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Atualmente, devido aos grandes avanços tecnológicos observados no campo da genômica, principalmente com introdução de novas tecnologias, baseadas em sequenciamentos de nova geração, do inglês – “Next Generation Sequence”, houve um crescente aumento, na geração dados em diferentes áreas como: médica, veterinária e biotecnológica. No campo da

microbiologia, o elevado número de genomas bacterianos sequenciados tem gerado informações importantes a respeito das bases moleculares de virulência e patogenicidade de vários patógenos, bem como o conhecimento sobre aspectos fisiológicos básicos que favorecem o processo de adaptação bacteriano. Além disso, informações a respeito de alvos para o desenvolvimento de vacinas e diagnósticos também podem ser obtidos com dados provenientes do sequenciamento de genomas.

Entretanto, os resultados obtidos a partir do sequenciamento de genoma revelam poucas informações de como as proteínas de um organismo operam, individualmente ou em conjunto, para exercerem suas funções. Assim, em complemento a genômica estrutural, a genômica funcional, através de estudos transcriptomicos e proteômicos, busca elucidar a função que cada gene exerce no organismo, além da interação destes genes dentro de uma rede biológica (Gstaiger & Aebersold, 2009; Altelaar; Munoz; Heck, 2013).

O estudo proteômico busca avaliar a expressão global proteica de uma célula em uma determinada condição. Neste contexto, uma análise proteômica promove informações importantes a respeito da síntese proteica, análise quantitativas e qualitativas de produtos proteicos, modificações pós-traducionais, interação proteína-proteína e localização subcelular (Pandey & Mann, 2000; Gstaiger & Aebersold, 2009).

A proteômica permite a análise em larga escala de proteínas presentes em misturas complexas. Este estudo é dividido basicamente em duas etapas: (i) separação do extrato proteico, através das características intrínseca de cada proteína, esta separação poderá ser feita utilizando sistemas dependente de gel ou sistemas livre de gel, (ii) identificação das proteínas, através do sequenciamento dos peptídeos pré-digeridos enzimaticamente, geralmente feito por

espectrometria de massa, do inglês – “mass spectrometry” (MS) (Van Oudenhove & Devreese, 2013).

Espectrometria de massa é uma técnica utilizada para medir a relação entre massa/carga (m/z) de íons na fase gasosa. Nas últimas décadas, tornou-se um método valioso para estudos proteômicos, devido à capacidade de identificar e caracterizar proteínas intactas e desconhecidas, determinar modificações pós-traducionais e possibilitar a quantificação de proteínas (Xan; Aslanian; Yates, 2008; Pan et al., 2009).

Contudo, o sucesso de um estudo proteômico é devido ao desenvolvimento de ferramentas de bioinformática, onde vários softwares são utilizados para auxiliar na análise dos dados proteômicos. Principalmente na correlação com dados genômicos, busca pela ontologia genica, análise de dados quantitativos, além de permitir a análise no campo da biologia de sistemas que permite a criação de redes de interação proteína-proteína (Altelaar; Munoz; Heck, 2013).

Análise proteômica baseada em sistemas dependente de gel

Métodos baseado em géis, como eletroforese em gel de poliacrilamida, são usados rotineiramente na análise proteômica para separação de moléculas ou peptídeos. Eletroforese bidimensional (2-DE) é uma técnica proteômica clássica, aplicada para a resolução de proteínas presentes em misturas complexas. A 2-DE, é utilizada para separar proteínas em duas dimensões: (i) durante o processo de focalização isoelétrica, do inglês – “isoelectric focalization” (IEF), as proteínas são separadas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI), e (ii) posteriormente utilizando um gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), as proteínas são separadas de acordo com seu peso molecular (Görg et al., 2004). Assim, a combinação da 2-DE com a técnica de espectrometria de

massas do tipo MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) possibilitou vários avanços no campo da proteômica baseada em sistema dependente de gel (Görg et al., 2004).

