Tanzimat Öncesinde Đdari Yapının Genel Özellikleri

O diluidor deve interagir com o sêmen e proporcionar proteção aos diferentes compartimentos celulares durante o resfriamento, congelação e descongelação. Por isso, sua constituição deve garantir nutrição, proteção, balanço eletrolítico (pH e osmolaridade) e inibição bacteriana. Os constituintes básicos dos diluidores são substâncias energéticas, crioprotetores, soluções tampões e antibióticos (GRAHAM, 1995; SQUIRES et al., 1999; HOLT, 2000).

Existem muitos relatos acerca do meio de diluição para sêmen. Cada diluidor, desde uma simples solução salina até os meios tamponados mais complexos, tem seu próprio mérito. A busca da preservação do sêmen parte do princípio que a sobrevivência dos espermatozóides por longos períodos é inversamente relacionada com sua atividade metabólica. A eficiência em armazenar o sêmen congelado envolve uma completa suspensão do metabolismo das células espermáticas (WATSON, 1995; VISHWANATH; SHANNON, 2000).

Os crioprotetores podem ser classificados como penetrantes e não penetrantes, de acordo com sua capacidade em atravessar a membrana plasmática. Os crioprotetores penetrantes são moléculas pequenas como glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, que atravessam a membrana plasmática e atuam nos meios intra e extracelulares (DE LEEUW et al., 1993; GRAHAM, 1995; SZTEIN et al., 2001). Estas substâncias agem como solvente e soluto, contribuindo com a pressão osmótica intra e extracelular. Entre estes crioprotetores, o glicerol tem merecido destaque, pois ainda é o que apresenta melhores resultados na preservação do sêmen bovino (GRAHAM, 1995; FORERO-GONZALEZ, 2004).

Os crioprotetores não penetrantes não conseguem atravessar a membrana plasmática, são moléculas grandes, como proteínas (da gema do ovo e do leite desnatado), açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose), polímeros sintéticos (polivinilpirrolidona e metilcelulose) e amidas, que atuam no meio extracelular, ou seja, agem como solutos ou colóides (DE LEEUW et al., 1993; GRAHAM, 1995; COTTORELLO; HENRY, 2002). Todos os solutos e colóides numa solução contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula (GRAHAM, 1995; HOLT, 2000). Os lipossomos da bicamada que contém proteínas ligadas não sofrem perdas na congelação, o que é um indicativo de que proteínas parecem estabilizar a bicamada por providenciar maior hidratação da superfície da membrana e pela ligação hidrofóbica adicional no interior da membrana (STRAUSS; INGENITO, 1980).

As interações que ocorrem durante a congelação entre o diluidor e os espermatozóides são descritas. Os crioprotetores penetrantes, que têm propriedade solvente, possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água. Com a congelação do diluidor do sêmen, a água pura congela primeiro e forma cristais de gelo, entre estes cristais de gelo ficam canais de diluidor não congelado, onde os espermatozóides ficam alojados.

Com a água congelada, aumenta a concentração de soluto, o que aumenta a osmolaridade do meio extracelular e promove o egresso de água da célula, conseqüentemente o espermatozóide irá desidratar, diminuindo seu volume, pois a água passa mais rapidamente através da membrana do que o crioprotetor penetrante. Este processo evita o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular. Esta mudança dura até que o crioprotetor penetrante entre na célula em quantidades suficientes para restaurar o volume celular inicial (MAZUR, 1984; WATSON, 1995; GRAHAM, 1995; HOLT, 2000; WATSON, 2000).

Apesar da importância da presença do crioprotetor penetrante como o glicerol, há evidências de que o glicerol é tóxico ao espermatozóide e parte de sua toxicidade é devida a injúrias bioquímicas resultantes da ação direta do crioprotetor sobre os componentes subcelulares, mas danos osmóticos também podem ocorrer (GRAHAM, 1995). Na ausência de crioprotetor, a congelação causa de 30 a 40% de destruição dos lipossomos não ligados a proteínas da bicamada. Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetor desestabilizam os lipossomos mesmo antes da congelação, pois dissolvem os fosfolipídeos, enquanto, em concentrações moderadas, previnem os efeitos prejudiciais da desidratação dos lipídios na congelação (STRAUSS; INGENITO, 1980).

