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Nos résultats mettent en évidence une inhibition de l’activité de la SMS qui pourrait être impliquée dans la génération de céramide et dans l’induction de la mort cellulaire en réponse à FasL (Figure 33, 3). L’inhibition de la SMS dépend principalement de l’activité des caspases. Ceci est en accord avec les travaux du groupe d’Okazaki qui montrent une inhibition de l’activité de la SMS nucléaire dépendante de la caspase-3 en réponse à un agoniste de Fas (Watanabe et al., 2004). Toutefois, nos résultats suggèrent que l’inhibition de la synthèse de SM est un évènement précoce dans la signalisation de Fas, intervenant en amont des évènements mitochondriaux. Les mécanismes d’inhibition de l’activité de la SMS reste à préciser. Il serait intéressant de déterminer si la SMS est un substrat direct des caspases initiatrices. Pour cela, nous envisageons d’évaluer la capacité des caspases recombinantes-2, -8, -9 et -10 à cliver la SMS1 in vitro. L’utilisation de siRNA dirigés contre ces différentes caspases pourrait permettre de définir leur éventuelle implication dans l’inhibition de la SMS in situ. De plus, la surexpression de la SMS1 mutée (D327E) sur le site potentiel de clivage par les caspases (LAHD↓H) pourrait permettre de valider ce site in

situ et d’évaluer si l’inhibition de la SMS dépend d’un clivage direct de cette enzyme. Dans cette éventualité, l’effet de la surexpression de la SMS1 mutée permettrait de déterminer si l’inhibition de la SMS est un évènement causal dans la production de céramide et la toxicité en réponse à FasL. En outre, d’autres mécanismes pourraient participer à l’inhibition de la SMS, comme : (i) une altération de la structure du Golgi par les caspases ; (ii) une inhibition indirecte due à un défaut de substrat pour l’enzyme, soit le céramide, soit les PC.

Dans la signalisation indépendante de l’activité catalytique des caspases, il semble que RIP soit impliquée dans l’inhibition de l’activité de la SMS et la génération de céramide. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de l’inhibition de la SMS restent à préciser. Une production de ROS a été décrite dans la signalisation du TNFR-1 indépendante de l’activité catalytique des caspases et dépendante de RIP (Lin et al., 2004b; Thon et al., 2005). L’étude de l’effet d’antioxydants sur l’inhibition de l’activité de la SMS et sur la génération de céramide en réponse à FasL, en présence de z-VAD, pourrait permettre de

qu’aucune élévation du taux intracellulaire de céramide n’est détecté dans des cellules déficientes en caspase-8 et -10 en réponse à FasL. Ainsi, dans la signalisation apoptotique, l’activité des caspases-8 et -10 pourrait participer à l’inhibition de l’activité de la SMS qui favoriserait l’augmentation du taux intracellulaire de céramide. Dans la signalisation indépendante de l’activité catalytique des caspases, l’activation de RIP au sein du complexe formé par RIP, FADD, la caspase-8 et la caspase-10 pourrait participer à l’inhibition de la SMS, potentiellement responsable de l’augmentation intracellulaire du taux de céramide. De plus, nos résultats indiquent que le céramide généré pourrait être un élément de la signalisation apoptotique et nécrotique. En effet, des analogues de céramide induisent une mort apoptotique et une mort indépendante de l’activité catalytique des caspases (Figure 33, 4). Ces analogues interfèrent avec le métabolisme sphingolipidique endogène et inhibent l’activité de la SMS, de la GCS et de la céramidase acide. Ainsi, en prévenant la conversion de céramide en SM, en glucosylcéramide et en sphingosine, les analogues induisent une augmentation du taux intracellulaire de céramide qui pourrait participer à la mort cellulaire.

Finalement, interférer avec le métabolisme sphingolipidique et notamment avec l’activité de la SMS, dans le but d’augmenter le taux intracellulaire de céramide, pourrait permettre de sensibiliser les cellules résistantes à la mort. En effet, nos résultats indiquent que le D609, qui inhibe l’activité de la SMS, permet de sensibiliser les cellules déficientes en caspase-8 à FasL. De plus, le D609 permet de restaurer la sensibilité de PBL à la mort indépendante de l’activité catalytique des caspases induite par FasL. Ainsi, l’utilisation de dérivés du D609, ou des analogues de céramide, pourrait être envisagée pour sensibiliser les lymphocytes de patients atteints d’ALPS et les cellules malignes à FasL ou aux traitements anticancéreux.

FADD

RIP

Casp-3/7

Mort non

apoptotique

Apoptose

Casp-8/10

Fas/CD95

Voie dépendante

de l’activité

catalytique des

caspases

Voie indépendante

de l’activité

catalytique des

caspases

SMS1

Bid

↑Céramide

ROS

Casp8-/10

FADD

Z-VAD

AD2646

AD2687

1

4

3

2

FasL/CD95L

Figure 33 : Voie dépendante et indépendante de l’activité catalytique des caspases dans la signalisation de Fas. 1, L’activation du récepteur Fas par la liaison de FasL permet la formation du DISC constitué de la protéine FADD et des caspases-8 et -10. L’activation de ces caspases initiatrices au niveau du DISC permet soit l’activation directe des caspases effectrices -3 et -7, soit l’activation de la voie mitochondriale par le clivage de la protéine Bid. Les deux voies conduisent à l’apoptose. 2, La formation du complexe constitué de la protéine FADD, des caspases-8 et -10 et de RIP pourrait activer une signalisation de mort indépendante de l’activité catalytique des caspases et impliquant la production de ROS. 3, L’activation des deux types de signalisation conduit à l’inhibition de l’activité de la SMS1, localisée au niveau du trans Golgi. Cette inhibition de la synthèse de SM favorise l’augmentation du taux intracellulaire de céramide. 4, Le céramide accumulé en réponse à la stimulation de Fas ou à des analogues de céramide tels que l’AD2646 et l’AD2687, pourrait participer activement à l’induction de l’apoptose et de la mort non apoptotique.