Kuyruk yapısı ve hareketlilik - Sperm hücresinin yapısı

2. KURAMSAL TEMELLER

2.2 Spermatogenez

2.2.4 Sperm hücresinin yapısı

2.2.4.2 Kuyruk yapısı ve hareketlilik

İnsan spermlerinde kuyruk; boyun, orta parça, esas parça ve son parça olmak üzere 4 kısımdan oluşur.

Sperm hücresinin baş ve kuyruk bağlantısını sağlayan boyun kısmı proksimal sentriyolden meydana gelir ve yoğun fibröz yapıdadır. Bu yapının varlığı, boyun bağlantısında gerilim yaratmadan bükülmeyi kolaylaştırmakta ve sperm hareketliliği esnasında esneklik sağlamaktadır.

Orta parça 7 µm uzunlukta heliks olarak sarılmış mitokondrilerin bulunduğu kısımdır.

Bu mitokondriler kuyruk hareketi için gerekli enerjiyi sağlamada görev alırlar (Ross vd.

2016).

Esas parça yaklaşık 40 µm uzunlukta ve 0,5 µm çapta olup, içten dışa doğru; aksonem, kalın dış fibriller, fibröz kılıf ve plazma membranından oluşmaktadır. Aksonem, sperm kuyruk hareketini oluşturan temel yapıdır. Dışta 9 tane tubulin dimerinden oluşan komplet A ve inkomplet B lifleri birbirlerine nexin adı verilen yapılarla bağlanmaktadırlar. Bu yapılar da birbirine çapraz köprülerle, merkezde yer alan 2 tane A lifine ise radial uzantılarla bağlanırlar. Mikrotübülleri sabitleyen dynein kollar

ATP’nin oluşturduğu enerjiyi mekanik enerjiye çevirerek kuyruk hareketinin sağlanmasında etkilidir. Dışta yer alan fibröz kılıf, dış yoğun fibrillerle aksonemi çevrelemekle birlikte içerdiği disülfit bağlar sayesinde oldukça dayanıklıdır ve spermin kuyruk hareketini desteklemektedir (Cooper ve Yeung 2010, Inaba ve Mizuno 2016).

Fibröz kılıfta kapasitasyon ve hiperaktif motilitenin oluşmasında etkinlik gösteren gliseraldehit 3 fosfat dehidrogenaz, hekzokinaz I, aldolaz I, laktat dehidrogenaz, trioz fosfat izomeraz, pirüvat kinaz, laktat dehidrogenaz C, sorbitol dehidrogenaz ve ADP/ATP taşıyıcı protein 4 gibi sinyal yolağı enzimlerinin varlığı tespit edilmiştir (Inaba 2011).

Son parça, fibröz kılıfın distal ucundan başlayan 5 µm uzunluktaki kısmıdır. Bu bölgede dynein kolların kaybolmasının hemen ardından merkezdeki mikrotübül çiftleri kaybolurken, dıştaki tübüllerden ikisi merkeze hareket eder. B tübüllerinin de açılmasıyla kuyruk ucuna doğru aksonemin tübüler yapısının sona erdiği görülmektedir (Ross vd. 2016).

Şekil 2.5 İnsan sperminde kuyruk yapısı (A) (Reynolds vd.2017) ve elektron mikroskop görüntüsü (B) (Linck vd. 2016)

21 2.3 Semenin Yapısı ve Semen Analizi

Semen epididimis, duktus deferens, veziküla seminalis, Cowper bezi ve prostattan gelen çeşitli salgı ürünleri ve beraberinde testislerden gelen sperm hücreleri ile salgılardan oluşmaktadır. Alkali özellik gösteren semen, erkek üretra ve dişi vajinal kanallarındaki asiditeyi nötralize etmek suretiyle ejakülasyon sonrasında sperm hücresinin aktivasyonunda etkilidir (Eroschenko ve Di Fiore 2013).

2.3.1 Semen analizi

Sperm hücrelerinin canlılık ve ileri hareketlilik oranları, morfolojik özellikleri ve seminal plazmanın içeriği spermlerin fertilizasyon kapasitesini belirlemektedir. Semen kalitesi spermatogenez sürecindeki aksaklıklar, geçirilen ateşli hastalıklar, enfeksiyon, varikosel gibi testis toplardamar anomalileri, hipotalamus-hipofiz etkileşiminde bozulmalara neden olan hormonal düzensizlikler, alkol, sigara ve uyuşturucu kullanımı, çevresel toksinlere maruziyet ve cinsel perhiz süresi gibi koşullardan etkilenir.

