İstatistiksel analiz - MATERYAL ve YÖNTEM

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.2 Yöntem

3.2.2 Deneyler

3.2.2.7 İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, v.15, ABD) paket programı kullanılarak yapılmıştır. Tanımlayıcı istatistikler sayısal değişkenler için ortalama ± standart sapma, nominal değişkenler için ise vaka sayısı (%) olarak verilmiştir. Aynı kişilere ait sperm örneklerinin farklı şartlarda incelendiği gruplara ait farklılıklar Tekrarlı Ölçümlerde Varyans Analizi metodu ile incelenmiştir ve p<0,05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

58 4. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.1 Ön Deney Bulguları:

Şekil 4.1 CASA motilite tespiti ve farklı PAP dozlarının zamana bağlı ileri motilite (%) değişim grafiği. 50 μM, 100 μM, 250 μM PAP ve kontrol grubunun 30, 60, 90, 120

dakikalarda A grup hareketlilik oranı % olarak belirtilmiştir

10 hastadan alınmış olan semen numunelerinin KP sonrası çözdürülmesinin ardından spermler üzerine PBS ile 50 μM, 100 μM ve 250 μM lık 3 farklı PAP dozu uygulanmış, PAP ilave edilmeyen PBS grubu ise kontrol grubu olarak seçilmiştir. PAP uygulamasının ardından 30, 60, 90 ve 120. dakikalarda CASA otomatik sayım cihazıyla

motilite ölçümü yapılmıştır. Değişen dozların, farklı sürelerde ileri hareketlilik oranlarına etkisi yukarıdaki şekilde gösterilmiştir.

Gruplar arasındaki motilite artışı karşılaştırıldığında 100 µM PAP dozunun 50 ve 250 µM’lık dozlara göre A grup motilitede en fazla artışın sağlandığı konsantrasyon olduğu belirlenmiştir. 30. dakikadan sonra motilitedeki artış hızı tüm gruplarda yavaşlamaya başlamış ve 120. dakikada kontrol grubu dâhil tüm gruplarda istatistiksel olarak anlamlı derecede azalma olduğu belirlenmiştir (p<0,05). Ön deneylerde elde ettiğimiz veriler ışığında sperm hücreleri üzerindeki PAP etkinliği göz önüne alınarak deneylerimizde 100 µM PAP dozunun kullanılmasına ve en yüksek motilite artışının görüldüğü 30-60 dakikalık sürelerin uygulanmasına karar verilmiştir.

4.2 Deney Bulguları

4.2.1 CASA motilite ölçümleri

Sperm motilite değerlendirmelerinde CASA sonuçları aşağdaki çizelgede gösterilmiştir.

Çizelge 4.1 Deney gruplarının A, B, C grup hareketlilik ortalamaları. Farklı harfler

T 49,08±10,65^a 21,94±5,41^a 28,96±10,18^a

K30 11,89±5,62^b 13,84±4,02^b 74,26±6,14^b

K60 11,81±5,03^b 13,91±3,51^b 74,32±6,10^b

P30 15,96±5,61^c 16,17±5,92^b 67,85±6,90^c

P60 16,86±5,50^c 14,98±5,41^b 68,15±7,31^c

Şekil 4.2 Deney gruplarının A, B, C, TM grup hareketlilik ortalamaları. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (a,b için p<0,05; c için p<0,01)

Bonferonni düzeltmeli çoklu karşılaştırma testi sonuçlarına göre, A grup ileri hareketlilik için T grubunun ortalaması %49,09±10,7 iken, K30, K60, P30, P60 grupları için ortalamaları sırasıyla %11,90±5,62; %11,81±5,04; %15,97±5,61; %16,86±5,51 olup, T grubunun ortalaması istatistiksel olarak diğer gruplardan anlamlı olacak şekilde yüksektir. (Bütün ikili karşılaştırmalar için; p<0,01 ). Benzer şekilde P gruplarında (P30, P60) ile K gruplarına (K30, K60) göre A grup ileri motilite değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı artışın olduğu belirlenmiştir (p<0,05). K ve P gruplarında A grup hareketliliğin zamana bağlı değişimi K30, K60 için (p=1,000) ve P30, P60 için (p=0,641) olarak tespit edilmiş ve aralarında anlamlı bir fark bulunmamıştır.