A 2-DE permite a geração de mapas proteicos, onde spots proteicos são visualizados diferencialmente expressos, bem como a presença de modificações pós-tradicionais e isoformas de proteínas. Entretanto, uma das desvantagens desta técnica proteômica clássica é a variação de gel para gel. Assim para suprir esta deficiência observada na 2-DE, foi desenvolvida a eletroforese bidimensional de fluorescência diferencial, do inglês – “two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis” (2D-DIGE) (Unlu et al., 1997).

Esta técnica, permite a separação simultânea de duas amostras diferentes pré-marcadas com fluoroforos cyanine dye (CyDye) na mesma 2-DE. Além disso, o grande avanço desta técnica é a realização de um ensaio multiplex, onde um padrão interno é usado para a normalização dos dados, assim minimizando a variação experimental entre géis, e favorecendo uma análise quantitativa mais precisa das proteínas (Arentz et al., 2014). Apesar deste avanço em estudos proteômicos quantitiativos baseado em 2-DE, a resolução de proteínas de caráter hidrofóbico, ainda segue sendo uma das grandes limitações desta técnica (Görg et al., 2004).

Análise proteômica baseada em sistemas livre de gel

O desenvolvimento de métodos baseados em sistemas livre de gel, como o sistema de cromatografia líquida, do inglês – “liquid chromatography” (LC), associado à espectrometria de massa (LC-MS/MS), promoveu um avanço na pesquisa proteômica. Nesta técnica, os fragmentos trípticos, provenientes da digestão enzimática do extrato proteico, são separados por uma micro- coluna de fase reversa, do inglês – “reverse phase” (RP) e in tandem, analisado por MS/MS. A

análise por espectrometria de massa é feita por espectrômetros, equipados com ionização do tipo ESI (electrospray ionization), associada a quatro analisadores de massas (time-of-flight (TOF), quadrupolo, orbitrap e ion trap) (Roe & Griffin, 2006).

No entanto, com o objetivo de aumentar a eficiência da técnica LC-MS/MS, foi desenvolvido um sistema de cromatografia bidimensional de alto desempenho, do inglês “high performance liquid chromatography (HPLC)”. Este sistema é composto por duas colunas microcapilares bifásica com RP ou com uma fase com troca catiônica, do inglês “strong cátion exchange (SCX)”, acoplado a um espectrômetro de massa. Esta nova abordagem é denominada MudPit (multidimensional protein identification technology) (Washburn, 2004). Assim, a utilização da abordagem MudPit, associada à análise bioinformática tem promovido uma análise proteômica de alta eficiência, do inglês – “high-throughput proteomics” (Roe and Griffin, 2006).

O estudo quantitativo de proteínas presentes em amostras biológicas complexas é um dos grandes desafios no estudo proteômico. Assim, com a introdução de métodos baseados em sistema livre de gel, vários workflows para a quantificação em proteômica foram desenvolvidos, como a quantificação dependente de ligação, do inglês – “label-based” e independente de ligação, do inglês “label-free”.

A quantificação label-based pode ser subdividida em: (1) ligação química: através da técnica ICAT (isotope-coded affinity tag), onde os resíduos de cisteínas das proteínas são marcados covalentemente por tags thiol específicas. Outro método utilizando na ligação química, é através da técnica iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation), onde as extremidade N-terminal da cadeia lateral e porções aminas das proteínas são marcadas por isótopos estáveis. (2) Ligação metabólica: através da técnica SILAC (stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture) precursores metabólicos (amino ácidos, carboidratos, sais

orgânicos), contendo isótopos estáveis pesados (13C, 15N)são introduzidos no meio de cultura e ligam-se covalentemente as proteínas (Otto et al., 2012; Otto et al., 2014).

Na quantificação label free, nenhum tipo de ligação é usada para quantificar as proteínas presentes em uma amostra proteica complexa. Esta abordagem é subdivida em: (i) contagem espectral, do inglês – “spectral counting”, onde a quantificação é obtida pelo número total de espectros MS/MS para uma proteína, e (ii) pela intensidade da área do pico cromatográfico, sob a área da curva, onde a intensidade do ion precursor do espectro MS1 é contada (Otto et al., 2014).