Semen analizi için 2-7 günlük cinsel perhiz gereklidir. Masturbasyon yoluyla steril kap içerisinde toplanan semen örneği 37°C‘lik bir inkübatörde veya oda sıcaklığında likefaksiyonun oluşması için bekletilir. Seminal bezlerdeki proteinlerin etkinliğiyle ejakülasyon sonrasında semende koagulasyon oluşumu gözlenir. Likefaksiyon gerçekleşmeden semenin değerlendirilmesi hatalı sonuçlar alınmasına neden olabilmektedir. Prostat kaynaklı proteazların 15-60 dakikadaki aktivasyonu ile birlikte semen likefiye olmaktadır. Steril plastik pipetler yardımıyla aspire edilen semen damlatılarak viskozitesi derecelendirilir. Damlalar halinde akan semen normal viskoziteye, 2 cm den uzun iplikler şeklinde akışkanlık gösteren semen ise anormal viskoziteye sahip olarak değerlendirilir. Normal koşullarda beyaz-açık gri opak renkteki semen, eritrosit ihtiva ettiği durumlarda kırmızı-kahverengi renk almaktadır. Semen hacminin ölçülmesi, toplam sperm konsantrasyonunu belirlemek için gereklidir. Ancak kanal obstrüksiyonu, androjen yetersizliği ve seminal vezikül gelişiminde yetersizlik gibi durumlarda semen hacminde azalma görülürken, aksesuvar bez anomalilerinde ise normalden fazla hacimde semen çıkışı gözlenmektedir. Semen pHsi normalde 7,2-7,8

aralığında olup 1 saat içinde ölçülmesi tavsiye edilir. Semen, hafif asidik karakterli prostat sıvıları (pH:6,4) ve alkali karakterdeki seminal vezikül sıvılarının (pH:7,4) karışımından meydana gelmektedir. Spermlerin hareketlilik ve kapasitasyon özellikleri pH değişimlerinden etkilenir. Makroskobik analiz yapılırken renk, hacim, pH, viskozite ve likefaksiyon süreleri değerlendirilir. Mikroskobik analizde ise sayı, hareketlilik, canlılık, morfoloji ve yuvarlak hücre sayısı gibi özellikler değerlendirilir.

2.3.1.1 Sperm Sayısı ve hareketliliği

Likefiye olmuş semendeki sperm hücresi konsantrasyonunu belirlemek için Makler sayım kamarası veya Neubauer hemositometre kamarası gibi araçlar yardımıyla, oda sıcaklığında, fazkontrast mikroskop altında x200 büyütmede sayım yapılır. Ayrıca bilgisayar destekli otomatik sayım analizörleri de (CASA-Computer Assisted Sperm Analysis) kullanılmaktadır. Sperm konsantrasyonu hesaplanırken mililitrede bulunan sperm hücresi sayısı tespit edilerek milyon/ml olarak değerlendirilir. Sperm sayısı için alt referans 15 milyon/ml, toplam sperm konsantrasyonu için ise alt referans 39 milyon/ml olarak belirlenmiştir. Ayrıca ejakülat içerisinde olgunlaşmamış germ hücreleri, genital kanaldan gelen epitel hücreleri ve lökositler bulunabilmektedir.

WHO 2010 kriterlerine göre sperm hareketliliği 3 kategoride incelenmektedir:

a) Progresif hareketli ( hızlı, yavaş veya duraksayarak ileriye doğru hareketli) b) Yerinde hareketli (ileriye doğru olmayan hareket veya yalnızca kuyrukta hareket) c) Hareketsiz

Çizelge 2.1 WHO (World Health Organization) 2010’a göre sperm normal değerleri

PARAMETRE REFERANS ALT LİMİTİ

Semen Hacmi 1.5 ml

Sperm Konsantrasyonu 15x10⁶ /ml

Total Sperm Sayısı 39x10⁶ /ejakulat

Progresif (ileri) Motilite 32 % (A)

