Prof. Dr. Mehmet Burak Y. Çimen Mersin Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyokimya AD
Son yıllarda teknolojideki gelişmeler laboratuvarlara da yansımış, elektronik kan sayımı cihazları laboratuvarların vazgeçilemez bir parçası haline gelmiştir.
Günümüzde rutin laboratuvarlarda, kan sayımı cihazlarında kullanılan yöntemler;
Fotometrik
İmpedans: Hücrelerinin yalıtkan özelliğinde faydalanılmaktadır. İletken bir sıvıda seyreltilen kan hücreleri
küçük bir delikten geçerken, mevcut elektrodlar arasındaki voltaj değişikliklerinin ölçümüne dayanmaktadır. İlk olarak 1950 yılında Wallace Coulter tarafından lökosit ve eritrosit sayımı amacıyla kullanılmıştır.
Radyo Dalgaları: Hücrelerin çekirdek büyüklükleri yoğunlukları ve hücre içi granülariteleri hakkında
bilgiler sağlanmaktadır.
Optik Scatter: Akan bir sıvı içerisinde, florokromla işaretlenen hücre veya partiküllerin özelliklerinin,
kullanılan lazer ışığının önünden tek tek geçerken verdikleri sinyaller doğrultusunda belirlenmesi sağlanmaktadır. İleri saçılan ışık (FSC) ile “hücre büyüklüğü”, Yana saçılan ışık (SSC) ile “hücre granülaritesi” ve Fleurosan işaretli monoklonal antikorlarla “hücre belirteçleri” açısından değerlendirme yapılarak bu özelliklerine göre hücre popülasyonları tanımlanabilmektedir.
Rutin analizlerde kullanılan kan sayım cihazlarında değerlendirmeler; Ölçülen Parametreler (Eritrosit Sayısı (RBC), Hemoglobin (HGB), Trombosit Sayısı (PLT), Lökosit sayısı ve formülü (WBC) ve Hesaplanan Parametreler (Hematokrit (HCT), Eritrosit İndeksleri (MCV, RDW, MCH, MCHC), Trombosit İndeksleri (MPV, PDW)) olarak gruplandırılmakla birlikte, bu sunumda son yıllarda kullanıma giren yeni parametreler hakkında bilgiler aktarılacaktır.
Retikülositler
Olgunlaşmalarını henüz tamamlamamış çekirdeksiz eritrositlerdir. Sitoplazmalarında ince iplikçik ve granüllerden oluşan retiküler örgü görünümü dolayısıyla “retikülosit” olarak adlandırılırlar. Yaklaşık 3 gün süre ile kemik iliğinde olgunlaştıktan sonra periferik kana geçerler. Hücre sitoplazmalarında RNA artıkları içerirler ve dolaşımda olgunlaşmaları 1 gün sürer. Kalıntı RNA ise dolaşımda 24-36 saat sürede metabolize olur. Periferik kanda dolaşan eritrositlerin yaklaşık olarak % 1 (% 0.5-2.0) kadarı retikülosit evresindedir ve mevcut miktar Kİ'nin eritropoetik aktivitesini gösterir.
Sitoplazmik RNA artıklarının farklı boyalarda boyanma özelliği dolayısıyla rutin cihazlarla (Siemens Advia- Oxazine750, Abbott-CD4K540, Beckman-Coulter-metilen mavisi) analiz edilirler. Diğer yandan Işık Saçılımı Yöntemi ile ayrı bir kanalda RNA boyayan flouresan boyalar kullanılarak da sayım yapabilmek mümkündür. Bu kanalda retikülositler sayılırken aynı anda RNA miktarları, eritrosit büyüklüğü ve Hb miktarı ölçülmekte ve trombosit sayımı da yapılabilmektedir. Bazı sayıcılar retikülositleri olgunlaşma derecelerine göre ayırabilir. Genç retikülositlerde RNA fazladır, daha fazla floresan verirler ve saçılma grafiğinde sağda görülürler. Bu yöntemle retikülositler; HFR (high fluorescence ratio), MFR (medium
fluorescnce ratio), LFR (low fluorescnce ratio) olarak ayrılabilirken, MFR, HFR; birlikte IRF olarak bildirilir.
