Sperm Fonksiyonu

Sperm hücrelerinin fertilizasyon başarısında canlılık, hareketlilik ve morfolojik özelliklerinin yanısıra membran yapısı, akrozom reaksiyonu, oosit penetrasyonu ve çekirdek kondansasyonu gibi bazı fonksiyonel özelliklerinin de önemli etkisi bulunmaktadır. Sperm fonksiyonunu belirlemek için yapılan testler: Akrozom bütünlüğü testi, Akrozin tayini, Hipoozmolar şişme testi (HOS), Antisperm antikorları, Postkoital test, Hamster zona bağlanma testi, Hyaluronik asit bağlanma testi, Hemizona bağlanma testi, Servikal mukus bağlanma testi olarak sıralanabilir (Agarwal vd. 2008).

26 2.3.1.5 Sperm DNA hasarı

Fertil veya infertil erkeklerin ejakulat spermlerinde DNA hasarı görülmekle birlikte, hasarlı DNA’ya sahip spermlerin fertilizasyon oranlarında azalmaya ve erken dönem gebelik kayıplarına neden olduğu bilinmektedir (Sun vd. 1997, Lopes vd. 1998, Evenson vd. 1999). Sperm hücrelerinde ortaya çıkan DNA hasarı oluşumunun başlıca nedenleri; Spermatogenez sırasında kromatin paketlenmesi sırasındaki hatalar ve yanlış bağlanmalar, ejekülatta yüksek miktarlarda ROT varlığı, çevresel toksinlere maruziyet, sigara ve alkol kullanımı gibi ROT oluşumunu artırıcı yaşam şekli ve apoptozdur (Saleh ve Agarwal 2002, Moustafa 2004, Aitken ve Koppers 2011). Günümüzde DNA’daki hasar oranını saptamak için kullanılan farklı yöntemler bulunmaktadır;

1- DNA hasarını belirlemek için TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), Sperm kromatin yapı analizi (Sperm Chromatin Structure Assay-SCSA), Halo Sperm yöntemi (Sperm Chromatin Dispersion-SCD), Akridin Orange Testi (AOT), Tek Hücre Elektroforez (COMET) yöntemi, 8- hidroksi 2-deoksiguanozin (8-OHdG) ölçümü,

2- Sperm kromatini paketlenmesinde ortaya çıkan anormallikleri belirlemek için Kromomisin A3 (CMA3) boyama, Anilin Blue (AB) boyama, Toluidin Blue (TB) boyama yöntemleri

3- Kromozom anomalilerini tespit etmek için ise Floresan In-Situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi kullanılmaktadır.

Bu yöntemlerin uygulanması sırasında çeşitli denatürasyon, fiksasyon ve boyama prosedürleri uygulanarak ejakülattaki DNA hasarlı spermatozoa oranı belirlenmektedir (Zhang vd. 2010, Carrell ve Aston 2013, Cankut vd. 2019). Günümüzde DNA hasarını (anormal kromatin paketlenmesi, DNA fragmantasyonu ve protamin eksiklikleri) tespit etmek için kullanılan yöntemlerin referans arlıkları ve güvenilirlik düzeyleri hakkında tam olarak fikir birliğine varılamamıştır. Ancak sperm DNA bütünlüğü incelemelerinde en fazla tercih edilen yöntemler TUNEL, SCSA ve SCD olarak dikkat çekmektedir (Majzoub vd. 2017).

27 2.4 Kriyoprezervasyon

Kriyoprezervasyon işlemi, gelecekte kullanılması planlanan çeşitli hücrelerin ve dokuların biyolojik aktivitelerinin yavaşlatılması suretiyle 0°C’nin altındaki ısılara kadar soğutularak saklanmasıdır. Organ, doku, hücre ve organizmaların dondurulmasını inceleyen bilim dalı olarak kriyobiyoloji, farklı dondurma ve çözme prosedürleri, kriyoprotektan etkinliği ve hücrelerde meydana gelen fizyolojik-fonksiyonel özelliklerin belirlenmesi bakımından günümüzde de gelişimini sürdürmektedir.

