TAZE DOKU VE PARAFİN BLOKTAN İMMUNFLORESAN BOYAMA PROTOKOLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMAS

Gülname Fındık Güvendi*

- Hatice Beşeren** - Başak Büyük***

*Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı, Rize

**Kafkas Üniversitesi, Veterinerlik Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı, Kars ***Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji

Anabilim Dalı, Çanakkale

İmmünfloresan boyama; spesifik bir antijenin görüntülenmesi için kullanılan güçlü bir tekniktir. Boyama spesifik hedefi tespit etmek için floresan etiketli antikorlar ile yapılmaktadır.Floresan bileşikleri ile işaretli antikorlar kullanılarak, şüpheli dokuda bulunan antijen yada bunlara karşı oluşmuş antikor varlığını araştıran immünohistokimyasal bir yöntemdir.Bu maddeler floresan ışık altında renkli yansımalar oluştururlar. Renkli yansıma yapan maddeler floresan bileşikleridir. Floresan bileşikleri ile işaretli antikora ‘konjugat’ adı verilmektedir. Hem bilimsel araştırmalarda hem de rutin hasta takip ve tedavilerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Sistemik lupuseritematozus, büllöz deri hastalıkları, glomerülonefritler başta olmak üzere otoimmun hastalıklarda oluşan antijen antikor komplekslerinin varlığı, lokalizasyonu, birikim şekli ve miktarını belirlemek hastaların tanısı ve takibi, hatta tedaviye yanıtı değerlendirmek açısından oldukça önemlidir. Antijen antikor komplekslerini dokuda tanımak için immunfloresanyöntemler kullanılmaktadır. Temel mantığı floresan ile işaretli antikorun ilgili alana bağlanıp ışıması olan bu yöntem immunfloresan adı verilen farklı bir mikroskopta değerlendirilir.

İmmunfloresan inceleme için dokuların antijenik özelliğinin bozulmamasına özen gösterilir. Bu nedenle dokular standart doku fiksatifi olarak kullanılan %10'luk formaldehit solüsyonu yerine; genellikle fosfat tamponlu solüsyonlar içerisinde gönderilir. Daha sonrasında ise kriyotom ile kesilerek boyama yapılır. Ancak bu yöntemin dışında parafine gömülü dokulardan da immunfloresan boyama yapılabilmektedir. Biz bu yazımızda taze doku ve parafine gömülü dokulardan immunfloresan boyama aşamalarının benzerlik ve farklılıklarını ortaya koymayı amaçladık.

İmmünfloresan inceleme yapılacak dokular uygun miktarda solüsyon içerisinde patoloji laboratuvarına ulaştırılır. Ulaşan doku tipi

ve hastalık ön tanısına göre yapılması planlanan boya sayısı kadar kesit aşağıda belirtilen yöntemler ile hazırlanır. Her gün bu işlemin yapılamaması durumunda biyopsiler tampon solüsyon içerisinde buzdolabında +4 C'de bekletilebilir. Ancak böbrek gibi çabuk otoliz olan dokularda kesitlerin ivedilikle alınması önemlidir.

Patoloji laboratuarlarında boyama işlemi taze doku ve parafin blok olmak üzere iki farklı metod ile yapılmaktadır. Bunları kendi içerisinde gruplandırdığımız zaman;

1. Taze dokudan İmmünfloresan Boyama a. Direkt Boyama

b. İndirekt Boyama

2. Parafin Bloktan İmmünfloresan Boyama - Renal Biyopsilere özel AEC Elite Boyama

İmmünfloresan genel olarak direkt ve indirekt yöntemlerinden oluşmaktadır. Direkt boyama yöntemi; tek adımlı histolojik boyama olup invivo antijenlerin tanımlanması ile yapılmaktadır. İncelenmek istenen antijen ve ona özgül, florokromlu antikorun dokureaksiyona girmesiyle oluşur.Tek bir antikor kullanılarak yapılır.İndirekt boyama yöntemi ise; iki aşamalı histolojik teknikten oluşur. İncelenmek istenen antijen ve bu antijene özgül antikor lama konulur. Antikor- antijen bağlanması gerçekleşir. Ardından homolog florokromlu anti- antikorlar yerleştirilir. Bağlanmayan antikorlar yıkanır ve görüntü değerlendirilir.Yani sekonder antikor kullanılır.