B grup yerinde hareketlilik için T grubunun ortalaması %21,95±5,42 iken, , K30, K60, P30, P60 grupları için ortalamaları sırasıyla %13,85±4,03; %13,91±3,52; %16,18±5,93;

%14,99±5,41 olup, T grubunun ortalaması istatistiksel olarak diğer gruplardan anlamlı olacak şekilde yüksektir (p<0,05). K ve P grupları arasında B grup motilite değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmemiştir (P>0,05).

C grup hareketsiz spermler için T grubunun ortalamasının %28,97±10,18, diğer gruplar için ortalamanın sırasıyla %74,26±6,15; %74,33±6,10; %67,86±6,90; %68,16±7,32 olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’ tan anlamlı derecede düşük olduğu saptanmıştır (p<0,01). C grup motilite ortalamaları karşılaştırıldığında K30 ve K60 grubuna göre P30 ve P60 grubunda istatistiksel olarak anlamlı olarak azalmanın olduğu görülmüştür (p<0,05). K30 ile K60 grupları arasında ve P30 ile P60 grupları arasında hareketsiz spermatozoa oranı bakımından anlamlı bir farklılık bulunmadığı belirlenmiştir (p>0,05).

TM (Total Motilite=A+B) grubu için T grubunun ortalamasının %71,03±10,19, diğer gruplar için ortalamanın sırasıyla %25,74±6,15; %25,72±6,23; %32,14±6,90;

%31,84±7,32) olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede yüksek olduğu saptanmıştır (p<0,01). TM grup ortalamaları karşılaştırıldığında K30 ve K60 grubuna göre P30 ve P60 grubunda istatistiksel olarak anlamlı olarak artışın olduğu görülmüştür (p<0,05). K30, K60 grubu arasında ve P30, P60 grubu arasında ve TM spermatozoa oranları bakımından bir farklılık bulunmadığı saptanmıştır (P>0,05).

Sperm hücrelerinin hareketlilik parametrelerine ait detaylı CASA verileri Çizelge 4.2’de özetlenmiştir.

Çizelge 4.2 Deney gruplarının CASA hareketlilik parametrelerinin ortalama değerleri.

Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05)

T K30 K60 P30 P60

4.2.2 PNA-FITC boyama yöntemi ile AB tespiti deneylerinde FM ve FLS bulguları

Şekil 4.3 PNA boyama sonrası FM görüntüleri. Orijinal büyütme x100. A- Hoechst(+) mavi renk alandaki toplam sperm hücrelerini, B- PNA-FITC(+) yeşil renk ise AR

geçirmemiş spermleri göstermektedir

Şekil 4.4 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 Deney gruplarının AB oranları

Şekil 4.4 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 Deney gruplarının AB oranları (devam)

Şekil 4.5. Deney gruplarının AB ortalama değerleri. Gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır (P>0,05)

KP işlemi öncesinde taze spermlerde ve KP sonrası 30 ve 60. dakikalarda Kontrol grubu ve PAP ilave edilmiş gruptaki sperm hücrelerinin akrozom bütünlüğünde ortaya çıkan değişimleri saptamak için yapılan PNA-FITC boyamada elde edilen verilere göre KP işlemi AB oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. AB için T grubunun ortalaması %86,20±12,02 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %79,54±13,32; %77,76±15,70; %79,64±13,97; %78,30±16,13) olduğu belirlenmiştir (P>0,05).