Kriyobiyolojide kullanılan dondurma ve çözme prosedürleri hücreden hücreye değişim göstermekle birlikte hücrelerin sağ kalımı için en önemli etken buz kristali oluşumudur.

Dondurma işlemi yapılırken kullanılan KPM’ler, hücre içi su miktarını en aza indirgeyerek intraselüler buz oluşumunun engellenmesinde etkilidirler. KP sırasında ısının azalmasıyla birlikte su moleküllerinin sayısının azalması ve oluşan hipertonik ortamda hücrelerin dehidratasyonu gerçekleşir. Bu aşamada dehidratasyon hızı da hücre canlılığını etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Soğutma hızının çok hızlı olması, ani hücre içi buz oluşumuna yol açmaktadır. Soğutmanın yavaş gerçekleştirilmesi durumunda ise hücrelerin uzun süre yüksek ozmolariteye maruz kalması nedeniyle membran lipoproteinlerinin denatürasyonu söz konusu olmaktadır. Bu nedenle canlılığının devamlılığı bakımından hücrelerin soğutulma hızı KP sırasında göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktörlerdendir (Lovelock 1957).

Sperm KP işlemi ilk olarak 1949‘da Polge ve arkadaşları tarafından gliserol kullanılarak gerçekleştirilmiş, 1953’te ise dondurulmuş-çözülmüş spermlerden elde edilen ilk fertilizasyon Bunge ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir (Polge vd. 1949, Bunge ve Sherman 1953).

Günümüzde sperm hücrelerinin dondurulması, yardımla üreme tekniklerinin (YÜT) kullanıldığı alanlarda sıklıkla uygulanmaktadır. Fertilite potansiyelinin azalmasına veya tamamen ortadan kalkmasına yol açacak işlemlerden önce sperm hücrelerinin dondurularak saklanması oldukça önem taşımaktadır. Fertilitenin korunması amacıyla sperm hücrelerinin dondurulmasını gerektirecek durumlar aşağıda belirtilmiştir;

28

1- Kemoterapi, radyoterapi gibi çeşitli kanser tedavilerinin spermatogenezi kalıcı olarak yada birkaç yıl süreyle bozabildiği bilinmektedir. Özellikle testis kanseri, lenfoma, lösemi, santral sinir sistemi tümörleri gibi hastalıkların tedavisi öncesinde fertilitenin korunması gereken hallerde,

2- Spermatogenez üzerinde istenmeyen etkiler gösterecek özellikteki ilaçların (örneğin Nitrofurantoin, Sulfasalazin, Simetidin v.b ) kullanılması gerekliyse,

3- Ejakülasyonun doğal şekilde gerçekleştirilemediği durumlarda (Spinal kord hasarı veya seksüel disfonksiyon v.b.) ,

4- Testis cerrahisi gerektiren tedavilerden (variselektomi, total veya parsiyel orişektomi) önce,

5- İnfertilite tedavileri sırasında elde edilmiş olan testiküler spermlerin (TESE, TESA, MESA) sonraki tedavilerde de kullanılabilmesi amacıyla,

6- Sağlıklı ve fertil erkeklerden alınan örneklerden ÜYTE sürecinde kullanılmak üzere, 7- Sperm bağışı (donasyon) yapılacağı durumlarda,

8- Veterinerlik, hayvan yetiştiriciliği ve suni tohumlama uygulamalarında

sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu gerçekleştirilmektedir (Gupta vd. 2011, Hamada vd. 2014).

Ülkemizde sadece aşağıda belirtilen durumlarda erkek gonad ve üreme hücrelerinin dondurulmasına yasal olarak izin verilmiştir;

1- Çeşitli kanser tedavileri sırasında kemoterapi ve radyoterapi öncesinde,

2- Ejakülatta sperm hücresi bulunmayıp testislerden aspirasyon veya cerrahi yöntemlerle sperm hücresi elde edilmesi durumunda,

3- Testis cerrahisi gibi üreme fonksiyonunu etkileyecek ameliyatlar öncesinde.

Günümüzde testis dokusundan cerrahi yönemle veya ejakülasyonla elde edilen sperm hücrelerinin dondurulmasında pek çok farklı özellikte kriyoprotektan madde ve farklı dondurma çözme prosedürlerinin kullanılması sözkonusudur.