1.Taze dokudan İmmünfloresan Boyama

Taze dokular herhangi bir fiksatif içerisine konulmadan direkt yada tamponlu solüsyon içerisinde laboratuara gönderilmelidir. Tamponlu solüsyon tercihen fosfat tamponlu salin %10 ‘luk olmalıdır. Laboratuvara gelen taze doku ilk olarak, frozen cihazında embedding içerisinde -50 derece altında hızlı bir şekilde dondurulur. Yavaş ve - 50 derecenin üzerindeki dondurma işlemlerinde donma artefaktı oluşarak görüntü kalitesini bozmaktadır. Bunun için hızlı donma işleminde karbondioksit jel kullanılabilir. Poly-L lysine kaplı camlara 5 mikron kalınlığında kesitler alınır ve havada kurutulur.

a. Direkt İmmunofloresan boyama

1. Kesitler oda sıcaklığına getirildikten sonra, 30 dakika boyunca oda ısısında kurutulur,

2. Kesitler soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır (Eğer yoksa soğuk aseton kullanılabilir),5 dakika sonra kesitler çıkartılarak fazla PBS üzerinden alınır,

4. Kesitlerin üzerine 100µl dilue edilmiş antikor damlatılır ve nemli chamber içinde oda sıcaklığında 30dakaika boyunca inkübe edilir, 5. PBS ile yıkanır,

6. Kesitler iki ayrı soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır,

7. Gliserjel Floresan kapaması ile kapatılır.

b.İndirektİmmunofloresan boyama

1. Kesitler oda sıcaklığına getirildikten sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurutulur,

2. Kesitler soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır,

3. Üzerindeki fazla PBS alınır,

4. Kesitlerin üzerine 100µl dilue edilmiş antikor damlatılır ve nemli chamber içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilir, 5. PBS ile yıkanır,

6. Kesitler iki ayrı soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır,

7. Sekonder antikor hazırlanıp dökülerek, nemli chamber içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir,

8. PBS ile yıkanır,

9. Kesitler iki ayrı soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır,

10. Floresan kapaması ile kapatılır.

2.Parafin Bloktan İmmünfloresan Boyama

1. Deparafinisazyon yapılır,

2. Kesitleri 30 dakika ılık (37 derecelik) TRIS (pH 7.6, 0.5 M) buffer içinde bekletilir,

3. Enzim pretreatment (Pronase) 37 derecede ‚de 60dk uygulanır, 4. Kesitleri 30 dakika soğuk TRIS buffer (pH 7.6, 0.5 M) içinde bekletilir,

5. Kesitleri 5 dakika PBS / 0.1% Tween 20 içinde yıkanır,

6. Antikor inkübasyonu oda sıcaklığında nemli chamber içinde 60 dakika yapılır,

7. İki ayrı PBS ile kesitler 5’er dakika yıkanır, 8. Gelvatol-Gallat ile kapatılır.

Renal biyopsiler için ABC Elite Boyama:

1. Deparafinisazyon sonra lamlar PBS içerisine konulur,

2. Su banyosu (37 derecelik) içinde kesitler pronase 0.1% 20-30 dakika uygulanır,

3. 4 derecelik buzdolabında 30 dakika soğuk buffer (TRIS buffer 0.5 M, pH 7.6) ile enzim reaksiyonu durdurulur,

4. H2O2 –methanoltreatment ile 30 dakika bekletilir ( endojenperoksidazblokaji için yapılır),

5. İki ayrı PBS ile kesitler 10’ar dakika yıkanır,

6. Kesitler milkpowder içine koyulur 90 dakikabekletilir, 7. Milkpowder dökülür, yıkama asla yapılmaz!

8. Nemli chamber içinde primer antikor damlatılır ve +4 derece buzdolabında bir gece bekletilir,

9. Sabah gelince iki ayrı TRIS 0.5 M (pH 7.6) /PBS) ile 5 dakika yıkama işlemi yapılır,

10. Sekonderbiotinylated link antikoru damlatılıp 30 dakika bekletilir, 11. Avidin-Biotin-EnzymeComplex (ABC ELITE Standard) ile 30 dakika inkübe edilir,

