3. BÖLÜM ANLAMLI İŞ
4.2. Araştırmanın Önemi
100000 cellules sont cytocentrifugées sur lames avant d’être fixées pendant 15 minutes. Pour le cytochrome c et EndoG, les cellules sont fixées par la paraformaldéhyde (4%), lavées en PBS et perméabilisées pendant 15 minutes en présence de Triton X-100 (0.1%). Pour AIF, les cellules sont fixées en présence de méthanol (100%) à -20°C puis lavées en PBS et incubées pendant 15 minutes avec de la BSA (3%). Après lavage, les lames
secondaire anti-IgG de souris couplé au FITC (4µg/ml, Molecular Probes). Les lames sont ensuite analysées par microscopie confocale
.
VIII- Analyse des sphingolipides
VIII-1 Extraction lipidique
Les culots cellulaires sont repris par 200 µl d’eau distillée et homogénéisés par sonication. 30 µl sont conservés pour le dosage protéique par la méthode de Bradford. 850 µl de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) sont ajoutés au 170 µl d’extraits restant. Après mélange et centrifugation à 2500 rpm pendant 15 minutes, la phase inférieure est récupérée et lavée avec une phase supérieure synthétique constituée de chloroforme/méthanol/eau (3 :48 :47, v/v/v), puis évaporée sous azote.
VIII-2 Dosage du céramide (méthode de la DAG kinase)
Le principe de la méthode repose sur la capacité de la DAG kinase à phosphoryler le DAG et le céramide. Les extraits lipidiques sont solubilisés par 40 µl de solution détergente (di-oléoyl-phosphatidyl-glycérol/octyl-β-glucoside), vortexés, soniqués et incubés en présence de DAG Kinase d’E.coli (isolée à partir de bactéries fournies par les Drs. D. Perry et Y.A. Hannun (Charleston, SC)) et d’ATPγP32 à température ambiante pendant 30 minutes. La réaction est stoppée par l’addition de 250 µl d’eau contenant 1% d’acide perchlorique, 400 µl de chloroforme et 400 µl de méthanol. Une centrifugation à 2500 rpm pendant 10 minutes permet d’isoler la phase inférieure contenant le céramide-1-phosphate et l’acide phosphatidique. La phase inférieure est ensuite évaporée sous azote puis solubilisée par 60 µl de chloroforme/méthanol (2:1, v/v). 20 µl de cet extrait sont séparés sur une plaque de silice dans un système de migration contenant chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/eau (50:20:15:10:5, v/v/v/v/v). Les bandes correspondant au céramide-1-phosphate et à l’acide phosphatidique sont révélées par autoradiographie, grattées et comptées par scintillation.
VIII-3 Analyse du profil sphingolipidique
3 millions de cellules Jurkat sont incubées en présence de [3H]-sphingosine (0,33 µCi/ml) (PerkinElmer), un précurseur de la synthèse des sphingolipides, pendant 48 heures ou 72 heures pour marquer les sphingolipides à l’équilibre. Après 2 heures de « chasse » (incubation des cellules en présence d’un milieu non radioactif), les cellules sont incubées en présence de FasL aux concentrations et pendant les temps indiqués avant d’être récoltées et centrifugées à 1500 rpm. Les lipides sont extraits à partir des culots cellulaires (cf chapitre VIII-1). Les résidus lipidiques sont repris par 20 µl de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) puis séparés par chromatographie sur couche mince dans un système de migration contenant chloroforme/méthanol/eau (100:42:6, v/v/v). La distribution des sphingolipides radiomarqués sur la plaque de chromatographie est analysée grâce à un radiochromatoscanner (Bertold). Des lipides standards permettent d’identifier les différents sphingolipides qui sont ensuite grattés puis quantifiés par scintillation.
Dosage de la sphingomyéline (SM) et des PC(phosphatidylcholine) :
Alternativement, 3 millions de cellules sont incubées en présence de [3H]-choline (1µCi/ml) (PerkinElmer) pendant 48 à 72 heures pour permettre le marquage de la SM et des PC à l’équilibre. La SM et les PC radiomarqués sont ensuite séparés par méthanolyse alcaline. Ainsi, après extraction lipidique (cf chapitre VIII-1), les résidus lipidiques sont solubilisés dans 84µl de chloroforme et 84µl de soude méthanolique 0,5 M. Le mélange est incubé à 37°C pendant 2 heures sous agitation et la réaction de méthanolyse est arrêtée par l’ajout de 84µl d’acide chlorhydrique méthanolique (HCl 0,5 M), 144 µl d’eau, 284 µl de chloroforme et 167 µl de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v). Après mélange et centrifugation à 2500 rpm pendant 10 minutes, la phase supérieure contenant la glycérophosphocholine marquée est comptée par scintillation. La phase inférieure contenant la SM radioactive est lavée deux fois par une phase supérieure synthétique constituée de chloroforme/méthanol/eau (3 :48 :47, v/v/v) avant d’être évaporée sous azote et comptée par scintillation liquide.
non de FasL pendant les temps indiqués avant d’être récoltées et centrifugées à 1200 rpm à 4°C. Les culots cellulaires sont immédiatement congelés à -20°C. Les PC et la SM radiomarqués sont quantifiés après la réaction de méthanolyse alcaline comme décrit précédemment (cf chapitre VIII-3).