29 2.4.1 Kriyoprotektan maddeler

KP işlemi yapılırken hücrelerin sağkalım oranını artırmak amacıyla kullanılan KPM’ler genellikle yüksek Hidrojen bağlama yeteneği gösterirler. İçinde bulundukları çözeltinin kristalleşme eğilimini azaltarak donma sıcaklığını düşüren bu maddeler; hücre içine nüfuz eden (permeabl) ve hücre içine nüfuz etmeyen (non-permeabl) KPM’ler olarak 2 grupta sınıflandırılırlar:

2.4.1.1 Hücre içine nüfuz eden KPM’ler

Bu gruptaki KPM’ler sudan yavaş da olsa hücre zarından içeriye geçerek proteinleri stabilize ederken, hücre içinde buz oluşum sıcaklığını –40°C’ye kadar düşürmeleri nedeniyle ozmotik değişimlerden kaynaklanan hücre hasarını en aza indirmektedirler.

Hücre içine nüfuz eden KPM’ler düşük molekül ağırlıklı maddeler olup suda çözünebilir özelliktedirler. Embriyo, gonad ve gametlerin dondurulmasında farklı dondurma protokollerinde yaygın olarak kullanılan Gliserol, Etilen Glikol, Propanediyol, Propilen Glikol (PROH) gibi glikol benzeri polioller ve Dimetil Sülfoksit (DMSO) hücre içine girerek suyun yerini almaktadır (Palasz ve Mapletoft 1996, Elder ve Dale 2011). Ancak bu gruptaki KPM’lerin yüksek konsantrasyonlarının hücrede toksik etki gösterip fertilite potansiyelinde azalmaya yol açabilecekleri bildirilmiştir (Best 2015).

2.4.1.2 Hücre içine nüfuz etmeyen KPM’ler

Bu gruptaki KPM’lerden en çok kullanılanlar Glukoz, Sükroz, Rafinoz gibi şeker bileşikleridir. Hücrenin lipit tabakasını stabilize etmek suretiyle viskoziteyi artırır, hücre dışındaki sıvının da donma sıcaklığını düşürürler. Hücre dışında kaldıkları için hızlı bir ozmotik dehitrasyona neden olurlar ve hücre içindeki buz oluşumunu azaltıcı etki gösterirler. Amfipatik bileşiklerden Glisin, Prolin, Trehaloz ise membran lipitleri ve proteinleriyle etkileşime girerek faz geçişlerini kolaylaştırmaktadır. KP işlemi için kullanılan kriyoprotektan kültür ortamı (medium), genellikle hücre içine nüfuz eden bir

30

KPM’nin yanı sıra bir yada daha fazla hücre içine nüfuz etmeyen KPM’nin bileşiminden oluşmaktadır. Fosfolipid yapıdaki yumurta sarısı, lipoproteinler, kolesterol, albümin ve çeşitli antioksidanlar gibi maddeler de kriyohasara karşı hücre membranlarını koruyucu etkileri nedeniyle dondurma ortamları içine ilave edilmektedir (Avery vd. 1998, Shaw ve Jones 2003, Elder ve Dale 2011).

2.4.2 Sperm kriyoprezervasyonu

2.4.2.1 Kontrollü yavaş dondurma

Yavaş dondurma işlemi, sperm hücrelerinin manuel veya otomatik olarak, 2-4 saatlik süreler içinde sıcaklığın kademeli olarak düşürülmesi suretiyle aşamalı olarak dondurulmasıdır. KP sırasında sperm hücre zarlarında ortaya çıkan değişimlerin zamana yayılması, hücreler üzerindeki ozmotik stresi azaltmaktadır. Sperm hücreleri KPM içeren bir solüsyonda dengelendikten sonra, sıcaklık dakikada 0,3-0,5°C azaltılacak şekilde -40°C’ye kadar soğutulur. Burada -6,5 ile -7°C’lerde kontrollü buz kristalizasyonu (seeding) başlatılır. Hücreler 150°C’ye kadar soğutulduktan sonra -196°C’de sıvı azot saklama tanklarında depolanır.