12. İki ayrı TRIS buffer ile 5’er dakika yıkanır, 13. TRIS buffer (0.05 M, ph7.6) ile 20 dakika yıkanır, 14. DAB chromogen ile 6 dakika inkübasyonyapılır, 15.İki ayrı PBS ile yıkayın 5 dakika yıkanır,

16. Kesitlerosmiumtetroxyd içine koyulur 2 dakika bekletilir (reaksiyon kontrastını artırmak için),

17. İki ayrı PBS ile yıkayın 5 dakika yıkanır, 18. Harris hematoxylin ile 4 dakika boyama yapılır, 19. Distile su ile yıkanır,

20. HCl-alcohol( 0.5% ‘lik ) 5 defa daldır çıkart yapılır, 21. Musluk suyu ile yıkanır 10 dakika,

23. Musluk suyunda 10-15 dakika yıkanır, 24. Üç ayrı alkol ve üç ayrı ksilenden geçirilir, 25. Gelvatol-Gallat ile kapatılır.

Bu yazımızda,immünfloresan inceleme için uygulanan boyama protokollerini açıklayarak hem olguların yönetimine hem de araştırmalara katkıda bulunmaya çalıştık.İmmunfloresan boyamalar formalinile fikse edilmiş dokuda da yapılabilmekle birlikte, donmuş kesitlerde çok daha başarılı sonuçlar elde edildiği için öncelikle bu yöntem uygulanmalıdır.Taze dokudan ve parafine gömülmüş dokudan immünfloresan inceleme için kesit hazırlama protokolünde en belirgin farklılık deparafinizasyon aşamasının oluşu ve işlem süresidir. Kesit kaliteleri ve antijenik özelliğin korunması göz önünde bulundurulduğunda taze dokudan yapılan incelemeler üstün olmakla birlikte parafine gömülü bloklardan kesitler de rutin incelemede zaruri hallerde kullanılabilmektedir. Özellikle hızla otoliz olan böbrek dokusunu incelemek için kesit alınabilecek kriyotom olmadığı durumlarda rutin doku takibi ve parafin blok oluşumu sağlandıktan sonra immünfloresan boyama için böbreğe özel protokol ile değerlendirme yapılabilmesi, tekrar biyopsi alınması gerekliliğini azaltarak, tanı ve tedavi yönetiminde avantaj sağlamaktadır.

KAYNAKLAR:

1. Patoloji dernekleri federasyonu nefropatoloji çalışma grubu, Medikal Böbrek Biyopsi Klavuzu, 2010.

2. Amagai M, Komai A, Hashimoto T et al. (1999) Usefulness of enzyme link ed immunosorbent assay using re combinant desmogleins 1 and 3 forsero diagnosis of pemphigus. Br J Dermatol 140:351–7

3. Lichtman JW, Conchello JA (2005) Fluorescencemicroscopy. NatMeth 2:910–9.

4. VaughnJones SA, Palmer I, Bhogal BS et al. (1995) Theuse of Michel’s transport medium for immunofluorescence and immunoelectron microscopy in autoimmune bullous diseases. J Cutan Pathol 22:365–70

5. Anderson, S. G. &Addison, I. E. (1970) Progressto wards immunofluorescence standards. In: Holborow, E. J., ed., Standardization in inumunofluorescence, Oxford, Blackwell Scientific Publications, part 1, p. 1

6. Brighton, W. D. &Hayhoe, J. (1970) Comparison of theactivity of commercial conjugates in different antigen antibody systems. In: Holborow, E. J., ed., Standardization in

immunofluorescence, Oxford, Blackwell Scientific Publications, part 2, p. 205

7. Coons AH, Creech HJ, Jones RN, Berliner E. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. J Immunol. 1942;45:159-70. 8. Van Hale HM, Gibson LE, Schroeter AL. Henoch Schonle in

vasculitis: direct immunofluorescence study of uninvolved skin. J Am Acad Dermatol. 1986;15(4 Pt 1):665-70.

9. Kulthanan K, Jiamton S, Varothai S, Pinkaew S, Sutthipinittharm P. Direct immunofluorescence study in patients withlichen planus. Int J Dermatol. 2007;46:1237-41. 10. Kajimura J, Ito R, Manley NR, Hale LP. Optimization of

single and dual color immunofluorescence protocols for formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. J Histochem Cytochem 2016; 64: 112-124.

HASTALIK ÖZYÖNETİMİ: FENOMENOLOJİK ARAŞTIRMA