VIII-5 Dosage des activités enzymatiques de la SMS et de la GCS
In situ : Les activités de la SMS et GCS sont évaluées en culture par la quantification
de la conversion de C6-NBD-Céramide en C6-NBD-SM et C6-NBD-GlcCer. 1 million de cellules Jurkat sont incubées dans 1ml de RPMI 10 % SVF et 2,5 µM de C6-NBD-Céramide (Sigma) pendant 2 heures à 37°C. L’ajout de 5 ml de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) permet d’arrêter la réaction. Les lipides sont extraits par une centrifugation à 2500 rpm pendant 10 minutes permettant la séparation de la phase inférieure lipidique qui est ensuite évaporée sous azote. Les lipides sont solubilisés par 20 µl de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) et séparés par chromatographie sur couche mince dans un système de migration contenant chloroforme/méthanol/30%Ammoniac (70 :30 :5, v/v/v). Les bandes correspondant au C6-NBD-Ceramide, au C6-NBD-SM et au C6-NBD-GlcCer sont révélées sous UV, solubilisées dans 1 ml de chloroforme/méthanol (1 :1, v/v) puis quantifiées par spectrofluorimétrie (λexcitation = 470 nm ; λémission = 530 nm).
In vitro : 100 µg d’extraits protéiques de cellules traitées par FasL sont repris dans
250 µl de tampon de réaction contenant MgCl2 (5 mM), MnCl2 (5 mM), EDTA (1 mM),
Hépès (50 mM). Le mélange est incubé en présence de 250 µl de substrat contenant 400 µM de PC (Sigma), 5µM de C6-NBD-Ceramide et 400 µM de UDP-Glucose pendant 30 minutes à 37°C. La réaction est arrêtée avec 2,5 ml de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v). Puis le mélange réactionnel est centrifugé 10 minutes à 2500 rpm. La phase inférieure est évaporée sous azote. Les lipides sont séparés par chromatographie sur couche mince comme décrit pour le dosage in vitro.
IX- Analyse de l’expression des ARNm
L’ARN total est isolé à partir de cellules Jurkat grâce au kit QIAGEN RNeasy kit (Qiagen) et soumis à une réverse transcription en utilisant des oligo(dT)15 (Promega) et Superscript II (Invitrogen). Les ADNc obtenus sont analysés par PCR (Polymerase Chain Reaction) en temps réel en utilisant des primers spécifiques de la SMS1, SMS2 et GAPDH
(Qiagen) et un Master mix Power SYBR Green PCR (Applied biosystem). L’amplification est effectuée grâce à un Taqman 7900 (Applied biosystem).
Alternativement, les ADNc sont amplifiés par 30 cycles de PCR en utilisant GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega) et des primers specifiques pour la SMS1 (primer sens : CATTTCAACTGTTCTCCGAAGC; primer antisens : CCATAGTGTGATACCACCAG), la
SMS2 (primer sens :TTAATCTGCTGGCTGCTGAG; primer antisens :
ACCAATCTTCTGAACCCGTG) et GAPDH (primer sens :
AACATCATCCCTGCCTCTACTG ; primer antisens :
TTGACAAAGTGGTCGTTGAGG). Des ADNc isolés à partir de fibroblastes de peau humaine et des vecteurs codant pour les ADNc de la SMS1 et SMS2 sont utilisés comme contrôles positifs. Les amplifications sont réalisées dans un thermal Cycler (Biorad) et les produits d’amplifications sont analysés par migration sur un gel d’agarose 0,8 % et une coloration au bromure d’éthidium.
X- Anticorps et autres réactifs
La concentration ou la dilution utilisée est indiquée. z-VAD(OMe)-fmk (40µM) et z- AE(OMe)-VD(OMe)-fmk (10 µM) (Bachem), D609 (50 µg/ml) (Sigma).
Anticorps : Anti-FADD (clone A66-2, 0,5 µg/ml, BD Biosciences), anti-Caspase-8 (clone B9-2, 0,5 µg/ml, BD Biosciences), anti-Bcl-xL (clone 2H12, 1µg/ml, BD Biosciences), anti- Caspase-10 (clone 4C1, 1µg/ml, MBL), anti-Caspase-3 polyclonal (10µg/ml, DAKO), anti- Caspase-7 polyclonal (1/1000, Cell Signaling Technology), anti-PARP polyclonal (1/1000, Cell Signaling Technology), anti-PARP clivé (clone 19F4, 1/1000, Cell Signaling Technology), anti-Bid polyclonal (1/1000, Cell Signaling Technology), anti-cytochrome c pour Western-blot (clone 7H8.2C12, 1µg/ml, BD Biosciences), anti-Rip monoclonal (1/1000, BD Biosciences), anti-CCTα (clone 7H8, 1/1000, Abnova), anti-β-Actine (clone AC-15, 5µg/ml, Sigma).
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