4.2.3 AnV-FITC/PI boyama yöntemi ile apoptoz oluşumu ve canlılık deneylerinde FM ve FLS bulguları

Şekil 4.6 AnV/PI boyama sonrası FM görüntüleri. Orjinal büyütme x100. A, C, E alandaki toplam sperm hücrelerini; B, D, F İmmünfloresan boyama sonrası sperm hücrelerini göstermektedir. Hoechst(+) spermler mavi renkte, PI(+) spermler kırmızı

renkte, AnV(+) spermler yeşil renkte görülmektedir

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. Kadranlar sırasıyla Q1-LL; AnV(-)/PI(-), Q1-LR; AnV(+)/PI(-), Q1-UR

AnV(+)/PI(+), Q1-UL AnV(-)/PI(+) bölgeleri göstermektedir

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. Kadranlar sırasıyla Q1-LL; AnV(-)/PI(-), Q1-LR; AnV(+)/PI(-), Q1-UR

AnV(+)/PI(+), Q1-UL AnV(-)/PI(+) bölgeleri göstermektedir (devam)

Şekil 4.7 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 gruplarının apoptoz ve canlılık oranları. Kadranlar sırasıyla Q1-LL; AnV(-)/PI(-), Q1-LR; AnV(+)/PI(-), Q1-UR

AnV(+)/PI(+), Q1-UL AnV(-)/PI(+) bölgeleri göstermektedir (devam)

Şekil 4.8 Deney gruplarının apoptoz ve canlılık oranları dağılımı. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05)

KP işlemi öncesinde ve KP sonrasında çözdürülen sperm hücrelerinde PAP uygulanan ve uygulanmayan grupta 30. ve 60. dakikalarda sperm membranında ortaya çıkan değişimlerin tespiti için floresan işaretli AnV yardımıyla FST oranı ve PI(+) boyanan hücre sayısı belirlenmiştir.

AnV(-)/PI(-) grubu için T grubunun ortalaması %73,61±12,69 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %32,89±13,39; %30,06±11,10; %32,64±12,89;

%29,29±11,78 olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede yüksek olduğu saptanmıştır (p<0,01). P30 ile P60 grubu arasındaki azalma da istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,019).

AnV(+)/PI(-) grubu için T grubunun ortalamasının %2,22±1,59 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %1,83±0,83; %1,94±0,82; %2,18±1,03;

%2,19±0,93 olduğu belirlenmiş ve istatistiksel olarak T, K30, K60, P30, P60 grupları arasında anlamlı bir değişikliğin olmadığı saptanmıştır (P>0,05).

AnV(-)/PI(+) grubu için T grubunun ortalamasının %13,05±8,09 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %34,81±17,43; %38,05±17,03; %32,86±17,75;

%36,40±17,09) olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0,01). P30 ile P60 grubu arasında artış görülmekle birlikte istatistiksel olarak anlamlı olmadığı saptanmıştır (P=0,066).

AnV(+)/PI(+) grubu için T grubunun ortalamasının %11,12±7,92 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %30,41±17,62; %29,96±16,94; %32,32±19,59;

%32,14±18,38 olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0,01). An(+)/PI(+) grubu için K ve P grupları arasında istatistiksel anlamda anlamlı bir değişim olmadığı gözlenmiştir (P>0,05).

4.2.4 TUNEL boyama yöntemi ile DNA hasarı oluşumu tespitinde FM ve FLS bulguları

Şekil 4.9 TUNEL boyama sonrası FM görüntüleri. Orijinal büyütme x100. A, C- Alandaki toplam sperm hücreleri; B, D- İmmünfloresan boyama sonrası sperm hücreleri. Mavi renk Hoechst(+) spermi, yeşil renk TUNEL(+) spermi belirtmektedir

Şekil 4.10 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 deney gruplarının DNA hasarı oranları

Şekil 4.10 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 deney gruplarının DNA hasarı oranları (devam)

KP işlemi öncesinde ve KP sonrasında çözdürülen sperm hücrelerinde PAP uygulanan ve uygulanmayan grupta 30. ve 60. dakikalarda sperm DNA’sında oluşan hasar oranlarının belirlenmesi için TUNEL ile floresan boyama yapılmıştır. TUNEL(+) grubu için T grubunun ortalaması %17,53±8,02 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %22,90±9,72; %22,83±10,17; %22,67±9,93; %23,21±10,33) olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0,01). Ancak TUNEL(+) grubu için K ve P grupları ortalamaları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılığın olmadığı gözlenmiştir (P>0,05).

