Tüp antiserıımları kullanılarak deney basamakla rında hiçbir değişiklik yapılmadan aglütinasyonlar micıoplate’lerde gerçekleştirilmiştir.
Ss. Kell. Kidd, Duffy ve Lutheran eritrosit antijenle rinin gösterilmesinde G3d-spesifİk anti-human globulin (Dominion Biologicals, NAHGO1202) kullanılmıştır.
Ayrıca antiserumlar 1/2, 1/4 ve 1/8 oranlarında SF ve %3’lük BSA (Bovin Serum Albumin. Immııcor OTG5235T) ile ılilüe edilerek, antiserumların çalışı labilecek dilüsyon oranları araştırılmıştır.
JEL TEST YÖNTEMİ
Diamed’ten alınan Lea (007121), Leb (0077231), K (002114). Fya (007270), Fyb (007280), Jka (007321), Jkb (00733D, Lua (007351), Lub (007361), M (007011), N (00711), S(007130), s (007140) ID-kartları ile Fya ve Fyb ID-kartlarına sonradan eklenen anti-Fya (007270) ve anti-Fyb (007080) antiserıımları kullanılmıştır.
1D-Dilüent I (009154) solüsyonu ile hazırlanan %5'lik eritrosit süspansiyonu MN, Lewis, Kell, Kidd ve Lutheran eritrosit antijenlerinin gösterilmesinde; ID- Dilüent II (009254) ile hazırlanan %1'lik eritrosit süs pansiyonu Duffy ve Ss antijenlerinin gösterilmesinde kullanılmıştır.
BULGULAR
Tiip antiserıımları kullanılarak yapılan microplate yönteminde %3’liik BSA ve SF ile diliie edilerek kul lanılan antiserumlarla oluşturulan hemagliitinasyon reaksiyonlarında bir farklılık izlenmemiştir. Bu neden le maliyet açısından daha ucuz olması nedeniyle da ha ileri dilüsyon çalışmalarında SF tercih edilmiştir.
Antiserumun SF ile l/4ve 1/8 oranlarında diliie edi lerek kullanılmasında hemagliitinasyon reaksiyonları ayırt edilemezken, 1/2 oranındaki dilüsyonunda Ss. Kell, Kidd, Duffy ve Lutheran eritrosit antijenlerinin he magliitinasyon reaksiyonları tam olarak izlenebilmeştir. Ancak MN ve Lewis antijenlerinin gösterilmesinde 1/2 oranında diliie antiserum kullanımı ile hemagliitinas yon reaksiyonlarında yanlış negatif sonuç alınmıştır.
Microplate ve jel test yöntemi ile 38 örnekte sapta nan Keli fenotipleri, 70 örnekte saptanan Ss fenotiple- ıi ile 74 örnekte saptanan Kidd ve Lutheran fenotiple- rinde fenotipik bir farklılık izlenmemiştir.
Çalışılan 73 kan örneğinin 72’sinde microplate ve jel test yöntemiyle saptanan Lewis fenotipleri aynı bu lunmuştur. Bir örnekte microplate yöntemiyle Le(a+) fenotipi izlenirken, jel test yöntemi ile Le(a-) fenotipi izlenmiştir.
Duffy fenotiplerinin gösterilmesinde toplam 6.3 kan örneği kullanılmıştır. Her iki yöntemle çalışılan 6.3 kan örneğinin 62’sinde aynı fenotipler izlenirken, bir örnekte farklı fenotipler izlenmiştir. Bu örnekte mic roplate yöntemiyle Fy(a-) fenotipi izlenirken, jel test yöntemiyle Fy(a+) fenotipi saptanmıştır.
MN antijenlerinin gösterilmesinde tüp test ve jel test yöntemleriyle çalışılan 61 kan örneğinin 55'inde her iki yöntemle aynı fenotipler izlenmiştir. Ancak 6 örnekte farklı fenotip izlenmiştir.