Total Motilite 40 % (A+B)

Vitalite (canlılık) 58 %

Sperm Normal Morfoloji 4 %

pH ≥ 7.2

Lökosit < 1x10⁶

MAR < 50%

CASA cihazlarıyla yapılan bilgisayar destekli sperm analizinde alınan görüntülerin dijital ortama aktarılmasıyla sperm hareketinin kinematiği detaylı olarak belirlenebilmektedir.Bazı CASA motilite parametreleri aşağıda açıklanmıştır:

VSL (Straightline Velocity): Doğrusal Hız (μm/s). Sperm başının ilk konumu ile en son konumu arasındaki ortalama hızı.

VCL (Curvilinear Velocity): Eğrisel Hız (μm/s). Sperm başının eğrisel yoldaki ortalama hızı.

VAP (Velocity Average Path): Ortalama yol hızı (μm/s). Sperm başının ortalama yörüngedeki hızı.

ALH (Amplitude of Lateral Head Displacement) (μm): Sperm başının lateral düzlemde yer değiştirme büyüklüğü.

LIN (Linearity): Doğrusallık, VSL/ VCL.

STR (Straightness): Doğrusallık. Ortalama yörüngenin doğrusallığı, VSL/ VAP.

24 WOB (Wobble): Dalgalanma, VAP/VCL.

BCF (Beat Cross Frequency): Çapraz geçiş frekansı (Hz).

Şekil 2.6 CASA motilite parametreleri (http//norwegianred.com)

2.3.1.2 Sperm canlılığı

Semen analizinde hareketsiz (c) olarak saptanan sperm hücrelerinin hepsi ölü olmamaktadır. Canlı ama hareketsiz hücreleri saptamak için membran bütünlüğünün belirlenmesine yönelik Hipoosmotik Şişme Testi (HOS) veya Eosin-Nigrosin boyama gibi testler uygulanmaktadır.

2.3.1.3 Sperm Morfolojisi

Sperm hücrelerinin morfolojik yönden değerlendirilmesi için lam üzerine damlatılan sperm süspansiyonu ince bir tabaka halinde yayma yapılarak preparat hazırlanır. Diff Quick, Spermac, Papanicolau gibi boyalarla boyama sonrasında hücreler immersiyon objektifinde 100x objektifte incelenir. Günümüzde insan spermlerinin morfolojik değerlendirmesinde 1987’de Kruger tarafından tanımlanmış olan Kesin Morfolojik

Kriterler kullanılmaktadır. Normal morfolojiye sahip bir sperm hücresinin sahip olması gereken özellikler aşağıdaki gibi tanımlanmaktadır;

Baş: Düzgün sınırlı, genellikle oval şekilli sperm başının %40-70’ini akrozom oluşturmalıdır. Baş bölgesinde bulunabilecek vakuollerin büyüklüğü %20’den küçük olmakla birlikte post akrozom bölgesinde yer almaması gerekir. Baş anomalileri; küçük, büyük, yuvarlak, uzun, sivri, vakuollü, piriform, amorf, çok nükleuslu ve çift başlı olarak kategorize edilmektedir.

Orta Parça: İnce ve düzenli sınırlı orta parça kısmı yaklaşık olarak sperm hücresinin baş uzunluğuna yakın ölçülerdedir. Orta parça ve başın ana ekseni aynı hizada bulunmalıdır.

Bağlantı kısmının kalın, düzensiz, çok ince veya kıvrılmış olması, sperm başının 1/3’ü veya daha fazla oranda rezidüel sitoplazma bulunması anomali olarak değerlendirilir.

Ana Parça: Yaklaşık 50-55 µm. uzunlukta olmalı ve uzunluğu boyunca bu parçanın genişliği değişkenlik göstermemelidir. Kısa,sarmal veya uzun olması, sayıca birden fazla olması, keskin açılı bükülme veya kırık olması anomali olarak değerlendirilmektedir.

