30 ve P60 tüpü içindeki sperm hücreleri üzerine ilave edilmiştir. K30 ve K60 tüpündeki hücrelere ise herhangi bir işlem uygulanmamıştır. 37°C‘lik inkübatörde K30 ve P30 tüpleri 30 dakika, K60 ve P60 tüpleri ise 60 dakika inkübasyona bırakılmıştır.

3.2.2.3 CASA ile hareketlilik ölçümleri

30 dakikalık inkübasyon sonrasında K30 ve P30 tüplerindeki semen örneklerinden 5 μl alınarak Makler sayım kamarasına yerleştirilmiş ve her örnekten en az 5 farklı alanda görüntü kaydedilerek motilite parametreleri ölçülmüştür. 60 dakikalık süre sonunda aynı ölçümler K60 ve P60 tüplerindeki sperm numunelerinde de yapılmıştır.

3.2.2.4 PNA-FITC boyama yöntemi ile AB’nin tespiti

Sperm hücrelerinde AR geçirmiş ve geçirmemiş olan spermlerin belirlenmesi için PNA-FITC (Peanut Agglutinin-conjugated Fluorescein Isothiocyanate, Vector Lab.) boyası kullanılmıştır. Sperm hücreleri PBS ile seyreltilmek suretiyle 2 milyon/ml konsantrasyonda eppendorf tüplere alınarak 300g de 10 dakika santrifüj edilmiştir.

Üstteki süpernatanın ayrılmasının ardından, pellette kalan hücrelerin üzerine 500 μl PNA boyama solüsyonu eklenmiştir. 37°C’lik inkübatörde karanlık ortamda 15 dakika inkübe edilen sperm örnekleri;

1-FM görüntülemesi için Poli-l-lizinle kaplanmış lameller üzerine ince bir tabaka halinde yayılarak preparat hazırlanmıştır. Hoechst boyası damlatılarak üzeri lamelle kapatılan preparatlar FM’de x100 büyütmede incelenmiştir. Her preparatta 200 hücre sayılarak değerlendirme yapılmıştır. Deneylerde kullanılan Hoechst boyası 352 nm eksitasyon ve 461 nm emisyonda mavi renkte ışıma verirken, FITC ise 480-530 nm’de yeşil renkte izlenir.

2-FLS cihazında ölçüm yapılmak üzere ependorf tüp içine alınan sperm örnekleri Flow sitometriden geçirilerek FL1 panelinde (525/40 nm bant aralığında) 30.000 hücrede floresan ışıma değerlendirmesi yapılmıştır.

3.2.2.5 AnnexinV-FITC/PI boyama ile apoptoz ve canlılık tespiti

Apoptozun bir belirteci olarak FS'nin membranın iç yüzünden dış yüzüne translokasyonunu belirlemek için Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Biovision) kullanılmıştır. 2 milyon/ml konsantrasyonda hazırlanan 500 μl sperm örneği üzerine 500 μl binding buffer ilave edilmiştir. Her tüpe 5 μl Annexin V-FITC ve 5 μl PI eklenerek karanlıkta oda sıcaklığında 5 dk spermatozoonların boyanması için bekletilmiştir. Daha sonra 500 μl PBS ilave edilerek 300g de 10 dakika santrifüj edilerek hücre süspansiyonu yıkanmıştır. Süpernatanın ayrılmasından sonra pellet üzerine 300 μl PBS eklenerek 5 sn vortekslenmiş sperm süspansiyonundan;

1-FM görüntülemesi için Poli-l-lizinle kaplanmış lamellere yayılarak preparat hazırlanmıştır. Hoechst boyası ile üzeri kapatılan preparatlar floresan mikroskopta x100 büyütmede incelenmiştir. Her preparatta 200 hücre sayılarak, hücrelerin boyayı içine alıp almamasına göre oluşan floresan ışıma rengine göre değerlendirme yapılmıştır. PI boyası 580-630 nm’de kırmızı renkte görüntü vermektedir. Anneksin V(-)/PI(-) boyanan hücreler canlı ve apoptotik olmayan, Anneksin V(+)/PI(-) boyanan hücreler erken apoptotik, Anneksin V(+)/PI(+) boyanan hücreler geç apoptotik/nekrotik, Anneksin V(-)/PI(+) boyanan hücreler ölü/ nekrotik, olarak değerlendirilmiştir.

