TUNEL boyama yöntemi ile DNA hasarı oluşumu tespitinde FM ve FLS

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.2 Deney Bulguları

4.2.4 TUNEL boyama yöntemi ile DNA hasarı oluşumu tespitinde FM ve FLS

Şekil 4.9 TUNEL boyama sonrası FM görüntüleri. Orijinal büyütme x100. A, C- Alandaki toplam sperm hücreleri; B, D- İmmünfloresan boyama sonrası sperm hücreleri. Mavi renk Hoechst(+) spermi, yeşil renk TUNEL(+) spermi belirtmektedir

Şekil 4.10 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 deney gruplarının DNA hasarı oranları

Şekil 4.10 FLS ölçümlerinde T, K30, K60, P30, P60 deney gruplarının DNA hasarı oranları (devam)

KP işlemi öncesinde ve KP sonrasında çözdürülen sperm hücrelerinde PAP uygulanan ve uygulanmayan grupta 30. ve 60. dakikalarda sperm DNA’sında oluşan hasar oranlarının belirlenmesi için TUNEL ile floresan boyama yapılmıştır. TUNEL(+) grubu için T grubunun ortalaması %17,53±8,02 iken, K30, K60, P30, P60 gruplarının ortalamasının sırasıyla %22,90±9,72; %22,83±10,17; %22,67±9,93; %23,21±10,33) olduğu belirlenmiş ve T grubunun ortalamasının istatistiksel olarak K30, K60, P30, P60’tan anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0,01). Ancak TUNEL(+) grubu için K ve P grupları ortalamaları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılığın olmadığı gözlenmiştir (P>0,05).

Şekil 4.11 Deney gruplarının DNA hasarı oranları. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05)

77 5. TARTIŞMA ve SONUÇ

Sperm hücreleri KP ve çözme prosedürleri sırasında maruz kaldıkları ısı değişimleri, buz kristali oluşumu, ozmotik şok, ROT oluşumu ve KPM toksisitesi gibi etkiler nedeniyle kriyohasara uğramaktadır. Sperm hücre membranları çoklu doymamış yağ asiti içeriğinin yüksek olması nedeniyle bu etkilere karşı oldukça hassastır. Membran yapılarında oluşan hasara bağlı olarak mitokondrilerde de ΔΨm de azalma ve fonksiyonel kayıpların ortaya çıktığı bilinmektedir. Mitokondriler, enerji metabolizmasının ve hücre canlılığının devamı için hayati öneme sahip organeller olması bakımından kriyohasara uğramaları halinde sperm hücrelerinin canlılık ve hareketlilik oranı ile fertilizasyon kapasitesi olumsuz etkilenmektedir. Günümüzde farklı KPM’ler ve farklı KP yöntemleri kullanılmakla birlikte şimdiye kadar yapılmış pek çok sperm KP çalışmasında sperm hareketliliğinde çözme sonrası % 30-75’e varan oranlarda azalmanın olduğu bildirilmiştir (Keel vd. 1987, Hammadeh vd. 1999, Esteves vd. 2000, Nijs vd. 2009).

Punyatanasakchai ve arkadaşlarının iki farklı KP yönteminin etkinliğini karşılaştırdığı çalışmada çözme sonrası ileri motilitede yaklaşık %60 oranında azalmanın yanısıra, normal morfolojideki spermatozoa sayısında da %50’ye varan oranlarda düşüşün olduğu tespit edilmiştir. Hızlı dondurma yönteminin azot buharında dondurma yöntemine göre daha az kriyohasara neden olduğu açıklanan çalışmada 3 gün saklama süresi sonunda çözme işlemi yapılmış ve uzayan saklama sürelerinin hücreler üzerindeki etkilerinin farklı olabileceği belirtilmiştir (Punyatanasakchai vd. 2008). Boğa spermleriyle yapılan bir çalışmada ise KP sonrası sperm hücrelerinin sağkalım ve hareketlilik oranlarında %50-70’e varan azalma tespit edilmiştir. CASA ile hareketlilik parametrelerinin değerlendirilmesi sonucunda çözme sonrasında spermlerin VCL, VAP ve ALH oranlarında anlamlı derecede azalma, STR‘de ise artışın olduğu kaydedilmiştir (Yoon vd. 2016). O’Connell ve arkadaşlarının, normozoospermik örneklerin azot buharında dondurulmasıyla gerçekleştirdikleri çalışmada çözme sonrası canlılık %31, TM %33, ileri motilite %41 oranında azalmıştır. Taze spermler ile KP sonrası spermlerinn motilite parametreleri karşılaştırıldığında ise VAP %31, VSL %29, VCL % 32, BCF %18 ve LIN %16 oranında azalmış ve aradaki bu fark istatistiksel olarak

