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complexo enzimático produzido pela cepa selvagem Mucor racemosus Fresenius

Visando verificar a contribuição nutricional do soro de queijo na fermentação, foram utilizadas diferentes soluções para extração dos EEBs das FES produzido pela cepa selvagem M. racemosus Fresenius. Na Figura 4.9 são apresentados os resultados obtidos para a produção de etanol em função do tempo de fermentação alcoólica utilizando diferentes soluções para extração, ST, SW, SWHA e SWHE, (Tabela 3.4). Nesta Figura é apresentado também a produção de etanol quando utilizou-se a solução SW para extrair a enzima e não houve a adição de extrato de levedura na FA.

20 40 60 10 30 50 Tempo (h) 4 8 12 16 20 6 10 14 18 22 Conce nt raç ão de et anol (g/ L)

Figura 4.9 – Concentração de etanol em função do tempo de fermentação alcoólica, utilizando para extração das enzimas presentes na FES, as seguintes soluções: Tween 80 a 1% em água deionizada - ST ( ); Tween 80 a 1% em soro de queijo com 36 ± 1,5 g/L de lactose (SW) sem utilizar extrato de levedura na fermentação alcoólica ( ); Tween 80 a 1% em soro de queijo com 36 ± 1,5 g/L de lactose (SW) utilizando extrato de levedura

na fermentação alcoólica ( ); Tween 80 a 1% em soro de queijo hidrolisado com H2SO4 1% em autoclave a 0,5 atm por 20 min – SWHA ( ); Tween 80 a 1% em soro

hidrolisado com -galactosidase (Aspergillus oryzae) 3g/L ( ) – SWHE.

A comparação entre os experimentos realizados em condições distintas de utilização de soro de queijo: sem soro e ensaios com soro não hidrolisado mostra que o uso de soro de queijo na obtenção de EEB reduz a necessidade de complementação do meio de FA com extrato de levedura. Portanto, quando se utilizou soro de queijo na extração do extrato enzimático, não foi adicionado extrato de levedura na fermentação alcoólica.

Observa-se também que o EEB não tem a capacidade de hidrolisar a lactose do soro, pois as concentrações de etanol foram próximas nas três situações com diferentes tempos de ensaio. Com a finalidade de verificar a contribuição da lactose presente no soro de leite na fermentação alcoólica foi feito a lavagem do meio FES com soro de leite hidrolisado química ou enzimaticamente. Assim, optou-se por hidrolisar o soro de leite, com ácido sulfúrico 1% e com essa solução fazer a lavagem do meio sólido obtido da FES para a extração da enzima. A comparação entre as condições de uso de soro sem

hidrólise e ensaios com hidrólise ácida e enzimática mostram que embora a hidrólise ácida seja capaz de aumentar a concentração de etanol de 8,6 para 16,6 g/L (aumento de 1,93 vezes), a hidrólise enzimática foi mais eficiente e aumentou a concentração de etanol para 21,3 g/L (aumento de 2,47 vezes). Este fato pode estar relacionado à produção de componentes tóxicos ou inibitórios resultantes da hidrólise ácida para a atuação de levedura na fermentação alcoólica, já que a hidrólise química, além de não ser realizada em condições amenas, não é específica como a hidrólise enzimática. Os valores obtidos no ensaio com soro hidrolisado foram superiores aos obtidos por Rocha et al. (2013) que obtiveram 11,9 g/L para produção de etanol de biomassa composta de soro de queijo, celulose e farelo de arroz submetido a explosão de vapor com amônia (AFEX).

Pode-se observar na Figura 4.9 que a concentração de etanol foi crescente ao longo do tempo de fermentação até 48 horas, porém o crescimento foi bem mais acentuado até 24 horas para todas as situações analisadas. A média do aumento da concentração de etanol de 24 para 48 horas foi de 6%, portanto adotou-se para os demais experimentos como referência o tempo de 24 horas para a fermentação alcoólica. Os resultados obtidos foram superiores ao encontrado por Lever, Ho e Cord- Ruwisch (2010) para ensaios batelada (5 g/L) e inferiores ao encontrado pelo mesmo autor em ensaios de batelada alimentada (21 g/L). Para 60 horas de fermentação observou-se uma queda na concentração de etanol. Este comportamento pode estar relacionado à perda de álcool etílico devido ao longo tempo de fermentação.

A quantidade de etanol produzida de 21,2 g/L utilizando o soro hidrolisado enzimaticamente (em 24 horas de FA), para as condições de processo utilizado, deve estar próximo do máximo a ser obtido com a quantidade de substrato utilizada. Assim, optou-se por aumentar a quantidade de substrato fazendo os seguintes experimentos para a fermentação alcoólica. Para produção de etanol foi utilizado 100 mL do extrato enzimático bruto produzido pela FES com diferentes quantidades de substrato para produção de etanol: o primeiro consistia de 23 g de bagaço de cana tratado com baixa severidade + 5 g de BNT (82,1% de BBS e 17,9% de bagaço bruto) e demais sais da FA, que passou a ser denominado de MFA7; o segundo tinha a seguinte composição: 26 g de bagaço de cana tratado com baixa severidade + 4 g de BNT (86,7% de BBS e 13,3% de BNT) e demais sais da FA, este meio passou a ser denominado de MFA8. Para extração das enzimas presentes no meio de FES foi utilizado Tween 80 a 1% em

água deionizada. Para 24 horas de FA obteve-se 8,0 ± 0,3 g/L e 7,5 ± 0,2 g/L de etanol, quando utilizou o meio MFA7 e MFA8, respectivamente. Nota-se que o aumento na quantidade de substrato não proporcionou melhora na produção de etanol. Este fato deve estar relacionado a problemas de transferência de massa no meio fermentativo, porque, observou-se visualmente, que com esta quantidade de substrato (28 e 30 g para 100 mL de meio) a fermentação alcoólica encontrava-se no limite para ser uma fermentação submersa. Assim, optou-se por continuar os próximos experimentos com a quantidade máxima de substrato na fermentação alcoólica de 25 g de sólidos (MFA3) para 100 mL de complexo enzimático. O interessante é que a produção de etanol aumentou em cada ensaio que foi sendo realizado, apontando que as alterações no processo que estavam sendo realizadas encontravam no sentido positivo do aumento na quantidade de etanol produzida.

Assim, foram realizados experimentos de FA sucessivas (retirando o substrato sólido já fermentado e adicionando nova carga de sólido) e optou-se por continuar avaliando a utilização de soro de queijo, devido à contribuição nutricional de sais, nutrientes e açúcares a FA, a grande quantidade gerada desse subproduto na região de desenvolvimento do presente trabalho, bem como a necessidade de estudos de FA conjugadas deste subproduto com outras biomassas, como a celulose.