Özlem Çakır Madenci
Trombositler megakaryosit stoplazmasından meydana gelir ve periferin en küçük hücreleridir. İyi bilinen hemostazdaki rollerinin yanında immun cevap, direnç, enflamatuar süreç, yara iyileşmesi ve tümör anjiogenezinde görev alır. Hemostaz damar duvarındaki yaralanmayı takiben, kanın pıhtılaşması ve sonrasında pıhtının eritilmesi işlemidir. Primer hemostaz hasarı izleyen saniyeler içerisinde gelişir, kapillerler, küçük arteriol ve venüllerden kan kaybının durdurulması bakımından önem taşır ve sonucunda trombosit tıkacı oluşur. Hasar yerine adezyon, şekil değişikliği, aktivasyon, sekresyon ve agregasyon olmak üzere primer hemostazın 4 temel aşaması vardır. Primer hemostaz defektlerinde oral mukoza kanaması, ekimoz, peteşi, purpura, epistaksis, menoraji ve invazif girişim sonrası kanama varken, sekonder hemostaz defektlerinde daha çok eklem ve kas içi kanamalar, intrakranial kanama ve gastrointestinal kanama görülür. Primer hemostaza bağlı kanama öyküsü yada ailesinde kalıtsal trombosit bozuklukları olan ve trombosit sayısı yada koagulasyon testleri normal olan hastalarda trombosit fonksiyon bozukluğu düşünülür. Tanısal algoritmada tam kan sayımı ve periferik yayma ilk sırada yer alır. Kan sayımında düşük trombosit düzeyi saptanması her zaman gerçek trombositopeni değildir. Periferik yayma ile trombositlerin boyutları, sayıları ve küme açısından değerlendirmelidir. Trombosit fonksiyon testleri kanama bozukluğu olan hastaların tanımlanması, antitrombositik tedavi izlemi, operasyon öncesi kanama riskinin saptanması ve transfüzyon tıbbında kullanılır. Trombosit fonksiyon ölçümü klinik biyomarker ölçümünden farklıdır. Yaşayan hücre dinamiğinin değerlendirildiği bu testler preanalitik pek çok faktörden etkilenir. Testlerin standardizasyonu zordur, ideal ölçüm metodu ve eşik değerler yoktur ve testlerin yapılması ve yorumlanması uzmanlık gerektirir.
Trombosit fonksiyon testleri denildiğinde 20. yüzyılın büyük bölümünde manuel trombosit sayımı, periferik yayma incelemesi ve kanama zamanı dışında test yoktu. Kanama zamanı 1910 yılında Duke tarafından tanımlanmış ilk in vivo trombosit fonksiyon analizidir. Trombositler ve damar duvarı arasındaki etkileşimi ve fizyolojik hemostazı ölçer. Özel kesicisi ile ön kolda 10 mm boyunda ve 1 mm derinliğinde kesi yapılır, kurutma kağıdının kansız kenarı ile 30 saniyede bir kesinin kenarındaki kanama odağının kenarına dokunulur. Kanamanın durduğu dakika kaydedilir. Test sadece trombosit sayı ve fonksiyonuna bağlı değildir. Fibrinojen konsantrasyonu, vasküler fonksiyon, kesinin boyutu, yönü ve bölgesi, derinin kalitesi ve ısısı, uygulayıcı ve hasta ile uyumu testi etkiler. Test birçok laboratuvar tarafından, dezavantajları nedeniyle uygulamadan kaldırılmıştır. Trombosit agregasyon testleri; ışık transmittans agregometri (LTA), impedans agregometri, lumiagregometri, verifyNow ve plateletworks sistemleridir. Işık transmittans agregometri trombosit fonksiyonlarını değerlendirmede altın standart kabul edilir. Trombosit agonistleri kullanılarak in vitro ortamda trombositlerin aktivasyon ve agregasyonu ölçülür. Bu agonistlerin rol oynadığı yolaklarda veya reseptörlerde defekt varsa, trombosit adezyonu ve agregasyonu bozulur.ADP, epinefrin, kollajen, trombin, tromboksan A2, araşidonik asit, trombin reseptör aktive edici peptid (TRAP) ve ristosetin sıklıkla kullanılan agonistlerdir. Glanzman Trombastenisinde ristosetin dışında tüm agonistlere yanıtsızlık varken, Bernard Soulier’de ristosetin dışında tüm agonistlere yanıt saptanır. İmpedans Agregometride tam kan içine yerleştirilen birbirine belirli bir uzaklıktaki iki elektrod yüzeyine aktif trombositlerin sahip oldukları yüzey reseptörleri aracılığıyla yapışması sağlanır ve meydana gelen trombosit agregasyonu sonucunda artan elektriksel impedans Ohm cinsinden ölçülür. Trombositlerin adezyon ve agregasyon kapasitesini LTA’dan daha hassas ve gerçeğe daha yakın ölçer. Multiplate (Multiple Platelet Function Analyzer) sistemi İmpedans agregometri prensibine dayalıdır. Agonistle (TRAP, ADP, araşidonik asit, kollajen, ristosetin) uyarılarak aktive edilen trombositler, test küveti içindeki elektrodların yüzeyine tutunur ve agrege olarak elektriksel