Orta derecede anemide (Hb <10 g/dL), ilik normal ise, eritropoetin etkisiyle, 10 gün içinde eritrosit yapımının 2-3 kat artması beklenir. BU nedenle akut kan kaybı ya da hemolizden sonra retikülositoz gözlenir. Demir, B12 vitamini ya da folat eksikliği sonucu oluşan yapım bozukluğuna bağlı anemilerde retikülosit
sayısı normal ya da düşüktür (retikülositopeni) ve uygun tedaviyle 5-7 günde retikülosit krizi gözlenebilir. Mutlak retikülosit sayısı 24-84 bin/µL arasındadır. Ancak sonuçların eritrositlerin yüzdesi olarak bildirmilmesi yanlıştır. Ör: % 1 retikülosit oranı, eritrosit sayısı 5 milyon olan bir hasta için normal iken 2 milyon olan bir hasta için düşüktür. Bu durumlarda sonucun Düzeltilmiş retikülosit % olarak verilmesi uygundur.
Düzeltilmiş retikülosit % = Ret değeri x (Hb / Normal Hb) veya = Ret değeri x (Htc / Normal Htc) (45)
Erken salınan öncü hücrelerin dolaşımda 1 günden fazla retikülosit olarak yaşamaları dolayısıyla eritrosit yapım hızı yalancı yüksek hesaplanabilir ve ikinci bir düzeltme yapılmalıdır.
Normalde RYİ 1.0 ile 2.0 arasında olmalıdır. (birimi yoktur)
RYİ > 2.0 : Kİ’de yapımın arttığını gösterir. Örn: hemoliz, akut kan kaybı. RYİ < 1.0 : Kİ’de apımın azaldığını gösterir. Örn Fe eksikliği, aplastik anemi. Olgunlaşmamış Retikülosit (IRF)
Eritropoez için erken ve duyarlı indeksdir ve aneminin eşlik ettiği birçok durumda (hemoliz, kanama, Kİ supresyonu) tedaviye erken yanıtı gösterebilmektedir. Retikülosit sayısının düşük veya normal olduğu akut enfeksiyonlar veya MDS’a sekonder anemilerde yarar sağlar. Buttarello ve ark. yaptığı çalışmada demir eksikliği anemisi olan hastalarda i.v. demir tedavisi sonrası IRF düzeyleri ölçülmüş ve IRF’nin retikülosit krizinden çok daha önce artmaya başladığı görülmüştür.
Ölçümde kullanılan cihazların farklı olması, standardizasyon ve kalibrasyon sıkıntılarından dolayı IRF’nin normal aralığı ile ilgili hala çelişkili sonuçlar bulunmaktadır.
Retikülosit Hemoglobin İçeriği (CHR)
Rutin değerlendirmelerde sadece retikülosit konsantrasyonuna bakmak yeterli olmayabilir, aynı zamanda üretilen retikülositlerin büyüklüğü ve hemoglobin içeriği de bu hücrelerin kalitesi için önemlidir. Ret- He kemik iliğindeki demir depolarının durumunu yansıtır. Ortalama değeri 28 - 31 pg’dır. Demir eksikliğinde, Hb sentezi ilk önce retikülositlerde azalır. Klinikte özellikle fonksiyonel Fe eksikliğinin değerlendirilmesinde kullanılmaktaolup bu açıdan güvenilir bir indekstir. Ayrıca tedaviden yararlanıldığında ilk artan da Ret-Hb olacaktır. Ancak Kİ’nde demir depolarının incelenmesi halen DEA tanısı için altın standart olarak değerini korumaktadır.