Şekil 4.11 Deney gruplarının DNA hasarı oranları. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05)

77 5. TARTIŞMA ve SONUÇ

Sperm hücreleri KP ve çözme prosedürleri sırasında maruz kaldıkları ısı değişimleri, buz kristali oluşumu, ozmotik şok, ROT oluşumu ve KPM toksisitesi gibi etkiler nedeniyle kriyohasara uğramaktadır. Sperm hücre membranları çoklu doymamış yağ asiti içeriğinin yüksek olması nedeniyle bu etkilere karşı oldukça hassastır. Membran yapılarında oluşan hasara bağlı olarak mitokondrilerde de ΔΨm de azalma ve fonksiyonel kayıpların ortaya çıktığı bilinmektedir. Mitokondriler, enerji metabolizmasının ve hücre canlılığının devamı için hayati öneme sahip organeller olması bakımından kriyohasara uğramaları halinde sperm hücrelerinin canlılık ve hareketlilik oranı ile fertilizasyon kapasitesi olumsuz etkilenmektedir. Günümüzde farklı KPM’ler ve farklı KP yöntemleri kullanılmakla birlikte şimdiye kadar yapılmış pek çok sperm KP çalışmasında sperm hareketliliğinde çözme sonrası % 30-75’e varan oranlarda azalmanın olduğu bildirilmiştir (Keel vd. 1987, Hammadeh vd. 1999, Esteves vd. 2000, Nijs vd. 2009).

Punyatanasakchai ve arkadaşlarının iki farklı KP yönteminin etkinliğini karşılaştırdığı çalışmada çözme sonrası ileri motilitede yaklaşık %60 oranında azalmanın yanısıra, normal morfolojideki spermatozoa sayısında da %50’ye varan oranlarda düşüşün olduğu tespit edilmiştir. Hızlı dondurma yönteminin azot buharında dondurma yöntemine göre daha az kriyohasara neden olduğu açıklanan çalışmada 3 gün saklama süresi sonunda çözme işlemi yapılmış ve uzayan saklama sürelerinin hücreler üzerindeki etkilerinin farklı olabileceği belirtilmiştir (Punyatanasakchai vd. 2008). Boğa spermleriyle yapılan bir çalışmada ise KP sonrası sperm hücrelerinin sağkalım ve hareketlilik oranlarında %50-70’e varan azalma tespit edilmiştir. CASA ile hareketlilik parametrelerinin değerlendirilmesi sonucunda çözme sonrasında spermlerin VCL, VAP ve ALH oranlarında anlamlı derecede azalma, STR‘de ise artışın olduğu kaydedilmiştir (Yoon vd. 2016). O’Connell ve arkadaşlarının, normozoospermik örneklerin azot buharında dondurulmasıyla gerçekleştirdikleri çalışmada çözme sonrası canlılık %31, TM %33, ileri motilite %41 oranında azalmıştır. Taze spermler ile KP sonrası spermlerinn motilite parametreleri karşılaştırıldığında ise VAP %31, VSL %29, VCL % 32, BCF %18 ve LIN %16 oranında azalmış ve aradaki bu fark istatistiksel olarak

anlamlı bulunmuştur (O'connell vd. 2002). Bizim çalışmamızda da KP sonrası canlılık ve motilite oranlarında benzer şekilde azalmanın olduğu tespit edilmiştir. Hareketlilik özellikleri detaylı olarak incelendiğinde düşüş oranlarının VSL %33,6, VCL %32,5, VAP %36, ALH %31,8, LIN %12,4, WOB %7,4, STR %5 olarak gerçekleştiği görülmüştür. İstatistiksel olarak değerlendirildiğinde STR ve LIN dışındaki parametrelerdeki düşüş anlamlı bulunmuştur.