anlamlı bulunmuştur (O'connell vd. 2002). Bizim çalışmamızda da KP sonrası canlılık ve motilite oranlarında benzer şekilde azalmanın olduğu tespit edilmiştir. Hareketlilik özellikleri detaylı olarak incelendiğinde düşüş oranlarının VSL %33,6, VCL %32,5, VAP %36, ALH %31,8, LIN %12,4, WOB %7,4, STR %5 olarak gerçekleştiği görülmüştür. İstatistiksel olarak değerlendirildiğinde STR ve LIN dışındaki parametrelerdeki düşüş anlamlı bulunmuştur.

KP sonrasında ortaya çıkan sperm parametrelerindeki bu bozulma, kısırlık tedavilerinde sıklıkla başvurulan sperm dondurma işlemlerinde başarısızlıklara neden olmaktadır.

Özellikle az sayıda sperm sayısına sahip, ya da testisten elde edilmesi nedeniyle hareket kabiliyeti baştan yetersiz olan spermatozoanın çözdürülmesi sonrasında hareketlilik gözlenmemesi ICSI işlemlerinde sperm seçimini zorlaştırmaktadır. Sperm hareketliliğini artıran maddelerin eklenmesi, hareketsiz ancak canlı spermlerin ayırd edilebilmesini sağlamaktadır. Ancak bu maddelerin kullanımıyla ilgili oldukça çelişkili ve eksik veriler mevcuttur.

KP işlemi sonrasında azalmış motiliteyi aktive etmek amacıyla kullanılan FDE-İ’ler hücre içindeki ikincil mesajcılardan cAMP ve cGMP’lerin yıkımını engellemek suretiyle hücre içi konsantrasyonlarının artmasına neden olmaktadırlar. Hücre içindeki cAMP düzeyindeki değişimlerin pek çok farklı sinyal yolağı üzerinden proteinlerin fosforilasyonunu etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle ikincil mesajcılardan cAMP ve cGMP miktarı, proteinlerin sperm hücresi üzerindeki lokalizasyonuna bağlı olarak özellikle kapasitasyon, AR ve kuyruk hareketi gibi fonksiyonların düzenlenmesinde oldukça önemlidir. Bizim çalışmamızda da PAP kullanılarak sperm hücrelerindeki FDE10’un inhibe edilmesi amaçlanmıştır. Bu yolla hücre içindeki cAMP ve cGMP’nin yıkımı engellenerek ortamdaki konsantrasyonlarının artışı neticesinde kuyruk hareketliliğinde de artış olması öngörülmektedir. Yakın zamanda FDE10’un insann sperm hücrelerinin sitoplazmasında ve seminal plazmadaki varlığının açıklanmasıyla birlikte motilite aktivatörleri seçiminde dikkati PAP üzerine çevirmiştir. FDE10 özellikle insan sperm sitoplazmasında aktif bir fonksiyon üstlenirken, FDE4 ve 11’in ise esas olarak seminal plazmada görev yaptığı saptanmıştır (Marechal vd. 2017).

FDE10’un PAP duyarlı olduğu bilindiğinden bu bileşenin klinik pratikte kullanımı

konusunda bilgi birikimine gereksinim ortaya çıkmış ve çalışmamızın hipotezini şekillendirmiştir.

Sperm hareketliliğinde artış sağlamak için invitro koşullarda PF (Aribarg vd. 1994, Nassar vd. 1999, Stanic vd. 2002, Nabi vd. 2017), Platelet Aktive Edici Faktör (PAF) (Roudebush 2007, Grassi vd. 2010, Kordan vd. 2010), Caffeine, Kallikrein (Barakat vd.