2.4.2.2 Vitrifikasyon

Vitrifikasyon yönteminde çok hızlı bir şekilde sıvı fazdan katı faza geçiş yapılması amaçlanmaktadır. Sperm hücrelerinde kristalleşme ve buz oluşumunun önüne geçmek için özel taşıyıcılara yüklenmesinin hemen ardından sıvı azot içine alınmaktadır. KP işlemi sırasında KPM kullanılmadan da hızlı dondurma tekniği kullanılarak başarılı sonuçlar alındığı bildirilmiştir (Isachenko vd. 2004b).

2.4.2.3 Azot buharında dondurma

Sperm süspansiyonu soğuk KPM içeren medium ile eşit hacimde yavaşça karıştırılır ve 4°C’de 10 dakika dengelenmeye bırakılır. Dengelenme sonrası sıvı azot buharının

31

(yaklaşık -80°C) 15-20 cm üstünde 15 dakika bekletilen sperm hücreleri sıvı azota daldırılarak muhafaza edilir (Di Santo 2012, Justice ve Christensen 2013).

2.4.3 Çözdürme prosedürü

Dondurma işlemi kadar önemli bir diğer aşama, hücrelerin ısı ve ozmotik şoka uğramadan biyolojik aktivitelerinin geri kazandırılmasıdır. Hücre hasarına yol açmamak için 37°C sıcaklıkta gerçekleştirilen bu prosedürde buz kristallerinin çözünmesi esnasında sperm hücrelerinin organelleri hasara uğrayabilmektedir. Azot tankından dışarı çıkarılan sperm numuneleri 15 dakika oda sıcaklığında ya da 37°C’lik su banyosunda 10 dakika bekletilmek suretiyle çözülmesi sağlanır. Çözme sonrası sperm hücrelerinden KPM’lerin uzaklaştırılması gerekmektedir (Di Santo 2012).

2.5 Kriyohasar

KP işlemi belirgin olarak sperm hücrelerinin membran bütünlüğü, kromatin kondansasyonu, motilitesi ve morfolojik yapısında olumsuz değişimlere yol açmaktadır.

Fertil ve infertil kişilerin sperm örnekleri karşılaştırıldığında, KP sonrası infertil erkeklerin sperm kromatin kondansasyonunda daha yüksek oranda bozulma olduğu saptanmıştır (Hammadeh vd. 1999).

32

Şekil 2.7 Sperm hücrelerinde kriyohasar oluşumu (Yeste 2016)

2.5.1 Membran hasarı

Sperm hücrelerinin plazma, mitokondri ve akrozom membranları kriyohasara karşı oldukça hassastır. Sperm membranlarının stabilitesi, sıcaklık değişiklikleri, suyun diffüzyonuyla ortaya çıkan hacimsel değişimler, KPM’ler ve artan tuz konsantrasyonundan kaynaklanan ozmotik farklılıklara bağlı olarak değişmektedir.

Hücre zarı, doymamış yağ asitleri bakımından (% 65-70) zengin olması nedeniyle akışkan bir yapıdadır. Ancak özellikle çözme işlemi sırasında membran lipidleri arasındaki faz geçişleri ve membran permeabilitesinin artması, spermlerde erken (spontan) AR gelişiminin yanı sıra hücre ölümüne de neden olabilmektedir (Medeiros vd. 2002). Sperm hücrelerinin membranındaki çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA, Poly Unsatured Fatty Acids), lipit peroksidasyonu ve ortaya çıkan Reaktif Oksijen Türleri (ROT) nedeniyle hasara uğramaktadır (Koppers vd. 2011). KP sonrası iyon transport ve metabolizmasında iş yapan CATSPER2 (Cations channels of sperm) ve

33

TEKT2 (Tektin) gibi bazı membran proteinlerinin fonksiyonunda kayıplar olduğu gözlenmiştir (Chen vd. 2017, Alshawa vd. 2019). Dondurma-çözme işleminin spermlerin Efrin R-Aktin, Guanilat Siklaz ve ROT metabolizmasında işlev gören bazı proteinlerin ekspresyonunda değişikliğe yol açmak suretiyle, hücrenin sinyal yolaklarının işleyişinde aksaklığa neden olduğu bildirilmiştir (Yoon vd. 2016).