KP sonrasında ortaya çıkan sperm parametrelerindeki bu bozulma, kısırlık tedavilerinde sıklıkla başvurulan sperm dondurma işlemlerinde başarısızlıklara neden olmaktadır.

Özellikle az sayıda sperm sayısına sahip, ya da testisten elde edilmesi nedeniyle hareket kabiliyeti baştan yetersiz olan spermatozoanın çözdürülmesi sonrasında hareketlilik gözlenmemesi ICSI işlemlerinde sperm seçimini zorlaştırmaktadır. Sperm hareketliliğini artıran maddelerin eklenmesi, hareketsiz ancak canlı spermlerin ayırd edilebilmesini sağlamaktadır. Ancak bu maddelerin kullanımıyla ilgili oldukça çelişkili ve eksik veriler mevcuttur.

KP işlemi sonrasında azalmış motiliteyi aktive etmek amacıyla kullanılan FDE-İ’ler hücre içindeki ikincil mesajcılardan cAMP ve cGMP’lerin yıkımını engellemek suretiyle hücre içi konsantrasyonlarının artmasına neden olmaktadırlar. Hücre içindeki cAMP düzeyindeki değişimlerin pek çok farklı sinyal yolağı üzerinden proteinlerin fosforilasyonunu etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle ikincil mesajcılardan cAMP ve cGMP miktarı, proteinlerin sperm hücresi üzerindeki lokalizasyonuna bağlı olarak özellikle kapasitasyon, AR ve kuyruk hareketi gibi fonksiyonların düzenlenmesinde oldukça önemlidir. Bizim çalışmamızda da PAP kullanılarak sperm hücrelerindeki FDE10’un inhibe edilmesi amaçlanmıştır. Bu yolla hücre içindeki cAMP ve cGMP’nin yıkımı engellenerek ortamdaki konsantrasyonlarının artışı neticesinde kuyruk hareketliliğinde de artış olması öngörülmektedir. Yakın zamanda FDE10’un insann sperm hücrelerinin sitoplazmasında ve seminal plazmadaki varlığının açıklanmasıyla birlikte motilite aktivatörleri seçiminde dikkati PAP üzerine çevirmiştir. FDE10 özellikle insan sperm sitoplazmasında aktif bir fonksiyon üstlenirken, FDE4 ve 11’in ise esas olarak seminal plazmada görev yaptığı saptanmıştır (Marechal vd. 2017).

FDE10’un PAP duyarlı olduğu bilindiğinden bu bileşenin klinik pratikte kullanımı

konusunda bilgi birikimine gereksinim ortaya çıkmış ve çalışmamızın hipotezini şekillendirmiştir.

Sperm hareketliliğinde artış sağlamak için invitro koşullarda PF (Aribarg vd. 1994, Nassar vd. 1999, Stanic vd. 2002, Nabi vd. 2017), Platelet Aktive Edici Faktör (PAF) (Roudebush 2007, Grassi vd. 2010, Kordan vd. 2010), Caffeine, Kallikrein (Barakat vd.