2- FLS tekniğiyle ölçüm yapılmak üzere eppendorf tüp içine alınan sperm örnekleri FLS cihazından geçirilerek dakikada 60-150 hücre geçecek şekilde toplam 30.000 hücrede floresan ışıma değerlendirmesi yapılmıştır. FLS okuma panelleri olarak Annexin V-FITC için FL1 paneli ve PI için FL2 paneli kullanılmıştır. Numunelerin analizi sonucunda elde edilen apoptoz bulguları, FLS cihazında kadran istatistiği ile (%) canlı ve apoptotik olmayan, erken apoptotik, geç apoptotik/nekrotik, ölü/nekrotik olarak değerlendirilmiştir.

3.2.2.6 TUNEL boyama ile DNA hasarı tespiti

Sperm hücrelerindeki DNA hasarı oranlarını belirlemek amacıyla In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) ile TUNEL boyama yapılmıştır. Sperm hücreleri PBS ile dilüsyon yapılarak 5 milyon/ml konsantrasyonda hazırlanmış ve ependorf tüp içinde 300g de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Süpernatantın ayrılmasının ardından spermatozoonların fiksasyonunu gerçekleştirmek için 100 μl %4’lük PFA solüsyonu ilave edilerek 60 dakika oda sıcaklığında karanlık ortamda bekletilmiştir. 1 saatin ardından 500 μl PBS ilave edilip 300g de 10 dakika santrifüj edilerek yıkama yapılmıştır. Üstte kalan kısmın atılmasınından sonra ise 100 μl permeabilizasyon solüsyonu (%0,1 Triton X-100 ve %0,1 Sodium Citrate) eklenerek 5 dakika buz üzerinde bekletilmiştir. Yeniden PBS ile yıkanan sperm örnekleri 300 g de 10 dakika santrifüj edilerek süpernatanı uzaklaştırılmıştır. Sperm hücreleri üzerine;

Negatif kontrol için sadece 50 μl Label solüsyonu ilave edilmiş

TUNEL boyama için ise TUNEL Mix solüsyonundan (50 μl enzim Solüsyonu + 450 μl Label Solüsyonu) 50 μl ilave edilmiştir.

37 °C’lik inkübatörde 1 saat karanlık ortamda inkübasyonun ardından 500 μl PBS ile yıkama yapılmıştır. 300g de 10 dakika santrifüj edilen sperm örneklerinden süpernatant kısmı uzaklaştırılmıştır. Negatif (sadece işaretleyici) ve TUNEL karışım (enzim+işaretleyici) solüsyonlarıyla boyanmış olan sperm hücreleri;

1- FM görüntülemesi için Poli-l-lizinle kaplanmış lamellere damlatılıp yayılarak preparat hazırlanmıştır. Hoechst boyası ile üzeri kapatılan preparatlar FM’de x100 büyütmede incelenmiştir. Her preparatta en az 200 hücre sayımı yapılarak yeşil ışıma gözlenen spermatozooa DNA fragmantasyonu (+) olarak değerlendirilmiştir.

2-Ependorf tüp içine alınarak Flow sitometriden geçirilmiş ve FL1 panelinde (525/40 nm) bant aralığında 10.000 hücrede floresan ışıma değerlendirmesi yapılmıştır.

3.2.2.7 İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, v.15, ABD) paket programı kullanılarak yapılmıştır. Tanımlayıcı istatistikler sayısal değişkenler için ortalama ± standart sapma, nominal değişkenler için ise vaka sayısı (%) olarak verilmiştir. Aynı kişilere ait sperm örneklerinin farklı şartlarda incelendiği gruplara ait farklılıklar Tekrarlı Ölçümlerde Varyans Analizi metodu ile incelenmiştir ve p<0,05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

58 4. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.1 Ön Deney Bulguları:

Şekil 4.1 CASA motilite tespiti ve farklı PAP dozlarının zamana bağlı ileri motilite (%) değişim grafiği. 50 μM, 100 μM, 250 μM PAP ve kontrol grubunun 30, 60, 90, 120

dakikalarda A grup hareketlilik oranı % olarak belirtilmiştir

10 hastadan alınmış olan semen numunelerinin KP sonrası çözdürülmesinin ardından spermler üzerine PBS ile 50 μM, 100 μM ve 250 μM lık 3 farklı PAP dozu uygulanmış, PAP ilave edilmeyen PBS grubu ise kontrol grubu olarak seçilmiştir. PAP uygulamasının ardından 30, 60, 90 ve 120. dakikalarda CASA otomatik sayım cihazıyla

motilite ölçümü yapılmıştır. Değişen dozların, farklı sürelerde ileri hareketlilik oranlarına etkisi yukarıdaki şekilde gösterilmiştir.