2.5.2 Mitokondriyal hasar

Mitokondriler çift zar yapısına sahip organeller olarak, KP’nın membran yapıları üzerindeki olumsuz etkilerine karşı oldukça duyarlıdırlar. Dış membran büyük moleküllerin geçişine izin verirken, geniş yüzeye sahip iç membran oksidatif fosforilasyonun gerçekleştiği kısımdır. Oksidatif fosforilasyon sırasında protonların içeriden dışarıya pompalanması, iki zar arasında Mitokondriyal Membran Potansiyeli (ΔΨm) olarak adlandırılan elektrokimyasal bir gradyan oluşmasına neden olur. Bu anlamda ΔΨm, mitokondrilerin enerji potansiyelinin bir göstergesidir. Mitokondrilerde oksidatif fosforilasyon ve glikolizis yoluyla kazanılan ATP, mikrotübüllere iletilerek sperm kuyruk hareketi için gerekli enerjiyi sağlamaktadır. Sperm hücreleriyle yapılan çalışmalar, ΔΨm’de ortaya çıkan düşüşün hücrelerinin metabolik fonksiyonlarıyla birlikte motilite karakteristiğinde de kayıplara yol açtığını göstermektedir (Wang vd.

2003a, Amaral vd. 2013). Bunun yanı sıra sperm hücrelerinin fertilizasyon yeteneğinde etkin bir role sahip olan AR oluşumunda da azalmanın olduğunu bildiren çalışmalar vardır (Gallon vd. 2006, Agnihotri vd. 2016)

Mitokondrilerdeki Elektron Taşıma Zinciri (ETZ), ATP sentezinin yanı sıra ROT üretimini de teşvik eder. Ancak ETZ proteinleri oksidatif-nitrozatif değişimlere karşı duyarlıdır. ETZ’deki hasara bağlı olarak hücredeki ATP üretimi azalırken, ATP benzeri inhibitörler de ATP’nin bağlandığı bölgelere bağlanır ve AKT (Protein Kinaz B) fosforilasyonunu inhibe eder. AKT fosforilasyonundaki azalmanın etkisiyle PI3K (Fosfoinositid-3Kinaz)/AKT sinyal yolağının baskılanması apoptotik kaskadın ortaya çıkmasına neden olabilmektedir (Koppers et al., 2011).

34

Mitokondri iç ve dış membranları arasındaki boşlukta Kardiyolipinle bağlı olarak bulunan sitokrom c, ROT etkisiyle kardiyolipinin oksidasyonu sonucunda kardiyolipinden ayrılarak sitoplazmaya salınır. Sitokrom c çıkışının Kaspaz 3’ün aktivasyonuna neden olarak mitokondri aracılı apoptotik kaskadın oluşumunu tetiklediği düşünülmektedir (Luo vd. 1998, Boehning vd. 2005).

2.5.3 ROT oluşumuna bağlı hasarlar

Hücrede az miktarda üretilen ROT’un sinyal yolaklarının işlevselliğinde etkili olduğu bilinmekle birlikte, kontrolsüz olarak artan miktarları oksidatif hasara neden olmaktadır.