2015), Procaine, Trolox (Ortgies vd. 2012, Nekoonam vd. 2016), Thapsigargin (Ho ve Suarez 2001b), Theophylline (Ebner vd. 2014), Sildenafil citrate (Glenn vd. 2007) gibi pek çok aktivatör madde kullanılarak çalışmalar yapılmıştır. Sığır sperm hücreleri ile yapılan bir çalışmada KP sonrası motilite aktivatörü olarak kallikrein, kafein ve PF uygulanmış ve 30 dakikalık süre içinde en fazla hareketlilik artışının 5 mM kafein dozunda gerçekleştiği açıklanmıştır (Barakat vd. 2015). İnsan spermlerinde yapılan benzer bir çalışmada ise uygulanan 6 mM kafeinin hareketlilikle birlikte kapasitasyon oluşumunu da artırarak ALH düzeyinde artışa yol açtığı; PF uygulamasının ise ALH’de etki göstermeyip yanlızca ileri hareketlilik artışına neden olduğu belirlenmiştir. Kafein ve PF’nin glikolizi %40 oranında artırmak suretiyle kuyruk hareketliliğini hızlandırdığı açıklanmıştır (Rees vd. 1990). Çalışmamızda kullanılan PAP’ın 100 µM’lık derişiminin, 30 ve 60. dakikalarda azalan hücre hareketliliğini artırdığı, bunun yanında ALH parametresinde değişiklik yaratmadığı ve AR oluşumunu da arttırmadığı tespit edilmiştir. Bu değerlendirmeler ışığında özellikle klasik IVF ve IUI işlemlerinde PAP’ın, oluşması istenmeyen erken kapasitasyon ve hiperaktivasyonu tetiklemediği ve bu açıdan güvenilir bir bileşik olduğu düşünülmüştür.

Günümüzde infertilite tadavileri sırasında en yaygın olarak kullanılan motilite artırıcılar PF ve PAF’tır. Ancak bu maddelerin kullanım miktarı ve uygulanma süreleri konusunda tam olarak fikirbirliğine varılmamıştır. Bazı çalışmalarda PF’nin oksidatif stres kaynaklı toksisiteyi azaltıcı etki gösterdiği bildirilmekle birlikte (Zhang vd. 2005), artan dozlarının embriyotoksik etki yapabileceğine ya da spermlerde hem PF’nin, hem de PAF’ın DNA fragmantasyonuna yol açabileceğine dikkat çekilmektedir (Tournaye vd.

1993, Centola vd. 1995, Unsal vd. 2016).

Sperm hareketliliğini artırmada rutin kullanıma girmeye aday olan PAP’ın, CASA motilite parametreleri üzerindeki etkileriyle ilgili bulgu sunan her hangi bir yayına literatürde rastlanmamıştır. Ancak diğer FDE-İ’lerin kullanımı sonrası CASA parametreleri çeşitli çalışmalarda değerlendirilmiştir. Nabi ve arkadaşlarının KP sonrası astenozoospermik (hareket bozukluğu gösteren) spermlere 30 dakika süreyle 3.6 mmol/l PF uyguladıkları çalışmada ileri motilitede anlamlı derecede artış olduğu; DNA hasar oranı ve kromatin bütünlüğünde ise PF uygulamasının anlamlı bir değişime yol açmadığı bildirilmiştir (Nabi vd. 2017). Astenozoospermik ve normozoospermik örneklere PF uygulandığı bir diğer çalışmada ise TM, VAP, VSL ve BCF oranında anlamlı bir değişikliğin olmadığı, LIN’de her iki grupta da azalmanın olduğu kaydedilmiştir. PF’nin ileri motil sperm oranında değişime yol açmamasına karşılık, sperm motilite paternlerinden VCL, ALH’de istatistiksel olarak anlamlı artışa yol açtığı açıklanmıştır (Nassar vd. 1999).

Aribarg ve ark. yaptığı çalışmada ise KP sonrası sperm hücrelerine 30 dakika, 3 saat ve 24 saat süreyle PF uygulanmıştır. CASA analizi sonuçlarına göre 30 dakika ve 3 saat gruplarında TM, VCL, VSL, ALH ve VAP oranlarında anlamlı derecede artışın olduğu belirlenmiştir. 24 saat süreyle PF uygulanmış olan grupta ise motilitede diğer gruplara göre belirgin bir azalma olduğu açıklanmıştır (Aribarg vd. 1994). Benzer çalışmalardan elde edilen sonuçlarda PF uygulamasının ileri motilite oranlarında anlamlı derecede artış olduğu kaydedilmekle birlikte, uygulanan doz ve uygulama süresine bağlı olarak hücreler üzerindeki etkinliğinin değişkenliği dikkat çekmektedir (Paul vd. 1996, Stanic vd. 2002, Nabi vd. 2017). Çalışmamızda KP sonrası 100 µM PAP ilave edilmiş grupta 30.dakikada ileri motilite %34,2 ve TM %24,8 artış gösterirken 60.dakikada bu oran