2.3.1.4 Sperm Fonksiyonu

Sperm hücrelerinin fertilizasyon başarısında canlılık, hareketlilik ve morfolojik özelliklerinin yanısıra membran yapısı, akrozom reaksiyonu, oosit penetrasyonu ve çekirdek kondansasyonu gibi bazı fonksiyonel özelliklerinin de önemli etkisi bulunmaktadır. Sperm fonksiyonunu belirlemek için yapılan testler: Akrozom bütünlüğü testi, Akrozin tayini, Hipoozmolar şişme testi (HOS), Antisperm antikorları, Postkoital test, Hamster zona bağlanma testi, Hyaluronik asit bağlanma testi, Hemizona bağlanma testi, Servikal mukus bağlanma testi olarak sıralanabilir (Agarwal vd. 2008).

26 2.3.1.5 Sperm DNA hasarı

Fertil veya infertil erkeklerin ejakulat spermlerinde DNA hasarı görülmekle birlikte, hasarlı DNA’ya sahip spermlerin fertilizasyon oranlarında azalmaya ve erken dönem gebelik kayıplarına neden olduğu bilinmektedir (Sun vd. 1997, Lopes vd. 1998, Evenson vd. 1999). Sperm hücrelerinde ortaya çıkan DNA hasarı oluşumunun başlıca nedenleri; Spermatogenez sırasında kromatin paketlenmesi sırasındaki hatalar ve yanlış bağlanmalar, ejekülatta yüksek miktarlarda ROT varlığı, çevresel toksinlere maruziyet, sigara ve alkol kullanımı gibi ROT oluşumunu artırıcı yaşam şekli ve apoptozdur (Saleh ve Agarwal 2002, Moustafa 2004, Aitken ve Koppers 2011). Günümüzde DNA’daki hasar oranını saptamak için kullanılan farklı yöntemler bulunmaktadır;

1- DNA hasarını belirlemek için TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), Sperm kromatin yapı analizi (Sperm Chromatin Structure Assay-SCSA), Halo Sperm yöntemi (Sperm Chromatin Dispersion-SCD), Akridin Orange Testi (AOT), Tek Hücre Elektroforez (COMET) yöntemi, 8- hidroksi 2-deoksiguanozin (8-OHdG) ölçümü,

2- Sperm kromatini paketlenmesinde ortaya çıkan anormallikleri belirlemek için Kromomisin A3 (CMA3) boyama, Anilin Blue (AB) boyama, Toluidin Blue (TB) boyama yöntemleri

3- Kromozom anomalilerini tespit etmek için ise Floresan In-Situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi kullanılmaktadır.

Bu yöntemlerin uygulanması sırasında çeşitli denatürasyon, fiksasyon ve boyama prosedürleri uygulanarak ejakülattaki DNA hasarlı spermatozoa oranı belirlenmektedir (Zhang vd. 2010, Carrell ve Aston 2013, Cankut vd. 2019). Günümüzde DNA hasarını (anormal kromatin paketlenmesi, DNA fragmantasyonu ve protamin eksiklikleri) tespit etmek için kullanılan yöntemlerin referans arlıkları ve güvenilirlik düzeyleri hakkında tam olarak fikir birliğine varılamamıştır. Ancak sperm DNA bütünlüğü incelemelerinde en fazla tercih edilen yöntemler TUNEL, SCSA ve SCD olarak dikkat çekmektedir (Majzoub vd. 2017).

27 2.4 Kriyoprezervasyon

Kriyoprezervasyon işlemi, gelecekte kullanılması planlanan çeşitli hücrelerin ve dokuların biyolojik aktivitelerinin yavaşlatılması suretiyle 0°C’nin altındaki ısılara kadar soğutularak saklanmasıdır. Organ, doku, hücre ve organizmaların dondurulmasını inceleyen bilim dalı olarak kriyobiyoloji, farklı dondurma ve çözme prosedürleri, kriyoprotektan etkinliği ve hücrelerde meydana gelen fizyolojik-fonksiyonel özelliklerin belirlenmesi bakımından günümüzde de gelişimini sürdürmektedir.

Kriyobiyolojide kullanılan dondurma ve çözme prosedürleri hücreden hücreye değişim göstermekle birlikte hücrelerin sağ kalımı için en önemli etken buz kristali oluşumudur.