2015), Procaine, Trolox (Ortgies vd. 2012, Nekoonam vd. 2016), Thapsigargin (Ho ve Suarez 2001b), Theophylline (Ebner vd. 2014), Sildenafil citrate (Glenn vd. 2007) gibi pek çok aktivatör madde kullanılarak çalışmalar yapılmıştır. Sığır sperm hücreleri ile yapılan bir çalışmada KP sonrası motilite aktivatörü olarak kallikrein, kafein ve PF uygulanmış ve 30 dakikalık süre içinde en fazla hareketlilik artışının 5 mM kafein dozunda gerçekleştiği açıklanmıştır (Barakat vd. 2015). İnsan spermlerinde yapılan benzer bir çalışmada ise uygulanan 6 mM kafeinin hareketlilikle birlikte kapasitasyon oluşumunu da artırarak ALH düzeyinde artışa yol açtığı; PF uygulamasının ise ALH’de etki göstermeyip yanlızca ileri hareketlilik artışına neden olduğu belirlenmiştir. Kafein ve PF’nin glikolizi %40 oranında artırmak suretiyle kuyruk hareketliliğini hızlandırdığı açıklanmıştır (Rees vd. 1990). Çalışmamızda kullanılan PAP’ın 100 µM’lık derişiminin, 30 ve 60. dakikalarda azalan hücre hareketliliğini artırdığı, bunun yanında ALH parametresinde değişiklik yaratmadığı ve AR oluşumunu da arttırmadığı tespit edilmiştir. Bu değerlendirmeler ışığında özellikle klasik IVF ve IUI işlemlerinde PAP’ın, oluşması istenmeyen erken kapasitasyon ve hiperaktivasyonu tetiklemediği ve bu açıdan güvenilir bir bileşik olduğu düşünülmüştür.

Günümüzde infertilite tadavileri sırasında en yaygın olarak kullanılan motilite artırıcılar PF ve PAF’tır. Ancak bu maddelerin kullanım miktarı ve uygulanma süreleri konusunda tam olarak fikirbirliğine varılmamıştır. Bazı çalışmalarda PF’nin oksidatif stres kaynaklı toksisiteyi azaltıcı etki gösterdiği bildirilmekle birlikte (Zhang vd. 2005), artan dozlarının embriyotoksik etki yapabileceğine ya da spermlerde hem PF’nin, hem de PAF’ın DNA fragmantasyonuna yol açabileceğine dikkat çekilmektedir (Tournaye vd.

1993, Centola vd. 1995, Unsal vd. 2016).

Sperm hareketliliğini artırmada rutin kullanıma girmeye aday olan PAP’ın, CASA motilite parametreleri üzerindeki etkileriyle ilgili bulgu sunan her hangi bir yayına literatürde rastlanmamıştır. Ancak diğer FDE-İ’lerin kullanımı sonrası CASA parametreleri çeşitli çalışmalarda değerlendirilmiştir. Nabi ve arkadaşlarının KP sonrası astenozoospermik (hareket bozukluğu gösteren) spermlere 30 dakika süreyle 3.6 mmol/l PF uyguladıkları çalışmada ileri motilitede anlamlı derecede artış olduğu; DNA hasar oranı ve kromatin bütünlüğünde ise PF uygulamasının anlamlı bir değişime yol açmadığı bildirilmiştir (Nabi vd. 2017). Astenozoospermik ve normozoospermik örneklere PF uygulandığı bir diğer çalışmada ise TM, VAP, VSL ve BCF oranında anlamlı bir değişikliğin olmadığı, LIN’de her iki grupta da azalmanın olduğu kaydedilmiştir. PF’nin ileri motil sperm oranında değişime yol açmamasına karşılık, sperm motilite paternlerinden VCL, ALH’de istatistiksel olarak anlamlı artışa yol açtığı açıklanmıştır (Nassar vd. 1999).