TARTIŞMA ve SONUÇ
Yöntem karşılaştırmaları, yöntemler arasında has saslık, güvenilirlik ve maliyet açıdan amaca uygun kullanılabilecek en iyi yöntemi belirlemeye yönelik olarak yapılmaktadır. Gelişmiş ülkeler yöntemlerin hassasiyet ve spesifikliğini belirleyebilmek amacıyla, farklı ülkelerdeki araştırma laboratuvarlarına gönderi len deney materyalleri ile yapılan çalışmaları değer lendirmekte, böylece yöntemin hassasiyetini ve spesi fikliğini daha objektif bir şekilde ortaya koymaya ça lışmaktadır. Böyle bir değerlendirmede hataların tek nik hatalardan çok kişisel hatalardan kaynaklandığı belirtilmektedir. Bu hataların çoğunluğunun okuma hatası olduğu, bir kısmının ise tüplerin tüplerin yer değiştirmesi, yanlış kayıt ve etiketleme hatası olduğu bildirilmektedir/20-22,28-35).
Bu çalışmada tüp test, microplate ve jel test yön temleriyle MN, Ss, Lewis, Kell, Kidd, Duffy ve Lutheran eritrosit antijenlerinin majör komponetleri çalışılmıştır.
Tüp antiserıımları kullanılarak yapılan microplate yönteminde deney klasik tüp yönteminde belirtildiği gibi yapılmakla birlikte, reaksiyonlar tüp yerine ıııic- roplate'lerde gerçekleştirilmiştir. Böylece birçok tüp kullanımı yerine bir microplate üzerinde birden fazla reaksiyon gerçekleştirilerek tüplerin yer değiştirmesi gibi karışıklıklar önlenmiştir. Bir paternité çalışmasın da en az üç kişiden alınacak kan örnekleri ile bakıl-
ması gereken antijenler göz önünde bulundurulursa. 70’ten fazla tüp kullanılarak yapılan bir çalışmada eti ketleme hatası, tüplerin yer değiştirmesi gibi hataların yanında manipulasyon işlemleri de zorlaşacağından zaman bakımından da dezavantaj olacaktır. Böyle bir çalışmada teknik basamak hatasını önlemek oldukça zordur. Bu problem microplate kullanarak en aza in dirilmiş olmaktadır.
Ayrıca, tüp test ve microplate yöntemi ile yapılan ön çalışma sonucunda; Ss, Kell, Kidd, Duffy ve Luthe ran antijenlerinin tüpte çalışılması zaman alıcı ve uy gulamasının zor olması yanında, tüp tabanının mic roplate kuyucuklarına oranla çok geniş olması nede niyle az. miktarda kullanmış olduğumuz hücre süspan siyonunun bir kısmının yıkama esnasında kaybedildi ği. bu nedenle hemaglütinasyon reaksiyonlarının çok zayıf olduğu veya hiç sonuç alınamadığı izlenmiştir. Bu nedenle ileri çalışmalarda Ss, Kell, Kidd, Duffy ve Lutheran eritrosit antijenleri tüp antiserumları kullanı larak mieroplate'lerde çalışılmıştır.
Tüp testte oluşan bu problem hem hücre süspan siyonunun hem de antiserum miktarının arttırılmasıy- la ortadan kaldırılabilecektir. Ancak Adli Serolojide yöntemin hassasiyeti ve spesifikliği yanında kullanılan örneğin azlığı ve maliyetin düşürülmesi önem taşı maktadır.
M ve N antijenlerinin oluşturdukları hemaglütinas yon reaksiyonların çok zayıf olması nedeniyle agliiti- nasyonlaıın çok kolay dağılabildiği izlenmiş, bu ne denle M ve N antijenleri daha hassas çalkalanabilen tüpte çalışılmıştır.
Antiserumların sulandırılması maliyetin düşürül mesi açısından önem kazanmaktadır. Bu amaçla kay naklarda önerilen sulandırıcılar SF ve BSA’dır. Bu ça lışmada antiserumların dilüe edilerek kullanılabilirliği ni araştırmak amacıyla tüp antiserumları 1/2, 1/4 ve
1/8 oranlarında SF ve BSA ile sulandırılmıştır. Antise- rumların hem SF hem de BSA ile 1/4 ve 1/8 oranla rında dilüe edildiği kuyucuklarda aglütinasyonlar ayırt edilememiştir. Antiserıımun 1/2 oranında dilüe edildi ği kuyucuklarda antiserıımun SF veya BSA ile dilüsyo- nunıın agliitinasyon sonuçlarını etkilemediği izlenmiş tir. Bu nedenle dilüsyon çalışmalarına maliyet açıdan daha uygun olan SF ile devam edilmiştir. Örnek sayı sı artırılarak devam edildiğinde, Lewis ve MN antijen lerinin gösterilebilmesi için _ oranındaki antiserum di- liisyonunun yanlış negatifliklere neden olduğu izlen in işti r( 4-7,34-37).