direnç artışına neden olurlar. İmpedans artışı kaydedilerek eğri altında kalan alan (AUC) hesaplanır. Test panelinde TRAPtest, ADPtest, ASPItest, COLtest, RISTOtest, yüksek sensitif ADP yer almaktadır. Kanama bozukluklarının tanısı, antitrombositik tedavi izlemi, tedaviye aşırı yanıt veren yada yanıt vermeyen kardiyovasküler hastaların tanımlanması, tedavi altındaki hastalarda kanama yada trombotik riskin tayini ve post operatif dönemdeki kanama riskini değerlendirmede faydalıdır. ASPI testte araşidonik asit agonist olarak kullanılır ve asprin tedavisi izleminde kullanılır. ADP Testte ADP agonisttir ve P2Y12 reseptör ihibisyonu değerlendirlir. Glanzman Trombastenisi ve klopidogrel tedavisinde agregasyon inhibisyonu gözlenir. ADP Test ile yüksek AUC değeri tromboz rikini gösterirken, düşük değerler kanama riskine işaret eder. VerifyNow ışık transmittans agregometri prensibine dayanır. Antitrombositik tedavi izleminde kullanılır. Anti trombositik ajanlara karşı anlamlı düzeyde yanıt için %80 den fazla trombosit reseptörü bloke edilmelidir. Aspirin testi için sonuçlar, Aspirin Reaction Unit (ARU) olarak raporlanır. Sonuç<550 ARU ise aspirine bağlı trombosit fonksiyonlarının azaldığı, ilaca yanıt alındığı, sonuç≥550 ARU ise aspirine yanıt olmadığı kararı verilir. Klopidogrel için test sonucu P2Y12 Reaction Units (PRU) ve % P2Y12 inhibisyon olarak verilir. Sonuç <95 PRU ise kanama riski yüksek; sonuç>208 PRU ve % P2Y12 inhibisyon düşük ise tromboz ve iskemi gelişme riski yüksektir.
Shear Stresde trombosit adezyon testleri platelet function analyzer (PFA-100, Innovance PFA-200), Impact:Cone&Plate(let) analizör ve global trombosis testidir. PFA shear stres altında trombositlerin membrana adezyonu ve çeşitli agonist varlığında agregasyonu prensibine dayanır. Primer hemostazı in vitro şartlarda simüle eder. Örnek negatif basınçla kapiller sisteme doğru aspire edilir. Kapillerin sonunda membran bulunur. Membran agonist (kollajen-epinefrin veya kollajen-ADP) ile kaplıdır. Bu membranın ortasında ise 147 μm’lik bir açıklık bulunur. Shear stres ve agonistlerden dolayı açıklık üzerinde trombosit adezyonu ve agregasyonu gerçekleşir. Trombosit tıkacı oluşur ve açıklık kapanır, kan akışı durur. Testin başlangıcından, açıklığın kapanmasına kadar geçen süre “kapanma süresi” (Closure Time: CT) olarak kaydedilir.CADP ve CEPI kartuşları kullanarak von Willebrand Hastalığı, Glanzmann trombastenisi veya Bernard-Soulier Sendromu gibi trombosit defektlerinin, antitrombositik tedaviden ayrımı sağlanır. Viskoelastik metodlar tromboelastografi (TEG) ve Rotational Thromboelastometri (ROTEM) ile trombüs oluşumu sırasında kanın viskoelastik ve mekanik özelliklerindeki değişim değerlendirilir. Tam kan kap içerisine alınır, aktivatörler eklenir, test başladığında iğne kanın içinde bulunur. İğne yada kap hareket eder ve shear stres oluşturur. Pıhtı oluştuğunda fibrin iplikleri hareketi kısıtlar. İğnede oluşan direnç ölçülür. Global olarak hemostatik süreç, trombositlerin sayı ve fonksiyonu, fibrinojen konsantrasyonu, koagulasyon sistemi ve fibrinolitik aktivite açısından değerlendirilir. Akım sitometri ile trombosit aktivasyonu sırasında hücre yüzeyinde ortaya çıkan (P-selektin ve trombospondin gibi) proteinler tespit edilir. GPIIb/IIIa’nın fibrinojene bağlanmasıyla oluşan yeni epitoplar antikorlar aracılığıyla saptanır. CD41, CD42a-b-c-d, CD51, CD61, CD62 CD63, CD107a-b yalnızca trombositlerde bulunan yüzey belirteçleridir. Bernard-Soulier Sendromunda CD42a, b, c eksikliği, Glanzman Trombastenisinde CD41-CD6 eksikliği gözlenir.