Sperm hücrelerinde ROT artışıyla ortaya çıkan hasarın nedeni membran yapılardaki çoklu doymamış yağ asitlerinin metilen gruplarına oksidatif atak sonucu gelişen lipit peroksidasyonudur (LPO) (Aitken 1989). Hücrenin oksijen metabolizması sonucunda da ortaya çıkan serbest radikaller, dış yörüngelerinde eşlenmemiş elektron (e⁻) bulunduran kararsız yapıdaki atom veya moleküllerdir. Mitokondriyal membranlardaki ETZ reaksiyonları sırasında ortaya çıkan sızıntılar Süperoksit (O2), Hidrojen Peroksit (H2O2) ve Hidroksil Radikalidir (OH). Süperoksit radikali (O2.-) Oksijenin 1e⁻ alarak indirgenmesiyle oluşmaktadır. 2 tane e⁻ alarak indirgenen O2, H2O2’in oluşmasına neden olurken, üçüncü e⁻‘un eklenmesiyle yüksek derecede reaktiviteye sahip OH radikali meydana gelmektedir. Somatik hücrelerde karmaşık antioksidan savunma sistemleri sayesinde anormal ROT artışının önüne geçilir. Antioksidan savunma sisteminin yetersiz kalması ve süperoksit radikalinin ortamda fazla miktarda bulunması, ROT oluşmasıyla sonuçlanır. Bu sistemin elemanlarından Süperoksit Dismutaz (SOD), O2’yi redükte ederken; Katalaz (CAT), Glutatyon Peroksidaz (GPX) ve Peroksiredoksinler (PRDXs) de H2O2’yi redükte etmektedir. Hücre içi antioksidan savunmada SOD, CAT, GPX ve Ferritin; hücre dışı antioksidan savunmada Transferrin, Laktoferrin, Seruloplazmin, hemopeksin, haptoglobin ve albümin etkinlik göstermektedir. Ancak yüksek miktarlarda oluşan ROT, hücrede antioksidan enzim aktivitesinde de bozulmaya neden olmaktadır (Gadea vd. 2011, O'flaherty 2014).

35 2.5.4 Apoptoz

Programlı bir hücre ölüm mekanizması olan apoptoz, bir dizi biyokimyasal olayın tetiklemesiyle gelişen, hücrede kromatin yoğunlaşması, membran düzensizlikleri, mitokondriyal hasarlanma, çekirdek hasarı gibi olumsuz değişimlerin ortaya çıkmasına yol açan bir süreçtir (Kerr vd. 1972). Hasarlı hücrelerin eliminasyonunu sağlamasının dışında hücreler iyonize radyasyon, Ultra Viyole (UV) radyasyon, oksidatif stres, genotoksik maddelere maruziyet gibi etkiler sonucunda da apoptoza uğramaktadır.

Apoptozun gerçekleşmesi için ATP’ye ihtiyaç duyulması nedeniyle bu süreçte mitokondrilerin işlevini tam olarak yerine getirebilmesi önemlidir.

Hücrede apoptozun genel olarak hücre dışı (ekstrinsik) yol ve hücre içi (intrinsik) yol olmak üzere 2 yolla gerçekleştiği düşünülmektedir.

2.5.4.1 Hücre dışı yol

Hücre yüzeyinde yer alan Fas, TNFR1, TRAILR1/TRAILR2 reseptörlerine apoptoz uyarıcı FasL, TNFα, TRAIL ligandlarının bağlanmasıyla, reseptörde meydana gelen konformasyonel değişimler hücre dışı apoptoz yolağının etkinleşmesinde ilk basamaktır. Prokaspazların bu yapılara bağlanarak DISC (Death Inducing Signaling Complex) oluşumunu tamamlamasının ardından inaktif kaspaz 8 aktifleşir. Aktif kaspaz 8 başlatıcı kaspaz olması nedeniyle Kaspaz 3, 7 ve 9‘u aktifleştirir (Spierings vd. 2004, Schleich vd. 2013). Aktif kaspazların, DNA tamir mekanizmasında etkili olan enzimleri inaktifleştirmek suretiyle DNA fragmantasyonu oluşumunda etkin rol oynadığı bilinmektedir.Ancak apoptotik DNA fragmantasyonu oluşumu kaspazlardan bağımsız olarak da gerçekleşebilir (Tesarik 2004, Kitazumi ve Tsukahara 2011).

2.5.4.2 Hücre içi yol

Hücre içi apoptotik yolağın aktivasyonu; pH değişimleri, ROT oluşumu, radyasyon, viral enfeksiyonlar ve hücre içi Ca²⁺ miktarında artış gibi pek çok farklı etken