%24,9 ve %23,8 olarak gerçekleşmiştir. Ancak PAP uygulamasının PF’de olduğu gibi VCL, VSL, VAP gibi hareketlilik parametrelerinde kontrol grubuna göre anlamlı değişime yol açmamasının, kullanılan dozlar ve PAP ile PF’nin etkinlik mekanizmasındaki farklılıklar sebebiyle olabileceğini düşündürmektedir. T grubuyla karşılaştırıldığında, LIN değeri K30 için (p=0,16) ve K60 için (p=0,70) değişim göstermemektedir. Ancak PAP uygulaması sonrası T grubuyla kıyaslandığında P30 ve P60 gruplarında LIN (VSL/VCL) değerindeki anlamlı azalma, PAP’ın spermlerin hareket gücünü artırmasına bağlı olarak dolaylı yoldan LIN’de azalmaya yol açmış

olabileceğini düşündürmektedir. Çünkü tek başına anlamlı değişiklik göstermeyen VSL ve VCL değerlerinin oranları alındığında ortaya çıkan LIN değerindeki anlamlı düşüş;

spermlerin iki nokta arasında ilerlerken düz bir yol izlemek yerine, aynı noktaya giderken daha eğrisel çizgide yol aldığını göstermektedir. T, K ve P grupları karşılaştırıldığında; KP ve PAP uygulamalarının her ikisinin de spermatozoonun hareketinin ortalama yörünge doğrusallığını belirten STR’de anlamlı bir değişime yol açmadığını göstermektedir. Larsen ve arkadaşlarının yayınladığı bir çalışmada, semen analizlerinde VCL, VAP, STR ve BCF oranları yüksek olan spermlerin fertilizasyon başarısının daha fazla olduğu bildirilmiştir (Larsen vd. 2000). Ancak çalışmamızda elde ettiğimiz bulgularla bu verilerin ilişkisini değerlendirmek ve hareket parametrelerindeki değişikliğin klinik açıdan ne anlama geldiğini ortaya koyabilmek amacıyla ileri deneysel ve klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.

KP işlemi membranlarda fosfolipid yapının yanısıra karbonhidrat içeriğinde de değişime neden olmaktadır. Olgun spermatozoon membranı, epididimden geçerken glikolize edilmiş lipid ve proteinden oluşan bir tabaka olan glikokaliksle kaplanır.

Yaklaşık olarak 300 farklı glikoprotein ve glikolipidden meydana gelen glikokaliks, seprmatozoonun dış çevreyle etkileşimde olan yüzeyidir. Spermiyogenez, kapasitasyon, AR gibi fizyolojik olaylarda bu tabaka yeniden düzenlenmektedir. Glikokaliksin spermatozoonun korunması, oositi tanıma ve kaynaşması süreçlerinde etkin işlevleri olması nedeniyle glikokaliksin bütünlüğü başarılı fertilizasyonun gerçekleşmesi için oldukça önem taşır (Cross ve Overstreet 1987, Schroter vd. 1999, Purohit vd. 2008).