Ortalama Retikülosit Volumü (MCVR)
Demir depoları düşük hastalarda demir tedavisini takiben MCVR hızla artarken, eritropoezisin iyileşmesi ile aynı hızda azalır. Vit B12 ve folik asit tedavisi sonrası makrositozda MCVR düşük bulunur.
MCVR x retikülosit sayısı = HctR değerini vermektedir. MCVR / MCV → KİT sonrası eritropoetik cevabın en erken işareti olarak değerlendirilmektedir. Bununla birlikte farklı cihazlardan elde edilen verilerin karşılaştırılması problemlidir.
Eritroblastlar (NRBC)
Çekirdekli eritrositler, Kİ hasarı, rejeneratif yanıt gibi durumlarda kanda görülebilen immatür eritrositler olup, yenidoğan döneminde ve küçük bebeklerde fizyolojik olarak dolaşımda bulunabilmektedirler. Yetişkin yaşlarda çekirdekli eritrositler periferik kanda görülebilmektedirler. Çekirdekli eritrositler, dolaşımda saptandıkları diğer tüm durumlarda, bozuk eritropoezin göstergesi olarak kabul edilmektedirler.
Dolaşıma salınmalarında, aşağıdaki durumların rol oynadığı düşünülmektedir. • Yeni doğan
• Hematopoietik stres (kanama, ciddi hipoksi, septisemi…)
• Kronik miyeloproliferatif hastalıklar, Solid kanserlerin kemik iliği metastazları, • Konjestif kalp yetmezliği, Enfeksiyonlar, yanıklar, Akut ve kronik anemi
Bu hastalıklarda dolaşımda bulunma nedenlerinin, ekstramedüller hematopoez, kan-kemik iliği bariyerinin bozulması ve eritroid hiperplazi olabileceği belirtilmektedir. NRBC'ler (tekniğe bakılmaksızın, manuel veya otomatik) diferansiyel lökosit sayımında hücrelerin değil çekirdeğin değerlendirilmesi dolayısıyla, 100 lökosit başına NRBC sayısı olarak kaydedilir. Elde edilen “WBC” sayımı, aslında WBC ve NRBC içeren çekirdekli hücrelerin sayımdır.
Düzeltilmiş WBC = Çekirdekli hücre sayısı x (100 ÷ [NRBC + 100])
NRBC > 5/100 WBC den fazla olduğunda, NRBC'leri düzeltmek gerekirken, < 5/100 ise düzeltme yapılmaz.
Şistozidler
Eritrosit fragmanlarıdır. (< 30 Fl) Düşük RNA içeriğine sahiptirler, boyut ve hemoglobin içeriği ile ayrılırlar. Tam kan sayımında küçük eritrositler ve membran parçacıkları ile karışırler ve pozitif sonuçlar için mikroskopi önerilmektedir. PY’da şistositlerin varlığı, hematolojik acillerin incelenmesi ve trombotik mikroanjiyopati (TMA) araştırılmasını gerektirir. Bununla birlikte, TMA için spesifik değildir (mekanik kalp kapakçıkları..vs) PY’da ≥1% varlığı diğer ılımlı RBC değişikliklerinin yokluğunda, TMA tanısı için önemli kriterdir.
Olgunlaşmamış Granülositler (IG)
Bakteriyel sepsis, YD’larda mortalite ve morbiditelerin majör sebeplerinden biridir. Klinik bulgular non- spesifiktir ve klinik şüphe doğrultusunda değerlendirilir. Erken tanı ve uygun tedavinin erken başlanması önemli olmakla birlikte altın standart yöntem, etken mikroorganizmanın kan kültüründe üretilmesidir. C- reaktif protein (CRP), prokalsitonin, total lökosit sayısnın değerlendirilmesi en sık kullanılan biyobelirteçlerolmakla bieraber, halen duyarlılık ve özgüllüğü yüksek olan ideal bir laboratuvar yöntemi bulunmamaktadır.