Aribarg ve ark. yaptığı çalışmada ise KP sonrası sperm hücrelerine 30 dakika, 3 saat ve 24 saat süreyle PF uygulanmıştır. CASA analizi sonuçlarına göre 30 dakika ve 3 saat gruplarında TM, VCL, VSL, ALH ve VAP oranlarında anlamlı derecede artışın olduğu belirlenmiştir. 24 saat süreyle PF uygulanmış olan grupta ise motilitede diğer gruplara göre belirgin bir azalma olduğu açıklanmıştır (Aribarg vd. 1994). Benzer çalışmalardan elde edilen sonuçlarda PF uygulamasının ileri motilite oranlarında anlamlı derecede artış olduğu kaydedilmekle birlikte, uygulanan doz ve uygulama süresine bağlı olarak hücreler üzerindeki etkinliğinin değişkenliği dikkat çekmektedir (Paul vd. 1996, Stanic vd. 2002, Nabi vd. 2017). Çalışmamızda KP sonrası 100 µM PAP ilave edilmiş grupta 30.dakikada ileri motilite %34,2 ve TM %24,8 artış gösterirken 60.dakikada bu oran

%24,9 ve %23,8 olarak gerçekleşmiştir. Ancak PAP uygulamasının PF’de olduğu gibi VCL, VSL, VAP gibi hareketlilik parametrelerinde kontrol grubuna göre anlamlı değişime yol açmamasının, kullanılan dozlar ve PAP ile PF’nin etkinlik mekanizmasındaki farklılıklar sebebiyle olabileceğini düşündürmektedir. T grubuyla karşılaştırıldığında, LIN değeri K30 için (p=0,16) ve K60 için (p=0,70) değişim göstermemektedir. Ancak PAP uygulaması sonrası T grubuyla kıyaslandığında P30 ve P60 gruplarında LIN (VSL/VCL) değerindeki anlamlı azalma, PAP’ın spermlerin hareket gücünü artırmasına bağlı olarak dolaylı yoldan LIN’de azalmaya yol açmış

olabileceğini düşündürmektedir. Çünkü tek başına anlamlı değişiklik göstermeyen VSL ve VCL değerlerinin oranları alındığında ortaya çıkan LIN değerindeki anlamlı düşüş;

spermlerin iki nokta arasında ilerlerken düz bir yol izlemek yerine, aynı noktaya giderken daha eğrisel çizgide yol aldığını göstermektedir. T, K ve P grupları karşılaştırıldığında; KP ve PAP uygulamalarının her ikisinin de spermatozoonun hareketinin ortalama yörünge doğrusallığını belirten STR’de anlamlı bir değişime yol açmadığını göstermektedir. Larsen ve arkadaşlarının yayınladığı bir çalışmada, semen analizlerinde VCL, VAP, STR ve BCF oranları yüksek olan spermlerin fertilizasyon başarısının daha fazla olduğu bildirilmiştir (Larsen vd. 2000). Ancak çalışmamızda elde ettiğimiz bulgularla bu verilerin ilişkisini değerlendirmek ve hareket parametrelerindeki değişikliğin klinik açıdan ne anlama geldiğini ortaya koyabilmek amacıyla ileri deneysel ve klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.

KP işlemi membranlarda fosfolipid yapının yanısıra karbonhidrat içeriğinde de değişime neden olmaktadır. Olgun spermatozoon membranı, epididimden geçerken glikolize edilmiş lipid ve proteinden oluşan bir tabaka olan glikokaliksle kaplanır.

Yaklaşık olarak 300 farklı glikoprotein ve glikolipidden meydana gelen glikokaliks, seprmatozoonun dış çevreyle etkileşimde olan yüzeyidir. Spermiyogenez, kapasitasyon, AR gibi fizyolojik olaylarda bu tabaka yeniden düzenlenmektedir. Glikokaliksin spermatozoonun korunması, oositi tanıma ve kaynaşması süreçlerinde etkin işlevleri olması nedeniyle glikokaliksin bütünlüğü başarılı fertilizasyonun gerçekleşmesi için oldukça önem taşır (Cross ve Overstreet 1987, Schroter vd. 1999, Purohit vd. 2008).

Xin ve arkadaşları, KP sonrası sperm hücresi membranının glikoprotein monomerlerinden biri olan N-Asetilnöraminik Asit (Sialik Asit) içeriğinde belirgin azalma olduğunu bildirmiştir (Xin vd. 2018). Sitolojik, morfolojik ve ultrastrüktürel çalışmalarda özellikle hızlı dondurma tekniği kullanıldığında plazma membranıyla birlikte, başın hemen altında yeralan akrozom membranında da oluşan hasarın akrozomal matriksin kaybına da yol açabileceğini bildiren çalışmalar mevcuttur (Barthelemy vd. 1990, Mclaughlin vd. 1993).

