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3.9.1 Identificação da predição informática do possível promotor do lncRNA AS-APP A identificação do promotor foi realizada a partir de uma busca informática por predições na região de 5 kb de sequência genômica localizada upstream do início (extremidade 5’) conhecido do lncRNA AS-APP utilizando os parâmetros padrões do programa FPROM

Planejamento dos primers para clonagem

Para avaliarmos a atividade promotora da região regulatória predita para o lncRNA intrônico AS-APP pelo programa FPROM utilizamos o ensaio de gene repórter. Para isso, a região promotora predita foi clonada de forma orientada a montante do gene da enzima luciferase de Photinus pyralis no vetor pGL3-Basic Vector (Promega). Os pares de primers utilizados (Tabela 9) foram planejados para amplificar a região promotora em estudo e adicionar especificamente o sítio de reconhecimento da enzima de restrição NheI (sequências em vermelho nos primers da Tabela 9) em uma das pontas da sequência amplificada e o sítio de restrição da enzima HindIII (sequências em azul nos primers da Tabela 9) na outra ponta da sequência. Paralelamente, outro par de primers foi planejado para amplificar essa mesma região, no entanto, com os sítios de restrição das enzimas trocados em relação às pontas da sequência, a fim de se poder também amplificar e clonar a sequência promotora invertida.

Tabela 9: Sequência dos primers utilizados para clonagem da predição de promotor para o lncRNA AS-APP.

3.9.2 Amplificação e clonagem da região promotora

A região promotora predita foi amplificada por PCR com os dois pares de primers de clonagem sítio dirigida a partir do DNA genômico extraído de células da linhagem DU-145. As reações foram realizadas em termociclador GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) com 25 ng do DNA, 5 unidades da enzima Go Taq DNA Polymerase (Promega), 0,2 mM de dNTPs e 0,2 µM de cada primer específico em tampão recomendado pelo fabricante, que contém 1,5 mM de MgCl2. Em seguida, todo o produto das PCRs foi analisado por eletroforese em gel de agarose

1% em TAE com 0,5 µg/mL de brometo de etídio. As bandas correspondentes aos amplicons específicos foram cortadas e purificadas com o Kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), segundo recomendações do fabricante. Os produtos purificados foram quantificados por espectrofotometria (absorbância a 260 nm) no equipamento NanoDrop-1000 (Thermo Scientific). Alíquotas de 1.500 ng de cada um dos fragmentos purificados, bem como 1.000 ng do vetor pGL3-Basic Vector (Promega) foram digeridas, em paralelo, com 10 unidades das enzimas de restrição NheI e HindIII (New England BioLabs) em tampão NEBuffer 2, adicionado de 0,1 µg/µ L de BSA a 37ºC por 3 horas, seguido por 15 minutos a 65ºC para inativação das enzimas. Após as digestões, os fragmentos foram novamente purificados com o Kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), quantificados por espectrometria e ligados ao vetor com a enzima T4 DNA ligase (Promega) respeitando a proporção de 1 massa de DNA inserto para 3 massas de vetor, overnight, segundo as orientações do fabricante. A seguir, as ligações foram submetidas à diálise por 2 horas e utilizadas para eletroporação em bactérias E. coli DH10B eletrocompetentes. Após o crescimento das bactérias em meio LB sólido contendo ampicilina por 16 horas a 37 ºC, colônias de cada clonagem foram transferidas para tubos de ensaio contendo 5

utilizado para a extração do DNA plasmidial com o kit Pure YieldTM Plasmid Miniprep System (Promega) seguindo o protocolo do fabricante. Para a confirmação da clonagem sítio dirigida, os plasmídios purificados foram sequenciados com o método dideoxi no sequenciador MegaBace (Armeshan) utilizando para a reação de sequenciamento o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) e 2,5 µM de um primer complementar à região presente no vetor, que flanqueia o inserto.

3.9.3 Lipofecção de células HEK293 para ensaios de atividade promotora com gene repórter

Cerca de 105 células da linhagem HEK293 foram crescidas em meio DMEM contendo soro fetal bovino por 24 horas em placas de cultura de 24 poços (Corning). Após esse período, os meios de cultura foram trocados por meios frescos e 50 µL da mistura de 1.000 ng do vetor pGL3-Basic contendo a sequência promotora predita para o lncRNA AS-APP clonada, 125 ng do vetor pRL-SV40 (Promega) e 3,4 µL do reagente de transfecção FuGENE HD (Promega) foram adicionados às células. Paralelamente, foram transfectados também com o reagente FuGENE HD, os vetores pGL3-Basic contendo a sequência promotora predita para o lncRNA AS-APP invertida clonada, pGL3-Basic vazio (controle negativo) e pGL3-Promoter/SV40 (Promega). O vetor pGL3-Promoter/SV40 é essencialmente o vetor pGL3-Basic contendo a sequência do promotor viral SV40 clonado upstream do gene da luciferase (controle positivo). O vetor pRL- SV40 foi transfectado nas células juntamente com todos os vetores pGL3 com a finalidade de normalizar os ensaios de atividade que se quer comparar, reduzindo as variações observadas decorrentes de diferenças nas eficiências de transfecção. Esse vetor é um plasmídeo que contém o promotor viral SV40 clonado upstream do gene da luciferase de Renilla reniformis. Suas medidas de luminescência são utilizadas para normalizar as medidas de luminescência obtidas a partir da

reação catalisada pela enzima luciferase de Photinus pyralis. Para compor réplicas biológicas, três diferentes transfecções de cada um dos vetores pGL3-Basic (pGL3-promotor, pGL3- promotor invertido, pGL3-vazio e pGL3-Promoter/SV40) foram realizadas. Após 48 horas, as células transfectadas foram coletas e lisadas com 100 µL do reagente Passive Lysis Buffer (Promega) e congeladas a -80 ºC até o momento do ensaio de atividade promotora.

3.9.4 Ensaio de atividade promotora

A atividade promotora foi medida com o ensaio Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), seguindo as recomendações do fabricante. Com este método as medidas da atividade da enzima luciferase de Photinus pyralis é obtida pela a adição de seu substrato específico (luciferina). Em seguida, sua atividade é inativada e é obtida a medida da atividade da luciferase de Renilla reniformis pela adição de seu substrato (coelenterazina). Resumidamente, 100 µL do reagente Luciferase Assay Reagent II (LAR II) e 20 µL do lisado de células foram transferidos para placas OptiPlate-96 White Opaque de 96 poços (Thermo Fisher Scientific) e misturados com a pipeta. A primeira medida de luminescência, gerada pela reação da enzima luciferase de Photinus pyralis, foi obtida pelo luminômetro MicroLumat Plus (Microplate Luminometer LB – Berthold Technologies) com o programa WinGlow (Berthold Technologies). Em seguida, 100 µL do reagente Stop & Glo Reagent foi adicionado ao mesmo poço, misturado com a pipeta e a segunda medida de luminescência, gerada pela reação da enzima luciferase Renilla reniformis foi obtida. Razões entre as medidas de luminescência obtidas com as enzimas luciferase de Photinus pyralis e de Renilla reniformis foram calculadas (Unidade Relativa de luz, LRU). Três medidas de luminescência para cada lisado de células foram realizadas (réplicas técnicas).

3.10 Extração, quantificação e fragmentação de DNA genômico (gDNA)