Dondurma işlemi yapılırken kullanılan KPM’ler, hücre içi su miktarını en aza indirgeyerek intraselüler buz oluşumunun engellenmesinde etkilidirler. KP sırasında ısının azalmasıyla birlikte su moleküllerinin sayısının azalması ve oluşan hipertonik ortamda hücrelerin dehidratasyonu gerçekleşir. Bu aşamada dehidratasyon hızı da hücre canlılığını etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Soğutma hızının çok hızlı olması, ani hücre içi buz oluşumuna yol açmaktadır. Soğutmanın yavaş gerçekleştirilmesi durumunda ise hücrelerin uzun süre yüksek ozmolariteye maruz kalması nedeniyle membran lipoproteinlerinin denatürasyonu söz konusu olmaktadır. Bu nedenle canlılığının devamlılığı bakımından hücrelerin soğutulma hızı KP sırasında göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktörlerdendir (Lovelock 1957).

Sperm KP işlemi ilk olarak 1949‘da Polge ve arkadaşları tarafından gliserol kullanılarak gerçekleştirilmiş, 1953’te ise dondurulmuş-çözülmüş spermlerden elde edilen ilk fertilizasyon Bunge ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir (Polge vd. 1949, Bunge ve Sherman 1953).

Günümüzde sperm hücrelerinin dondurulması, yardımla üreme tekniklerinin (YÜT) kullanıldığı alanlarda sıklıkla uygulanmaktadır. Fertilite potansiyelinin azalmasına veya tamamen ortadan kalkmasına yol açacak işlemlerden önce sperm hücrelerinin dondurularak saklanması oldukça önem taşımaktadır. Fertilitenin korunması amacıyla sperm hücrelerinin dondurulmasını gerektirecek durumlar aşağıda belirtilmiştir;

1- Kemoterapi, radyoterapi gibi çeşitli kanser tedavilerinin spermatogenezi kalıcı olarak yada birkaç yıl süreyle bozabildiği bilinmektedir. Özellikle testis kanseri, lenfoma, lösemi, santral sinir sistemi tümörleri gibi hastalıkların tedavisi öncesinde fertilitenin korunması gereken hallerde,

2- Spermatogenez üzerinde istenmeyen etkiler gösterecek özellikteki ilaçların (örneğin Nitrofurantoin, Sulfasalazin, Simetidin v.b ) kullanılması gerekliyse,

3- Ejakülasyonun doğal şekilde gerçekleştirilemediği durumlarda (Spinal kord hasarı veya seksüel disfonksiyon v.b.) ,

4- Testis cerrahisi gerektiren tedavilerden (variselektomi, total veya parsiyel orişektomi) önce,

5- İnfertilite tedavileri sırasında elde edilmiş olan testiküler spermlerin (TESE, TESA, MESA) sonraki tedavilerde de kullanılabilmesi amacıyla,

6- Sağlıklı ve fertil erkeklerden alınan örneklerden ÜYTE sürecinde kullanılmak üzere, 7- Sperm bağışı (donasyon) yapılacağı durumlarda,

8- Veterinerlik, hayvan yetiştiriciliği ve suni tohumlama uygulamalarında

sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu gerçekleştirilmektedir (Gupta vd. 2011, Hamada vd. 2014).

Ülkemizde sadece aşağıda belirtilen durumlarda erkek gonad ve üreme hücrelerinin dondurulmasına yasal olarak izin verilmiştir;

1- Çeşitli kanser tedavileri sırasında kemoterapi ve radyoterapi öncesinde,

2- Ejakülatta sperm hücresi bulunmayıp testislerden aspirasyon veya cerrahi yöntemlerle sperm hücresi elde edilmesi durumunda,

3- Testis cerrahisi gibi üreme fonksiyonunu etkileyecek ameliyatlar öncesinde.

Günümüzde testis dokusundan cerrahi yönemle veya ejakülasyonla elde edilen sperm hücrelerinin dondurulmasında pek çok farklı özellikte kriyoprotektan madde ve farklı dondurma çözme prosedürlerinin kullanılması sözkonusudur.

29 2.4.1 Kriyoprotektan maddeler

KP işlemi yapılırken hücrelerin sağkalım oranını artırmak amacıyla kullanılan KPM’ler genellikle yüksek Hidrojen bağlama yeteneği gösterirler. İçinde bulundukları çözeltinin kristalleşme eğilimini azaltarak donma sıcaklığını düşüren bu maddeler; hücre içine nüfuz eden (permeabl) ve hücre içine nüfuz etmeyen (non-permeabl) KPM’ler olarak 2 grupta sınıflandırılırlar:

2.4.1.1 Hücre içine nüfuz eden KPM’ler

Bu gruptaki KPM’ler sudan yavaş da olsa hücre zarından içeriye geçerek proteinleri stabilize ederken, hücre içinde buz oluşum sıcaklığını –40°C’ye kadar düşürmeleri nedeniyle ozmotik değişimlerden kaynaklanan hücre hasarını en aza indirmektedirler.