36

aracılığıyla gerçekleşebilmektedir. Apoptotik sinyalin oluşumunda Bcl-2 ailesinin üyeleri aktif rol oynar. Proapoptotik özellikteki Bcl-2 ailesi üyeleri Bad, Bax, Bid, Bcl Xs, Bak, Bim, Puma ve Noxa , Sitokrom c ve AİF’in (Apoptoz İndükleyici Faktör) salınmasında etkilidirler. Antiapoptotik 2 ailesi üyelerinden 2, XL ve Bcl-w ise mitokondri ve çekirdek zarında yer alırlar ve por oluşumunda görevlidirler. Bu proteinler por genişliğini düzenleyerek iyon ve Ca²⁺ geçişini kontrol ederken sitokrom c ve AİF salınımını bloke ederler. Apoptotik sinyalin oluşmasıyla birlikte bir proapoptotik protein olan Bid, apoptotik proteinlerden Bax ve Bak’ı aktifleştirir. Aynı zamanda Bid, antiapoptotik Bcl-2’yi de inaktifleştirmek suretiyle apoptotik uyarımın oluşmasında etkinlik gösterir. Apoptotik uyarımın oluşmasıyla mitokondriyal porlar açılır ve sitokrom c, sitozole geçer. Burada sitokrom c, APAF (Apoptoz Aktive Edici Faktör) molekülüne bağlanarak apoptozom oluşturur ve önce Kaspaz 9’un, sonra da Kaspaz 3’ün aktive olmasına neden olur. Mitokondri aracılı yolak her zaman kaspaz bağımlı gerçekleşmez. Sitokrom c ile birlikte AİF ve endonükleaz G proteinlerinin sitozole geçtiği durumlarda kaspazlardan bağımsız olarak kromatin yoğunlaşması ve DNA fragmantasyonu gibi apoptoz belirtilerinin de ortaya çıktığı bildirilmiştir (Hengartner 2000, Palmer vd. 2000, Martin vd. 2007).

Yüksek miktarda ROT artışı ve antioksidan aktivitenin yetersiz olduğu durumlarda da, Bcl-2’nin dış mitokondriyal membranda Bax ve Bad geçişini artırmak suretiyle sitokrom c salınımına neden olarak apoptoz oluşumunu tetiklediği saptanmıştır (Mcclintock vd. 2002, Wang vd. 2003b).

Apoptoz sırasında hücre membranlarındaki büzülmeye bağlı olarak tomurcuklanma benzeri yapıların oluşması ve membran asimetrisinin bozulmasıyla birlikte iç yüzeyde yer alan Fosfatidil Serin (FS) dış yüzeye çıkmaktadır. FST’nin gerçekleşmesi erken dönem apoptozun oluşumunun fizyolojik belirteçlerindendir (Shen vd. 2002, Taylor vd.

2004).

37 2.5.4.3 Spermde apoptoz oluşumu

Şekil 2.8 Sperm hücrelerinde apoptoz oluşumu: A- ROT ve apoptotik yolağın aktivasyonu, B- serbest radikallerin oluşumu. (Aitken vd. 2012)

Enfeksiyon kaynaklı yoğun lökosit maruziyeti, oksidatif hasar veya spermatogenez sırasındaki anormal kromatin paketlenmesi gibi etkilerle DNA’sında hasar oluşan sperm hücreleri apoptoza uğramaktadır. Germ hücre hattındaki apoptozun devamlılığı ve başarısı, hasarlı hücrelerin fertilizasyon sürecine katılmasını engellemesi bakımından önemlidir. Ancak hasarlı DNA‘ya sahip spermlerin bir kısmı apoptoza uğramadan epididime ulaşabilmektedir. Bunların bir kısmı inseminasyon sonrasında dişi genital kanallarından geçerken serviks ve uterin kavitede geniş çaplı bir lökosit infiltrasyonununa uğramakta ve hasarlı, apoptotik ya da ölü sperm hücreleri fagosite edilmektedir. Fagosite edilecek olan apoptotik hücreler dış membrana çıkmış olan FS

38

sayesinde lökositler tarafından tanınmaktadırlar (Kurosaka vd. 2003, Aitken vd. 2009, Aitken ve Koppers 2011).

2.5.5 DNA hasarı oluşumu

KP sonrası ROT artışı ve membran hasarı etkisiyle sperm hücrelerinin mitokondrilerinde ortaya çıkan H2O2, kaspaz aktivasyonu ve FST’ye neden olarak apoptotik kaskadın oluşumuna yol açar (Lozano vd. 2009). Aynı zamanda mitokondrilerden salınan AIF, Kaspaz aktive edici DNase (CAD) ve endonükleaz G gibi bazı endonükleazların aktivasyonuyla çekirdeğe ulaşması da DNA hasarına neden olmaktadır. Ancak spermlerde somatik hücrelerden farklı olarak mitokondri ve çekirdeğin hücrenin farklı lokasyonlarında yer alması nedeniyle endonükleaz aktivasyonunun hemen ardından hızlı bir şekilde DNA fragmantasyonu gelişmeyebilir.