Xin ve arkadaşları, KP sonrası sperm hücresi membranının glikoprotein monomerlerinden biri olan N-Asetilnöraminik Asit (Sialik Asit) içeriğinde belirgin azalma olduğunu bildirmiştir (Xin vd. 2018). Sitolojik, morfolojik ve ultrastrüktürel çalışmalarda özellikle hızlı dondurma tekniği kullanıldığında plazma membranıyla birlikte, başın hemen altında yeralan akrozom membranında da oluşan hasarın akrozomal matriksin kaybına da yol açabileceğini bildiren çalışmalar mevcuttur (Barthelemy vd. 1990, Mclaughlin vd. 1993).

Özkavukçu ve arkadaşlarının 2008’de yaptığı çalışmada, dondurma ve çözme işlemi sonrasında elektron mikroskobi incelemelerinde sperm hücrelerinin apikal bölgesinde değişim ve subakrozomal bölgede de şişme olduğu gözlenmiştir. Aynı zamanda hareketlilik ve canlılık oranlarının azalmasıyla birlikte morfolojik hasarın da arttığı saptanmıştır (Ozkavukcu vd. 2008).

Bathelemy’nin yavaş dondurma tekniğiyle dondurulmuş sperm hücrelerinde akrozomdaki değişimleri incelediği taramalı elektron mikroskobi çalışmasında, seminal plazmayla birlikte dondurulan hücrelerin Akrozom bütünlüğünde (AB) %21 kayıp olmasına karşın, seminal plazması ayrıştırılarak dondurulan hücrelerde bu kaybın %32.5 olduğu belirlenmiştir (Barthelemy vd. 1990). Bizim çalışmamızda seminal plazma uzaklaştırıldıktan sonra KP prosedürü uygulanmıştır ancak AB’de ortaya çıkan kayıp Barthelemy ve arkadaşlarının tespit ettiği düzeyde gerçekleşmemiştir. KP sonrası akrozomal enzimlerden akrozin/proakrozin düzeyinde %50’nin üzerinde azalma tespit edilen bir diğer çalışmada ise kriyohasarın sperm AB üzerinde olumsuz etkileri olduğu bildirilmiştir (Mack ve Zaneveld 1987). Cross ve Hanks ise KP sonrası sperm hücrelerinin AB’de %27, akrozin düzeyinde ise %24 azalmanın olduğunu, ancak motil spermatozoanın İntak Akrozom (İA) oranının %96 olarak belirlendiğini açıklamış ve akrozomal kaybın büyük oranda hücre canlılığın kaybedilmesiyle birlikte geliştiğini açıklamışlardır (Cross ve Hanks 1991).

Suni tohumlama alanında ise Panda spermleriyle yapılan bir çalışmada KP öncesi İA oranı 93±1,7% ; KP sonrası İA ise 81,7±4,7% olarak (p˃0,05) belirlenmiş ve KP işleminin AB’de anlamlı bir değişikliğe yol açmadığı açıklanmıştır (Spindler vd. 2004).

Çalışmalarda kullanılan KP prosedürlerinin KPM’lerin farklı olması ve akrozom inceleme tekniklerindeki farklılıklar nedeniyle elde edilen veriler değişkenlik göstermektedir. Rahiminia ve arkadaşlarının insan spermlerinde 3 farklı dondurma protokolü uyguladığı çalışmada AB’de çözme sonrası anlamlı derecede azalma olduğu açıklanmıştır. İkili boyama tekniği uygulanan taze spermlerdeki AB %88,9 olarak belirlenirken, hızlı dondurma tekniği, katı yüzey dondurma ve azot buharında dondurma teknikleriyle yapılan KP sonrasında ise sırasıyla %81,3; %81,6 ve %82,4 olduğu

saptanmıştır. Çalışmada kullanılan KP yöntemleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamakla birlikte AB’nin en fazla korunduğu yöntemin azot buharında dondurma olduğu görülmektedir (Rahiminia vd. 2017). Bizim çalışmamızda da azot buharıyla dondurma yöntemi uygulanmış olup Rahminia ve arkadaşlarının açıklamalarına benzer sonuçlar elde edilmiştir. Çalışmamızda taze spermlerde %86,20

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ (sayfa 72-0)