Hücre içine nüfuz eden KPM’ler düşük molekül ağırlıklı maddeler olup suda çözünebilir özelliktedirler. Embriyo, gonad ve gametlerin dondurulmasında farklı dondurma protokollerinde yaygın olarak kullanılan Gliserol, Etilen Glikol, Propanediyol, Propilen Glikol (PROH) gibi glikol benzeri polioller ve Dimetil Sülfoksit (DMSO) hücre içine girerek suyun yerini almaktadır (Palasz ve Mapletoft 1996, Elder ve Dale 2011). Ancak bu gruptaki KPM’lerin yüksek konsantrasyonlarının hücrede toksik etki gösterip fertilite potansiyelinde azalmaya yol açabilecekleri bildirilmiştir (Best 2015).

2.4.1.2 Hücre içine nüfuz etmeyen KPM’ler

Bu gruptaki KPM’lerden en çok kullanılanlar Glukoz, Sükroz, Rafinoz gibi şeker bileşikleridir. Hücrenin lipit tabakasını stabilize etmek suretiyle viskoziteyi artırır, hücre dışındaki sıvının da donma sıcaklığını düşürürler. Hücre dışında kaldıkları için hızlı bir ozmotik dehitrasyona neden olurlar ve hücre içindeki buz oluşumunu azaltıcı etki gösterirler. Amfipatik bileşiklerden Glisin, Prolin, Trehaloz ise membran lipitleri ve proteinleriyle etkileşime girerek faz geçişlerini kolaylaştırmaktadır. KP işlemi için kullanılan kriyoprotektan kültür ortamı (medium), genellikle hücre içine nüfuz eden bir

KPM’nin yanı sıra bir yada daha fazla hücre içine nüfuz etmeyen KPM’nin bileşiminden oluşmaktadır. Fosfolipid yapıdaki yumurta sarısı, lipoproteinler, kolesterol, albümin ve çeşitli antioksidanlar gibi maddeler de kriyohasara karşı hücre membranlarını koruyucu etkileri nedeniyle dondurma ortamları içine ilave edilmektedir (Avery vd. 1998, Shaw ve Jones 2003, Elder ve Dale 2011).

2.4.2 Sperm kriyoprezervasyonu

2.4.2.1 Kontrollü yavaş dondurma

Yavaş dondurma işlemi, sperm hücrelerinin manuel veya otomatik olarak, 2-4 saatlik süreler içinde sıcaklığın kademeli olarak düşürülmesi suretiyle aşamalı olarak dondurulmasıdır. KP sırasında sperm hücre zarlarında ortaya çıkan değişimlerin zamana yayılması, hücreler üzerindeki ozmotik stresi azaltmaktadır. Sperm hücreleri KPM içeren bir solüsyonda dengelendikten sonra, sıcaklık dakikada 0,3-0,5°C azaltılacak şekilde -40°C’ye kadar soğutulur. Burada -6,5 ile -7°C’lerde kontrollü buz kristalizasyonu (seeding) başlatılır. Hücreler 150°C’ye kadar soğutulduktan sonra -196°C’de sıvı azot saklama tanklarında depolanır.

2.4.2.2 Vitrifikasyon

Vitrifikasyon yönteminde çok hızlı bir şekilde sıvı fazdan katı faza geçiş yapılması amaçlanmaktadır. Sperm hücrelerinde kristalleşme ve buz oluşumunun önüne geçmek için özel taşıyıcılara yüklenmesinin hemen ardından sıvı azot içine alınmaktadır. KP işlemi sırasında KPM kullanılmadan da hızlı dondurma tekniği kullanılarak başarılı sonuçlar alındığı bildirilmiştir (Isachenko vd. 2004b).