Gruplar arasındaki motilite artışı karşılaştırıldığında 100 µM PAP dozunun 50 ve 250 µM’lık dozlara göre A grup motilitede en fazla artışın sağlandığı konsantrasyon olduğu belirlenmiştir. 30. dakikadan sonra motilitedeki artış hızı tüm gruplarda yavaşlamaya başlamış ve 120. dakikada kontrol grubu dâhil tüm gruplarda istatistiksel olarak anlamlı derecede azalma olduğu belirlenmiştir (p<0,05). Ön deneylerde elde ettiğimiz veriler ışığında sperm hücreleri üzerindeki PAP etkinliği göz önüne alınarak deneylerimizde 100 µM PAP dozunun kullanılmasına ve en yüksek motilite artışının görüldüğü 30-60 dakikalık sürelerin uygulanmasına karar verilmiştir.

4.2 Deney Bulguları

4.2.1 CASA motilite ölçümleri

Sperm motilite değerlendirmelerinde CASA sonuçları aşağdaki çizelgede gösterilmiştir.

Çizelge 4.1 Deney gruplarının A, B, C grup hareketlilik ortalamaları. Farklı harfler

T 49,08±10,65^a 21,94±5,41^a 28,96±10,18^a

K30 11,89±5,62^b 13,84±4,02^b 74,26±6,14^b

K60 11,81±5,03^b 13,91±3,51^b 74,32±6,10^b

P30 15,96±5,61^c 16,17±5,92^b 67,85±6,90^c

P60 16,86±5,50^c 14,98±5,41^b 68,15±7,31^c

Şekil 4.2 Deney gruplarının A, B, C, TM grup hareketlilik ortalamaları. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (a,b için p<0,05; c için p<0,01)

Bonferonni düzeltmeli çoklu karşılaştırma testi sonuçlarına göre, A grup ileri hareketlilik için T grubunun ortalaması %49,09±10,7 iken, K30, K60, P30, P60 grupları için ortalamaları sırasıyla %11,90±5,62; %11,81±5,04; %15,97±5,61; %16,86±5,51 olup, T grubunun ortalaması istatistiksel olarak diğer gruplardan anlamlı olacak şekilde yüksektir. (Bütün ikili karşılaştırmalar için; p<0,01 ). Benzer şekilde P gruplarında (P30, P60) ile K gruplarına (K30, K60) göre A grup ileri motilite değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı artışın olduğu belirlenmiştir (p<0,05). K ve P gruplarında A grup hareketliliğin zamana bağlı değişimi K30, K60 için (p=1,000) ve P30, P60 için (p=0,641) olarak tespit edilmiş ve aralarında anlamlı bir fark bulunmamıştır.

B grup yerinde hareketlilik için T grubunun ortalaması %21,95±5,42 iken, , K30, K60, P30, P60 grupları için ortalamaları sırasıyla %13,85±4,03; %13,91±3,52; %16,18±5,93;

%14,99±5,41 olup, T grubunun ortalaması istatistiksel olarak diğer gruplardan anlamlı olacak şekilde yüksektir (p<0,05). K ve P grupları arasında B grup motilite değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmemiştir (P>0,05).

C grup hareketsiz spermler için T grubunun ortalamasının %28,97±10,18, diğer gruplar için ortalamanın sırasıyla %74,26±6,15; %74,33±6,10; %67,86±6,90; %68,16±7,32 olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’ tan anlamlı derecede düşük olduğu saptanmıştır (p<0,01). C grup motilite ortalamaları karşılaştırıldığında K30 ve K60 grubuna göre P30 ve P60 grubunda istatistiksel olarak anlamlı olarak azalmanın olduğu görülmüştür (p<0,05). K30 ile K60 grupları arasında ve P30 ile P60 grupları arasında hareketsiz spermatozoa oranı bakımından anlamlı bir farklılık bulunmadığı belirlenmiştir (p>0,05).

TM (Total Motilite=A+B) grubu için T grubunun ortalamasının %71,03±10,19, diğer gruplar için ortalamanın sırasıyla %25,74±6,15; %25,72±6,23; %32,14±6,90;

%31,84±7,32) olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede yüksek olduğu saptanmıştır (p<0,01). TM grup ortalamaları karşılaştırıldığında K30 ve K60 grubuna göre P30 ve P60 grubunda istatistiksel olarak anlamlı olarak artışın olduğu görülmüştür (p<0,05). K30, K60 grubu arasında ve P30, P60 grubu arasında ve TM spermatozoa oranları bakımından bir farklılık bulunmadığı saptanmıştır (P>0,05).