Son zamanlarda yapılan klinik çalışmalarda immatür granülosit oranı (delta nötrofil indeks, DNİ) değerinin yeni bir sepsis-enflamasyon belirteci olarak kullanılabileceği öne sürülmüştür. IG’ler, yenidoğan dönemi hariç periferik kanda bulunmayıp, Kİ’nde bulunan myelosit, promyelosit ve metamyolositlerin yani granülosit (nötrofil) öncüllerinin ortak adıdır. Bununla birlikte, inflamasyon veya diğer uyaranlarla enfeksiyona yanıt olarak periferik kana girebilir. Erken bağışıklık yanıtı ve inflamasyon ciddiyetinin göstergesinde erken yanıt olarak üretilirler.
IG: Blast, Atipik lenfosit, Promyleosit, Metamylosit, Myelosit, NRBC (band nötrofilleri içermez)
İmmatür/Total Oranı: band, blast, myelosit, metamyelosit sayısı / tüm olgun granülositlerin (Nötrofiller, eosinofiller, bazofiller, lenfositler, monositler) sayısı olarak raporlanır. ITR <0,2 sepsis için negatif kabul edilir. IG’ler az sayıda ve işlem zaman alıcı olduğundan PY de belirlemek zordur. (100-200-400 hücre saymak gereklidir) Ancak rutin CBC analizi ile otomatik olarak kısa sürede elde edilir, tekrarlanabilirliği yüksektir,
ek kan, zaman ve personel gerektirmez. Ayrıca tam kan sayımı analizörlerinde, akım sitometri analizi (referans, altın standart yöntem) ile de değerlendirilebilmektedir. CD16: Yalnızca olgun nötrofillerde, CD11: İmmatür Granülositlerde (çok erken evrelerde olanlar dışında), CD45: Granülosit olgunlaşmasının tüm evrelerinde
Sepsisin erken tanısı, ayırıcı tanı, izlem ve antibiyotik tedavi süresine karar vermede kullanıldığı gibi, SIRS, septik şok, DIC ve organ /dolaşım yetersizliği, durumlarında da yararlıdır. Yarı ömrü kısa olması dolayısıyla klinik bulgular çıkmadan ve diğer belirteçlerden önce artarken, diğer belirteçler düşmeye başlarken DNI yüksek kalır. Ek olarak; acil başvurusunda bulunan hastalarda serum albümini rutin olarak ölçüldüğünden, DNI / Albumin oranı; DNI'si yüksek olan şiddetli septik hastalarda erken mortalite için gösterge niteliğinde olabilmektedir.
Olgunlaşmamış Trombositler (IPF)
İmpedans yöntemi kullanılarak yapılan sayımlarda trombositler, eritrosit fragmanları, şiztozidler ve mikrositik eritrositler platelet olarak sayılabilirken, yanlış yüksek sonuçlar elde edilebilir. Optik yöntemle yapılan sayımlar ise büyüklüğe göre değerlendirildiğinden Large plateletler göz ardı edilip, yanlış düşük sonuçlar elde edilebilir.
Olgunlaşmamış trombositler, daha küçük ve yaşlı trombositlere kıyasla daha büyük bir kitle ve daha yüksek protrombotik potansiyel sergilerler. Megakaryositlerden gelen mRNA’ları vardır. Yüksek agregasyon potansiyeli ile yüksek P-selektin ve tromboksan A2 düzeyleri mevcuttur. RNA içerdiğinden dolayı akım sitometri ile ayırt edilebilmektedir.