Outros crioprotetores vem sendo testados na busca de minimizar os efeitos tóxicos dos crioprotetores e a obtenção de melhores resultados de congelação. Para espermatozóides eqüinos, a dimetilformamida vem sendo utilizada como crioprotetor penetrante com resultados superiores ao glicerol (ALVARENGA, 2002; MEDEIROS, 2003). Todavia, a criopreservação do sêmen bovino com diluidor à base de tris-gema apresentou melhores resultados quando associado ao glicerol, como crioprotetor penetrante, do que quando associado ao etilenoglicol ou dimetilformamida, pois o diluidor contendo glicerol preservou melhor motilidade, vigor, função mitocondrial, integridade das membranas plasmática e acrossomal (FORERO-GONZALEZ, 2004).

O resfriamento dos espermatozóides abaixo de 0o C em uma taxa lenta promove maior egresso de água da célula do que quando o resfriamento é realizado numa taxa rápida. Dessa forma, um resfriamento muito lento pode levar a uma desidratação celular muito intensa, enquanto, um resfriamento muito rápido é insuficiente para permitir o egresso da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular. A taxa de resfriamento ideal deve ser relativamente rápida resultando em suficiente e não excessiva retirada de água intracelular, o que pode levar a formação de cristais de gelo intracelulares, pequenos e não letais, proporcionando boas condições de sobrevivência da célula após o reaquecimento. Quando a taxa de resfriamento é mais lenta ou mais rápida do que a ideal, os danos celulares podem ser abrandados por taxas de reaquecimento apropriadas. Em geral, quando o resfriamento é feito com taxas mais rápidas a descongelação deverá ser rápida. As taxas de resfriamento e descongelação ideais também são influenciadas pela composição do diluidor e pelas concentrações de crioprotetor penetrante (AMANN; PICKETT, 1987; GRAHAM, 1995; WATSON. 1995; SQUIRES et al., 1999).

Quando resfriado rapidamente de 37o C ou 20o C para 0o C, o espermatozóide apresenta uma série de mudanças denominadas choque frio. O choque frio é evidenciado por muitos espermatozóides em movimento circular, perda prematura da motilidade, diminuição da produção de energia, aumento da permeabilidade da membrana e perda de moléculas e íons intracelulares. Estas alterações são devidas a danos nas membranas espermáticas, as quais são bioquimicamente diferentes, mas apresentam estruturas semelhantes (AMANN; PICKETT, 1987; MEDEIROS et al., 2002). O choque frio pode ser minimizado pelo resfriamento lento do sêmen diluído de 20o C até 4o C, numa taxa de 0,05o C/minuto (SQUIRES et al., 1999) e pela adição de proteínas do leite ou da gema de ovo nos diluidores de sêmen (AMANN; PICKETT, 1987). A gema do ovo possui lipoproteínas de baixa densidade, principalmente a fosfatidilcolina, que são responsáveis pela ação protetora das membranas (WATSON, 1995).

A adição de lipoproteína isolada ao diluidor preserva melhor a qualidade e a capacidade de fertilização do sêmen bovino após o processo de congelação e descongelação do que a adição de gema de ovo (AMIRAT et al., 2004).

A descongelação envolve o processo inverso, forçando a célula a retroceder seu curso pela passagem de várias mudanças de fase, e tem como resultado o fluxo de água para dentro da célula. A taxa de mudança de temperatura deve permitir o movimento de água e de crioprotetor sem a formação de gelo intracelular ou mudanças irreversíveis na membrana. A ruptura citoplasmática devido a formação de cristais de gelo intracelular é maior durante a descongelação, num processo denominado de “recristalização” (AMANN; PICKETT, 1987; HAMMERSTEDT et al., 1990; WATSON, 1995; HOLT, 2000).