Özkavukçu ve arkadaşlarının 2008’de yaptığı çalışmada, dondurma ve çözme işlemi sonrasında elektron mikroskobi incelemelerinde sperm hücrelerinin apikal bölgesinde değişim ve subakrozomal bölgede de şişme olduğu gözlenmiştir. Aynı zamanda hareketlilik ve canlılık oranlarının azalmasıyla birlikte morfolojik hasarın da arttığı saptanmıştır (Ozkavukcu vd. 2008).

Bathelemy’nin yavaş dondurma tekniğiyle dondurulmuş sperm hücrelerinde akrozomdaki değişimleri incelediği taramalı elektron mikroskobi çalışmasında, seminal plazmayla birlikte dondurulan hücrelerin Akrozom bütünlüğünde (AB) %21 kayıp olmasına karşın, seminal plazması ayrıştırılarak dondurulan hücrelerde bu kaybın %32.5 olduğu belirlenmiştir (Barthelemy vd. 1990). Bizim çalışmamızda seminal plazma uzaklaştırıldıktan sonra KP prosedürü uygulanmıştır ancak AB’de ortaya çıkan kayıp Barthelemy ve arkadaşlarının tespit ettiği düzeyde gerçekleşmemiştir. KP sonrası akrozomal enzimlerden akrozin/proakrozin düzeyinde %50’nin üzerinde azalma tespit edilen bir diğer çalışmada ise kriyohasarın sperm AB üzerinde olumsuz etkileri olduğu bildirilmiştir (Mack ve Zaneveld 1987). Cross ve Hanks ise KP sonrası sperm hücrelerinin AB’de %27, akrozin düzeyinde ise %24 azalmanın olduğunu, ancak motil spermatozoanın İntak Akrozom (İA) oranının %96 olarak belirlendiğini açıklamış ve akrozomal kaybın büyük oranda hücre canlılığın kaybedilmesiyle birlikte geliştiğini açıklamışlardır (Cross ve Hanks 1991).

Suni tohumlama alanında ise Panda spermleriyle yapılan bir çalışmada KP öncesi İA oranı 93±1,7% ; KP sonrası İA ise 81,7±4,7% olarak (p˃0,05) belirlenmiş ve KP işleminin AB’de anlamlı bir değişikliğe yol açmadığı açıklanmıştır (Spindler vd. 2004).

Çalışmalarda kullanılan KP prosedürlerinin KPM’lerin farklı olması ve akrozom inceleme tekniklerindeki farklılıklar nedeniyle elde edilen veriler değişkenlik göstermektedir. Rahiminia ve arkadaşlarının insan spermlerinde 3 farklı dondurma protokolü uyguladığı çalışmada AB’de çözme sonrası anlamlı derecede azalma olduğu açıklanmıştır. İkili boyama tekniği uygulanan taze spermlerdeki AB %88,9 olarak belirlenirken, hızlı dondurma tekniği, katı yüzey dondurma ve azot buharında dondurma teknikleriyle yapılan KP sonrasında ise sırasıyla %81,3; %81,6 ve %82,4 olduğu

saptanmıştır. Çalışmada kullanılan KP yöntemleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamakla birlikte AB’nin en fazla korunduğu yöntemin azot buharında dondurma olduğu görülmektedir (Rahiminia vd. 2017). Bizim çalışmamızda da azot buharıyla dondurma yöntemi uygulanmış olup Rahminia ve arkadaşlarının açıklamalarına benzer sonuçlar elde edilmiştir. Çalışmamızda taze spermlerde %86,20 olarak olan İA oranının KP sonrası %79,5 olarak tespit edilmesiyle birlikte KP sonrası AB’de görülen hafif düzeydeki azalmanın istatistiksel olarak farklılığa yol açmadığı görülmüştür. Bu bulgular literatürle uyumlu olup, aynı zamanda sperm dondurma-çözme tekniğimizin AR oluşumu açısından olumsuz etkilere yol açmadığını göstermektedir.