Trombositopenik hastalarda IPF nin artmış olması; Kİ’nde trombosit yapımının normal olduğunu, ancak aşırı tüketimden (yıkımdan) dolayı bu durumun ortaya çıktığını gösterir. Kİ’nde trombosit yapımı baskılanmışsa periferik kanda IPF görülmez. Bu durumda trombosit yapımında sorun olduğu anlaşılır. • ITP (azalan üretimi, hızlanan yıkımdan ayırt etmek), Sepsis
• MDS (Kötü Prognoz belirteci), Neonatal trombositopeni, Wiskott–Aldrich sendromu • Hematopoetik kök hücre transplantasyonu alıcılarında
• Akut koroner sendrom tedavisinde anti trombosit yanıtın belirleyicisi • Kemoterapi sonrası
• Karaciğer transplantasyonu sonrası ve Kronik böbrek yetmezliği
Platelecrit
Trombositlerin oluşturduğu hacmin, toplam kan hacmine oranını gösterir (kandaki trombosit yüzdesi) Trombosit turnoverinin arttığı durumlarda gözlenir. Büyük trombositler - kırmızı hücre boyutundan daha küçük ancak 1/3 den daha büyüktürler. Platelecrit: [PLT X MPV/1000]
PCT yüksekliğinin YBÜ hastalarda mortalitede azalmayla birlikte olması elde edilen benzer sonuçlardır.
MPV Kemik iliğinde trombosit üretim hızının direkt göstergesidir. Trombosit sayılarıyla ters orantılıdır.
[PCT/Trombosit sayısı]
PDW Trombosit boyutu dağılımının, standart sapmasıdır. Trombosit boyutlarının homojenliğini gösterir. PLCR Büyük trombositlerin (>12 fL) normal olanlara oranıdır.
MPC ve MPM Trombosit aktivasyonunun yansıtan yeni parametrelerdir.
Gerçekten de trombositopeni araştırmasında belirgin klinik yarar potansiyeli olan MPV, PDW ve P-LCR'nin klinikte sınırlı kullanımı vardır
Kaynaklar
1. Beverly George-Gay B, Parker K. Understanding the Complete Blood Count With Differential. J. PeriAnesthesia Nursing 2003;18(2):96-117.
2. Jacob EA. Complete Blood Cell Count and Peripheral Blood Film, Its Significant in Laboratory Medicine: A Review Study. Am J Lab Medicine 2016;1(3):34-57
3. Karagulle M, Gunduz E, Şahin Mutlu F, Akay O. Demir Eksikliği Anemisi Tanısında Retikulosit Hemoglobin İceriğinin Klinik Onemi. Turk J Hematol 2013;30:153-6.
4. Kaplan M, Yılmaz N, Özet G. Yeni tanı demir eksikliği anemisi olan hastalarda bazal immatür retikulosit fraksiyonu (IRF) düzeyi ve demir tedavisine IRF yanıtının değerlendirilmesi. Ortadogu Med. J. 2018;10(4):431-5.
5. Schapkaitz E, Halefom Mezgebe M. The Clinical Significance of Schistocytes: A Prospective Evaluation of the International Council for Standardization in Hematology Schistocyte Guidelines. Turk J Hematol 2017;34:59-63. 6. Huang Y, Xiao J, Cai T, Yang L, Shi F, Wang Y, et al Immature granulocytes: A novel biomarker of acute
respiratory distress syndrome in patients with acute pancreatitis. J Critical Care 2019;50:303–8.
7. Young Lee J, Geun Han B, Ok Choi S, Eom M, Hun Kim S, et al. Increased Delta Neutrophil Index Is Associated With Poor Prognosis in Cadaver Donor Kidney Transplantation. Transplant Proceedings 2019; 51:2671-75.
8. Tanaka Y, Tanaka Y, Gondo K, Maruki Y, Kondo T, et al. Performance Evaluation of Platelet Counting by Novel Fluorescent Dye Staining in the XN-Series Automated Hematology Analyzers. J Clinical Lab Analysis 2014;28:341–8.
9. Van De Wyngaert Z Fournier E, Bera E, Carrette M, Soenen V, Gauthier J, Preudhomme C, Boyer T. Immature platelet fraction (IPF): A reliable tool to predict peripheral thrombocytopenia. Current Res Translational Med 2020;68:37–42.