Diğerleri ile bir olmak

Cette étude montre la capacité de nouveaux analogues de céramide à induire la mort de cellules leucémiques Jurkat, dépendante et indépendante de l’activité catalytique des caspases. Ces analogues induisent l’activation des caspases qui conduit à l’apoptose des cellules Jurkat, caractérisée par une fragmentation de l’ADN, évaluée par le pourcentage de cellules hypodiploïdes (Figure 31). Il est à noter que l’hypodiploïdie induite par FasL ou l’AD2646 est inhibée en présence de z-VAD, suggérant un rôle des caspases dans la fragmentation de l’ADN. A l’inverse, le z-VAD ne prévient pas totalement l’hypodiploïdie en présence de l’AD2687 (Figure 31). L’apoptose induite par les analogues semble indépendante des caspases initiatrices-8 et-10 et de la protéine FADD. En effet, des cellules Jurkat déficientes en caspases-8 et -10 ou déficientes pour FADD, qui sont totalement résistantes à la mort induite par FasL, sont aussi sensibles aux analogues que les cellules parentales A3 (Figure 32). Ceci suggère un effet cytotoxique des analogues indépendant de la signalisation des récepteurs de mort.

Figure 31: Les analogues de céramide AD2646 et AD2687 induisent une fragmentation de l’ADN dans les cellules Jurkat. Les cellules Jurkat parentales A3 ont été incubées dans du milieu RPMI sans SVF en présence d’AD2646 (7µM), d’AD2687 (5µM) ou de FasL (10 ng/ml) en présence ou non de z-VAD (40 µM) pendant 16 heures. Le contenu en ADN a été évalué par marquage des cellules à l’Iodure de Propidium (P.I.). Les pourcentages (moyenne ± ESM, n=3) de cellules hypodiploïdes sont indiqués. Le pourcentage d’hypodiploïdie dans les cellules non traitées est de 24±6 et 12±2 respectivement en absence ou en présence de z-

A B

Figure 32 : Les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 et -10 ou pour la protéine FADD sont sensibles aux analogues de céramide. Les cellules Jurkat parentales A3, déficientes pour la protéine FADD (I2-1) ou déficientes pour les caspase-8 et -10 (I9-2e) ont été incubées dans du milieu RPMI sans SVF en présence d’AD2646 (7µM), d’AD2687 (5µM) ou de FasL (10 ng/ml) pendant 16 heures. Les cellules ont été marquées à l’Annexine-V-FITC et à l’Iodure de propidium et analysées par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire a été

déterminée par le pourcentage de cellules doubles négatives pour l’Annexine-V et l’Iodure de propidium. Les résultats sont les moyennes ± ESM de trois expériences indépendantes.

Un inhibiteur des caspases, le z-VAD, ne bloque pas totalement la toxicité en réponse à l’AD2646 et l’AD2687 mais induit un changement dans la morphologie des cellules qui présentent des caractéristiques des morts « caspase-indépendante » de type apoptose-like ou nécrose-like. Les analyses biochimiques et morphologiques montrent l’induction d’une mort indépendante de l’activité caspase comparable à celle observée en réponse à la stimulation de Fas. En accord avec ces résultats, des analogues de céramide à courtes chaînes ont déjà été décrits comme pouvant induire une mort cellulaire non apoptotique (Engedal and Saatcioglu, 2001; Kim et al., 2005).

Par analogie de structure avec le céramide, ces analogues agissent en tant qu’inhibiteurs compétitifs des enzymes de conversion du céramide, telles que la sphingomyéline synthase, la glucosylcéramide synthase et induisent une accumulation intracellulaire de céramide. Les effets de ces analogues pourraient être indirects et être médiés par le céramide endogène qui s’accumule dans les cellules, dès trois heures d’incubation. Cependant, nous ne pouvons pas exclure un effet direct des analogues de céramide. En effet, la présence du groupement hydroxyl allylique en C3 pourrait médier l’effet des analogues sur la production de ROS au niveau de la mitochondrie, comme cela a

déjà été décrit (Radin, 2001). L’activation de la caspase-9 en réponse à l’AD2646 et l’AD2687 suggère une implication de la voie mitochondriale dans leurs effets cytotoxiques. De plus, le céramide généré, ou les analogues eux même, semblent agir en amont de la mitochondrie dans la signalisation cytotoxique des analogues. En effet, la surexpression de Bcl-xL inhibe la toxicité induite par les analogues mais ne prévient pas l’accumulation intracellulaire de céramide. En accord avec ces observations, un analogue cationique de céramide à longue chaîne, le LCL-30, induit l’apoptose de cellules du cancer du colon, en ciblant la mitochondrie, en provoquant une diminution du potentiel mitochondrial et un relargage du cytochrome c (Dindo et al., 2006). En outre, même si Bcl-xL, qui est principalement localisé dans la membrane externe mitochondriale, inhibe la perméabilisation des membranes mitochondriales en inactivant les membres pro-apoptotiques de la famille de Bcl-2, il semble que ces effets ne soient pas restreints à la mitochondrie. Comme décrit pour son homologue Bcl-2, Bcl-xL pourrait agir sur le réticulum endoplasmique (Ferri and Kroemer, 2001). En effet, sa surexpression dans des cellules myoblastiques murines inhibe l’activation de la caspase-12 et l’apoptose en réponse au stress du RE (Morishima et al., 2004). De plus, l’expression d’un mutant de Bcl-xL ciblant le RE, inhibe la toxicité induite par la thapsigargine, un inducteur de stress du RE (Fiebig et al., 2006). Aussi, nous ne pouvant pas exclure un effet des analogues de céramide sur d’autres organelles différentes de la mitochondrie comme le RE, le Golgi ou le lysosome.

L’utilisation de ces analogues de céramide en thérapie anticancéreuse pourrait être envisagée. Une surexpression de la céramidase acide est observée dans 70 % des cellules tumorales de la tête et du cou, en comparaison avec des tissus sains. L’AD2646 ou LCL 204 qui inhibe aussi l’activité de la céramidase acide, sensibilise les cellules SCC-1, du cancer de la tête et du cou, à l’apoptose induite par un agoniste de Fas, in vitro et in vivo sur un modèle de xénogreffe tumorale chez la souris (Elojeimy et al., 2007; Norris et al., 2006). Une approche thérapeutique combinant FasL et l’AD2646 semble être prometteuse pour le traitement des tumeurs de la tête et du cou. Toutefois, les analogues AD2646 et AD2687 n’ont aucun effet sur l’apoptose des cellules Jurkat induite par FasL, suggérant que les effets de ces molécules dépendent du type cellulaire (résultats non montrés). Il serait donc intéressant de tester cette combinaison de molécules sur d’autres types de cellules

augmentent le taux intracellulaire de céramide, ils pourraient sensibiliser ces cellules aux traitements chimiothérapeutiques classiques. Ainsi, un effet cytotoxique synergique de l’analogue de céramide LCL-30 avec la doxorubicine a été montré dans des cellules du cancer du colon (Dindo et al., 2006).

La mort cellulaire induite par l’activation du récepteur Fas (CD95), consécutive à la liaison de Fas Ligand (CD95-L), joue un rôle majeur dans la régulation de l’homéostasie lymphocytaire. L’objectif de notre travail a été de clarifier le rôle des caspases et du céramide dans la signalisation cytotoxique du récepteur Fas.

I- Les caspases-8 et -10 sont indispensables à la signalisation apoptotique et nécrotique