Sperm hareketliliğini artırmak için kullanılan maddelerin spontan AR gelişimi ve AB üzerindeki etkinliği konusunda da literatürde birbirinden farklı sonuçlar olduğu gözlenmektedir. Bir FDE-İ olarak taze sperm hücrelerine uygulanan PF’nin sperm hücrelerinin oosite penetrasyon kabiliyetini artırmasının yanısıra, spontan AR gelişimini de artırdığı saptanmıştır (Morales vd. 1993). Benzer şekilde taze spermler üzerinde PF ve progesteron etkinliğinin incelendiği çalışmada PF’nin ileri hareketli ve kapasite olmuş sperm oranını artırırken AB’de değişime yol açmadığı; progesteronun ise kapasitasyon ve spontan AR gelişimini artırdığı ancak ileri motilite oranlarını etkilemediği tespit edilmiştir (Kay vd. 1994). Fisch ve arkadaşları sperm hücrelerinde hareketlilik artşını sağlamak amacıyla kullanılan bir FDE1 inhibitörü olan 8-IBMX’in spontan AR oluşumuna yol açtığını ancak aynı maksatla kullanılan FDE4 inhibitörü Rolipram’ın aynı etkiyi göstermediği bildirmiştir. Çalışmada FDE-İ lokalizasonuna bağlı olarak, FDE4’ün yoğunlukla orta parçada lokalize olması nedeniyle inhibisyonunun AR oluşumunu etkilememiş olabileceği ileri sürülmüştür (Fisch vd.

1998). Görüldüğü gibi FDE-İ’lerin farklı kullanım dozu ve sürelerde AR oluşumu üzerinde birbirinden farklı etkilerinin olduğu saptanmıştır. Bunun nedeni olarak, uygulanan maddelerin sperm hücrelerinde AR gelişiminde aracılık yapan iyon kanalları üzerindeki etkinliklerinin farklılığı olabileceği düşünülmüştür.

Tardif’in taze spermlerde motilite artışını indüklemek amacıyla yaptığı çalışmada, 100 µM dozda uygulanan PAP’in spontan AR oluşumu üzerinde anlamlı bir değişikliğe yol

açmadığı açıklanmıştır (Tardif vd. 2014). Bizim elde ettiğimiz veriler de Tardif’in bulgularıyla benzer şekilde PAP uygulamasının spermlerin AB’sinde bir kayıba yol açmadığını göstermektedir.

İnsan sperm hücrelerinde FDE10’un varlığı saptanmış olmakla birlikte lokalizasyonu tam olarak ortaya konulmamıştır. Goupil ve arkadaşları sığır testisinde FDE10A’nın lokalizasyonunu değerlendirmiş ve olgun spermlerde de varlığını göstermiştir. Buna göre spermlerin akrozom bölgesine uyan bir ifade dikkat çekmektedir. Bu lokalizasyonda olması nedeniyle AR açısından değerlendirmenin son derece önemli olduğu düşünülmüştür (Goupil vd. 2016). Yine sığır spermleriyle yapılan bir diğer çalışmada FDE10 ifadesinin post akrozom ve kuyrukta bulunduğu bildirilmiştir (Bergeron vd. 2017). Kuyruk lokalizasyonu hareketin artışındaki önemli bir neden olabilir. Baş bölgesindeki çelişkili verilerin giderilmesi ve insan spermatozoonundaki lokalizasyonunun ortaya konması için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır.

Ain ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada bir metilksantin türevi olarak FDE-İ etki gösteren PF’nin hamster spermlerinde hücreiçi cAMP artışına yol açması sonucunda kapasitasyon ve AR oluşumu üzerindeki olası etkinlik mekanizması aşağıdaki şekilde gösterilmiştir (Ain vd. 1999).

Şekil 5.1 Hamster sperm hücreleri üzerinde PF’ nin etkinlik mekanizması (Ain 1999)

Bizim çalışmamızda KP öncesi T grubunda ortalama %86,20 olarak saptanan AB oranının çözme sonrası gruplarda K30, K60, P30 ve P60’ ta sırasıyla %79,54; %77,75;

%79,64 ve %78,29 olduğu belirlenmiştir. Dondurma öncesi sperm AB oranları ile karşılaştırıldığında çözme sonrası tüm gruplarda AB’nin korunması bakımından bir azalma görülmekle birlikte, aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p˃0,05). PAP grubu ile kontrol grubu arasında 30 ve 60. dakikalarda spontan AR geçirmemiş sperm oranları arasında bir farklılığın bulunmaması bir FDE-İ olarak uygulanan 100 µM PAP’ın AB üzerinde olumsuz etkinliği olmadığını göstermektedir.