Sperm hücrelerinin hareketlilik parametrelerine ait detaylı CASA verileri Çizelge 4.2’de özetlenmiştir.

Çizelge 4.2 Deney gruplarının CASA hareketlilik parametrelerinin ortalama değerleri.

Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05)

T K30 K60 P30 P60

4.2.2 PNA-FITC boyama yöntemi ile AB tespiti deneylerinde FM ve FLS bulguları

Şekil 4.3 PNA boyama sonrası FM görüntüleri. Orijinal büyütme x100. A- Hoechst(+) mavi renk alandaki toplam sperm hücrelerini, B- PNA-FITC(+) yeşil renk ise AR

geçirmemiş spermleri göstermektedir

Şekil 4.4 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 Deney gruplarının AB oranları

Şekil 4.4 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 Deney gruplarının AB oranları (devam)

Şekil 4.5. Deney gruplarının AB ortalama değerleri. Gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır (P>0,05)

KP işlemi öncesinde taze spermlerde ve KP sonrası 30 ve 60. dakikalarda Kontrol grubu ve PAP ilave edilmiş gruptaki sperm hücrelerinin akrozom bütünlüğünde ortaya çıkan değişimleri saptamak için yapılan PNA-FITC boyamada elde edilen verilere göre KP işlemi AB oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. AB için T grubunun ortalaması %86,20±12,02 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %79,54±13,32; %77,76±15,70; %79,64±13,97; %78,30±16,13) olduğu belirlenmiştir (P>0,05).

4.2.3 AnV-FITC/PI boyama yöntemi ile apoptoz oluşumu ve canlılık deneylerinde FM ve FLS bulguları

Şekil 4.6 AnV/PI boyama sonrası FM görüntüleri. Orjinal büyütme x100. A, C, E alandaki toplam sperm hücrelerini; B, D, F İmmünfloresan boyama sonrası sperm hücrelerini göstermektedir. Hoechst(+) spermler mavi renkte, PI(+) spermler kırmızı

renkte, AnV(+) spermler yeşil renkte görülmektedir

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. Kadranlar sırasıyla Q1-LL; AnV(-)/PI(-), Q1-LR; AnV(+)/PI(-), Q1-UR

AnV(+)/PI(+), Q1-UL AnV(-)/PI(+) bölgeleri göstermektedir

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. Kadranlar sırasıyla Q1-LL; AnV(-)/PI(-), Q1-LR; AnV(+)/PI(-), Q1-UR

AnV(+)/PI(+), Q1-UL AnV(-)/PI(+) bölgeleri göstermektedir (devam)

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. Kadranlar sırasıyla Q1-LL; AnV(-)/PI(-), Q1-LR; AnV(+)/PI(-), Q1-UR

AnV(+)/PI(+), Q1-UL AnV(-)/PI(+) bölgeleri göstermektedir (devam)

Şekil 4.8 Deney gruplarının apoptoz ve canlılık oranları dağılımı. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05)

KP işlemi öncesinde ve KP sonrasında çözdürülen sperm hücrelerinde PAP uygulanan ve uygulanmayan grupta 30. ve 60. dakikalarda sperm membranında ortaya çıkan değişimlerin tespiti için floresan işaretli AnV yardımıyla FST oranı ve PI(+) boyanan hücre sayısı belirlenmiştir.

AnV(-)/PI(-) grubu için T grubunun ortalaması %73,61±12,69 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %32,89±13,39; %30,06±11,10; %32,64±12,89;

%29,29±11,78 olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede yüksek olduğu saptanmıştır (p<0,01). P30 ile P60 grubu arasındaki azalma da istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,019).

AnV(+)/PI(-) grubu için T grubunun ortalamasının %2,22±1,59 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %1,83±0,83; %1,94±0,82; %2,18±1,03;

%2,19±0,93 olduğu belirlenmiş ve istatistiksel olarak T, K30, K60, P30, P60 grupları arasında anlamlı bir değişikliğin olmadığı saptanmıştır (P>0,05).

AnV(-)/PI(+) grubu için T grubunun ortalamasının %13,05±8,09 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %34,81±17,43; %38,05±17,03; %32,86±17,75;

%36,40±17,09) olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0,01). P30 ile P60 grubu arasında artış görülmekle birlikte istatistiksel olarak anlamlı olmadığı saptanmıştır (P=0,066).

AnV(+)/PI(+) grubu için T grubunun ortalamasının %11,12±7,92 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %30,41±17,62; %29,96±16,94; %32,32±19,59;

%32,14±18,38 olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0,01). An(+)/PI(+)

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ (sayfa 62-0)