Apoptoz belirtileri oluşan spermlerde çeşitli fonksiyonel kayıplara bağlı olarak belirgin şekilde motilite kaybı oluşabilir. Bununla birlikte apoptotik bir sperm hücresinin hasarlı DNA‘ya sahip olması durumunda da oositi fertilize etmesi mümkündür (Sun vd. 1997, Aitken vd. 1998). FST, miyokondriyal membran potansiyeli düşüklüğü ve aktif kaspaz oluşumu gibi çok sayıda apoptotik belirteç varlığının gözlendiği sperm hücrelerinin oosit penetrasyonu yeteneğinde belirgin bir azalmanın olduğu saptanmıştır (Grunewald vd. 2008).

39 2.6 Fosfodiesterazlar ve İnhibitörleri

Şekil 2.9 Döngüsel nükleotid yapısı ve FDE bağlanma bölgesi (Bender ve Beavo 2006)

2.6.1 FDE etki mekanizmaları ve sınıflandırılmaları

FDE’ler, hücre içinde ikincil mesajcılar olarak adlandırılan döngüsel ikincil mesajcılardan cAMP ve cGMP’nin 3’-fosfat köprülerinin hidrolizine yol açan fosfohidrolaz enzimlerdir. Bu bakımdan cAMP ve cGMP sinyallerinin hücredeki devamlılığını veya sonlandırılmasını düzenlerler. Ancak FDE aktivitesinin inhibisyonuna neden olan bazı maddeler cAMP ve cGMP’nin yıkımını engellemek suretiyle hücredeki konsantrasyonlarını arttırırlar (Drobnis 2017). 1958’de Rall ve Sutherland’ın (Rall ve Sutherland 1958) karaciğer hücrelerinde ikincil mesajcı olarak cAMP’yi tanımlamasından 5 yıl sonra 1963’te bir diğer ikincil mesajcı olan cGMP de Ashman ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır (Ashman vd. 1963). Hücredeki cAMP-FDE etkinliği ise ilk olarak 1962 de yapılan çalışmayla ortaya konmuştur (Butcher ve Sutherland 1962). Günümüzde insan hücrelerinde 21 genin kodladığı 11 tane FDE ailesi tanımlanmış olmakla birlikte, bu enzimler hücredeki yerleşimleri, allosterik yapıları, aminoasit dizilimi, substrat spesifikliği, regülatör mekanizmaları ve farmakolojik özellikleri bakımından değişkenlik gösterirler (Bender ve Beavo 2006, Conti vd. 2014).

40

Şekil 2.10 FDE’ lerin yapısal olarak sınıflandrılması (Singh ve Patra 2014)

FDE’ler yapısal olarak 3 ana domainden oluşur; 270-300 aminoasit içeren sıkı korunmuş bir C-Terminal katalitik domain, Regülatör domain ve N-Terminal domain.

FDE aileleri regülatör domainlerindeki farklılıklara göre sınıflandırılmaktadır (Singh ve Patra 2014). Memelilerde %25-52 homoloji gösteren katalitik domainleri Mg veya Zn metal iyonuna sahiptir. Genellikle dimerler halinde bulunan FDE izozimleri substrat afinitesi bakımından ise aşağıdaki şekilde gruplandırılırlar;

cGMP’yi hidrolize edenler; FDE5, FDE6, FDE9

cAMP’yi hidrolize edenler; FDE4, FDE7, FDE8

Hem cAMP hem de cGMP’yi hidrolize edenler; FDE1, FDE2, FDE3, FDE10, FDE11.

FDE izozimleri insanda beyin, kalp, akciğer, böbrek, iskelet kası ve düz kaslar, hipofiz,

FDE izozimleri insanda beyin, kalp, akciğer, böbrek, iskelet kası ve düz kaslar, hipofiz,