İnsan sperm hücrelerinin plazma membranlarının çoklu doymamış yağ asiti içeriği nedeniyle, antioksidans defans sistemi çoğu zaman oksidatif hasar karşısında yetersiz kalmakta ve membranlar ROT saldırısına açık hale gelmektedir (Jones vd. 1979, Alvarez vd. 1987). Sperm hücrelerininde KP ve çözme sonrası membranın lipit difüzyonunda farklılaşma gözlenmektedir. LPO’nun bir etkisi olarak membran fosfolipidlerinden Fosfatidil kolin ve Fosfatidiletanolamin miktarlarında azalma olduğu

bildirilmiştir (Alvarez ve Storey 1992). FS fosfolipidinin özellikle hücre içindeki apoptotik süreçlerde hücre membranında translokasyona uğraması, apoptozun erken belirteçlerinden birisi olarak kullanılmasına yol açmıştır. Farklı biyolojik koşullarda membran hasarına bağlı olarak FS molekülünün membranın iç yüzeyinden dış yüzeyine doğru çıkışı Anneksin V ile işaretlenerek belirlenmektedir (Vermes vd. 1995, Martin vd.

2005). Memelilerin sperm hücrelerindeki FST’nin tespitinde FM’ nin yanısıra FLS tekniği de kullanılmaktadır (Glander ve Schaller 1999, Duru vd. 2001). Köpek spermlerinde KP sonrasında spermlerde canlı ve apoptotik olmayan (AnV-/PI-) hücre sayısında azalmayla birlikte, DNA hasarı oluşumunda artış görülmüştür. Çalışmacılar spermlerdeki Hidrojen peroksit düzeyinin kontrol grubuna göre artış göstermesi nedeniyle tespit edilen apoptotik değişimlerin LPO sonucunda ortaya çıkmış olabileceğine dikkat çekmektedirler (Kim vd. 2010). Bizim çalışmamızda da benzer şekilde KP sonrası spermlerde (AnV-/PI-) hücre sayısı azalmış ve DNA hasarı oranı artmıştır.

Schuffner ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ise insan sperm hücrelerinin KP öncesi ve sonrasında LPO düzeyinde anlamlı derecede bir değişim olmadığı ancak KP sonrası FST’de anlamlı dercede artış görüldüğü belirlenmiştir. Donduma işlemi öncesinde yüksek LPO düzeyine sahip sperm hücrelerinde, çözme sonrasında kontrol grubuna göre daha yüksek FST olduğu saptanmıştır. Bu nedenle FST oluşumunda KP öncesi sperm karakteristiğinin önemine dikkat çekilmiştir. Elde edilen sonuçlar ışığında KP sonrası sperm membranındaki FS çıkışının nedeninin oksidatif hasardan çok membran stresi olabileceği açıklanmıştır (Schuffner vd. 2001).

İnvitro koşullarda sperm hareketliliğini artırmada kullanılan maddelerin membranlar üzerindeki etkileri tam olarak bilinmemektedir. Tardif ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, motilite aktivatörü olarak uygulanan 48 farklı madde arasında PAP, Tofiospam ve Ibudilast’ın oldukça etkin olduğu açıklanmıştır. Aynı çalışmada taze spermler üzerine uygulanan 100 µM PAP dozunun sperm hareketliliğini anlamlı derecede artırmasının yanısıra erken AR gelişimini ve FST oluşumunu etkilemediği belirlenmiştir (Tardif vd. 2014).

Bizim çalışmamızda (AnV-/PI-) sperm oranı T grubunda %73,61’den KP sonrasında

%32,89 seviyesine gerilemiş olup; istatistiksel olarak anlamlı derecede azalma görülmüştür. Bu sonuçla korele bir şekilde ölü ve apoptotik olmayan (AnV-/PI+), ölü ve erken apoptotik (AnV+/PI+) hücre sayısı da istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır. Canlı ve erken apototik (AnV+/PI-) hücre sayısında artıştan ziyade PI(+) hücre sayısında artışın belirlenmiş olması, KP ve çözme işleminin hücrelerde apoptoz oluşumundan çok; muhtemel ozmotik değişiklikler, buz kristali oluşumu veya hücrelerin sıkıca paketlenmesi ve membranlarda ortaya çıkan hasar nedeniyle canlılık

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ (sayfa 87-0)