2.4.2.3 Azot buharında dondurma

Sperm süspansiyonu soğuk KPM içeren medium ile eşit hacimde yavaşça karıştırılır ve 4°C’de 10 dakika dengelenmeye bırakılır. Dengelenme sonrası sıvı azot buharının

(yaklaşık -80°C) 15-20 cm üstünde 15 dakika bekletilen sperm hücreleri sıvı azota daldırılarak muhafaza edilir (Di Santo 2012, Justice ve Christensen 2013).

2.4.3 Çözdürme prosedürü

Dondurma işlemi kadar önemli bir diğer aşama, hücrelerin ısı ve ozmotik şoka uğramadan biyolojik aktivitelerinin geri kazandırılmasıdır. Hücre hasarına yol açmamak için 37°C sıcaklıkta gerçekleştirilen bu prosedürde buz kristallerinin çözünmesi esnasında sperm hücrelerinin organelleri hasara uğrayabilmektedir. Azot tankından dışarı çıkarılan sperm numuneleri 15 dakika oda sıcaklığında ya da 37°C’lik su banyosunda 10 dakika bekletilmek suretiyle çözülmesi sağlanır. Çözme sonrası sperm hücrelerinden KPM’lerin uzaklaştırılması gerekmektedir (Di Santo 2012).

2.5 Kriyohasar

KP işlemi belirgin olarak sperm hücrelerinin membran bütünlüğü, kromatin kondansasyonu, motilitesi ve morfolojik yapısında olumsuz değişimlere yol açmaktadır.

Fertil ve infertil kişilerin sperm örnekleri karşılaştırıldığında, KP sonrası infertil erkeklerin sperm kromatin kondansasyonunda daha yüksek oranda bozulma olduğu saptanmıştır (Hammadeh vd. 1999).

Şekil 2.7 Sperm hücrelerinde kriyohasar oluşumu (Yeste 2016)

2.5.1 Membran hasarı

Sperm hücrelerinin plazma, mitokondri ve akrozom membranları kriyohasara karşı oldukça hassastır. Sperm membranlarının stabilitesi, sıcaklık değişiklikleri, suyun diffüzyonuyla ortaya çıkan hacimsel değişimler, KPM’ler ve artan tuz konsantrasyonundan kaynaklanan ozmotik farklılıklara bağlı olarak değişmektedir.

Hücre zarı, doymamış yağ asitleri bakımından (% 65-70) zengin olması nedeniyle akışkan bir yapıdadır. Ancak özellikle çözme işlemi sırasında membran lipidleri arasındaki faz geçişleri ve membran permeabilitesinin artması, spermlerde erken (spontan) AR gelişiminin yanı sıra hücre ölümüne de neden olabilmektedir (Medeiros vd. 2002). Sperm hücrelerinin membranındaki çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA, Poly Unsatured Fatty Acids), lipit peroksidasyonu ve ortaya çıkan Reaktif Oksijen Türleri (ROT) nedeniyle hasara uğramaktadır (Koppers vd. 2011). KP sonrası iyon transport ve metabolizmasında iş yapan CATSPER2 (Cations channels of sperm) ve

TEKT2 (Tektin) gibi bazı membran proteinlerinin fonksiyonunda kayıplar olduğu gözlenmiştir (Chen vd. 2017, Alshawa vd. 2019). Dondurma-çözme işleminin spermlerin Efrin R-Aktin, Guanilat Siklaz ve ROT metabolizmasında işlev gören bazı proteinlerin ekspresyonunda değişikliğe yol açmak suretiyle, hücrenin sinyal yolaklarının işleyişinde aksaklığa neden olduğu bildirilmiştir (Yoon vd. 2016).

2.5.2 Mitokondriyal hasar

Mitokondriler çift zar yapısına sahip organeller olarak, KP’nın membran yapıları üzerindeki olumsuz etkilerine karşı oldukça duyarlıdırlar. Dış membran büyük moleküllerin geçişine izin verirken, geniş yüzeye sahip iç membran oksidatif fosforilasyonun gerçekleştiği kısımdır. Oksidatif fosforilasyon sırasında protonların içeriden dışarıya pompalanması, iki zar arasında Mitokondriyal Membran Potansiyeli (ΔΨm) olarak adlandırılan elektrokimyasal bir gradyan oluşmasına neden olur. Bu anlamda ΔΨm, mitokondrilerin enerji potansiyelinin bir göstergesidir. Mitokondrilerde oksidatif fosforilasyon ve glikolizis yoluyla kazanılan ATP, mikrotübüllere iletilerek sperm kuyruk hareketi için gerekli enerjiyi sağlamaktadır. Sperm hücreleriyle yapılan çalışmalar, ΔΨm’de ortaya çıkan düşüşün hücrelerinin metabolik fonksiyonlarıyla birlikte motilite karakteristiğinde de kayıplara yol açtığını göstermektedir (Wang vd.

2003a, Amaral vd. 2013). Bunun yanı sıra sperm hücrelerinin fertilizasyon yeteneğinde etkin bir role sahip olan AR oluşumunda da azalmanın olduğunu bildiren çalışmalar vardır (Gallon vd. 2006, Agnihotri vd. 2016)

Mitokondrilerdeki Elektron Taşıma Zinciri (ETZ), ATP sentezinin yanı sıra ROT üretimini de teşvik eder. Ancak ETZ proteinleri oksidatif-nitrozatif değişimlere karşı duyarlıdır. ETZ’deki hasara bağlı olarak hücredeki ATP üretimi azalırken, ATP benzeri inhibitörler de ATP’nin bağlandığı bölgelere bağlanır ve AKT (Protein Kinaz B) fosforilasyonunu inhibe eder. AKT fosforilasyonundaki azalmanın etkisiyle PI3K (Fosfoinositid-3Kinaz)/AKT sinyal yolağının baskılanması apoptotik kaskadın ortaya çıkmasına neden olabilmektedir (Koppers et al., 2011).

Mitokondri iç ve dış membranları arasındaki boşlukta Kardiyolipinle bağlı olarak bulunan sitokrom c, ROT etkisiyle kardiyolipinin oksidasyonu sonucunda kardiyolipinden ayrılarak sitoplazmaya salınır. Sitokrom c çıkışının Kaspaz 3’ün aktivasyonuna neden olarak mitokondri aracılı apoptotik kaskadın oluşumunu tetiklediği düşünülmektedir (Luo vd. 1998, Boehning vd. 2005).

2.5.3 ROT oluşumuna bağlı hasarlar

Hücrede az miktarda üretilen ROT’un sinyal yolaklarının işlevselliğinde etkili olduğu bilinmekle birlikte, kontrolsüz olarak artan miktarları oksidatif hasara neden olmaktadır.

Sperm hücrelerinde ROT artışıyla ortaya çıkan hasarın nedeni membran yapılardaki çoklu doymamış yağ asitlerinin metilen gruplarına oksidatif atak sonucu gelişen lipit peroksidasyonudur (LPO) (Aitken 1989). Hücrenin oksijen metabolizması sonucunda da ortaya çıkan serbest radikaller, dış yörüngelerinde eşlenmemiş elektron (e⁻) bulunduran kararsız yapıdaki atom veya moleküllerdir. Mitokondriyal membranlardaki ETZ reaksiyonları sırasında ortaya çıkan sızıntılar Süperoksit (O2), Hidrojen Peroksit (H2O2) ve Hidroksil Radikalidir (OH). Süperoksit radikali (O2.-) Oksijenin 1e⁻ alarak indirgenmesiyle oluşmaktadır. 2 tane e⁻ alarak indirgenen O2, H2O2’in oluşmasına neden olurken, üçüncü e⁻‘un eklenmesiyle yüksek derecede reaktiviteye sahip OH radikali meydana gelmektedir. Somatik hücrelerde karmaşık antioksidan savunma sistemleri sayesinde anormal ROT artışının önüne geçilir. Antioksidan savunma sisteminin yetersiz kalması ve süperoksit radikalinin ortamda fazla miktarda bulunması, ROT oluşmasıyla sonuçlanır. Bu sistemin elemanlarından Süperoksit Dismutaz (SOD), O2’yi redükte ederken; Katalaz (CAT), Glutatyon Peroksidaz (GPX) ve Peroksiredoksinler (PRDXs) de H2O2’yi redükte etmektedir. Hücre içi antioksidan savunmada SOD, CAT, GPX ve Ferritin; hücre dışı antioksidan savunmada Transferrin,

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ (sayfa 33-0)