1/2 oranında dilüe antiserıımlarla Ss, Keli, Kicld, Duffy ve Lutheran eritrosit antijenlerinin hemaglüti nasyon reaksiyonları doğru olarak değerlendirilmiştir.
Tüp antiserumları kullanılarak yapılan microplate yönteminde Ss, Keli, Kicld, Duffy ve Lutheran eritrosit antijenlerinin gösterilmesi için uygulanan deney pro sedürü birkaç basamaktan oluşmaktadır. Eritrosit lıüc-
lll. ADLİ MİLİMLER KONGRESİ
relerinin yıkandıktan sonra spesifik antikorlarla mu amele edilerek 37°C'de inkiibasyonu. SF ile üç kez yı kanarak antikor fazlasının uzaklaştırılması ve anti-hu- man globulin ilavesi ile hemaglütinasyon reaksiyonla rının izlenmesi zaman alıcı bir uygulama olması ya nında, elle manipulasyon işlemini de artıracağından hata payını yükseltebilmektedir.
Jel test yönteminde ise, her bir antijen için ayrı ay rı hazırlanmış olan ID-kartlara sadece hazırlanan erit rosit süspansiyonu eklenerek reaksiyonlar tek basa makta gerçekleştirilmektedir. Ancak üretilen kartların kalite kontrollerinin sağlıklı yapılması ve kartların kul lanım sürelerinde kullanılması güvenilirliğin artmasın da önemli bir nokta olacaktır.
Microplate’cle yapılan deneylerde çalışılan zayıf antijenlerin çıplak gözle elde edilen sonuçları çekilen fotoğraflarda gösterilememiştir. Bu özellik nedeni ile zayıf antijenik grupların fotoğraflanarak saklanması nın microplate yönteminde başarılı olamayacağı kanı sına varılmıştır. Bu yöntemin ileri sürülen görüntüle nebilirle özelliğinin belki de bazı özel ışıklandırma sistemleri geliştirilerek gerçekleştirilebileceği düşünül müştür.
Jel testte çalışılan ID-kartların fotoğrafları başarılı sonuçlar vermiş ve bu yöntemle yapılan çalışma so nuçlarının saklanabilir olma özelliğinin yararlı olacağı düşünülmüştür.
Microplate yöntemi ile bir kan örneğinde I.e(a+) fenotipi izlenirken, jel test yönteminde Le(a-) fenol ipi izlenmiştir. Bununla birlikte; bir başka kan örneğinde microplate yöntemi ile Fy(a-) fenotipi izlenirken, jel test yöntemi ile Fy(a+) fenotipi izlenmiştir. Deneyler her iki yöntemle tekrarlandığında sonuçlarda değişik lik olmamıştır.
Bu çalışmada, çalışılan 61 kan örneğienin 55'inde jel test ve tüp test ile saptanan MN fenotipleri uyum lu bulunmuştur. Diğer 6 örneğin her iki yöntemle el de edilen fenotipleri arasında farklı fenotipler izlen miştir ve her iki yöntemle fenotipleri farklı bulunan örnekler tekrar çalışılmıştır. Yapılan tekrar çalışmasın da, tüp test yöntemi 6 örneğin Yünde I ve II. çalışma sonuçları değişmezken, jel test ile yapılan tekrar çalış masında 1. jel test çalışmasından farklı olarak tüp test ile elde edilen sonuçlarla uyumlu fenotipler izlenmiş tir. 2 örnekte ise jel test ve tüp test sonuçlarında izle nen farklılık değişmemiştir. Bu örneklerden birinde tüp yöntemi ile MM fenotipi izlenirken, aynı örneğin jel test çalışmasında M ve N antijenleri negatif bulun muştur. Tüp yöntemi ile fenotipi MN olarak saptanan diğer örnekte ise jel test yöntemi ile MM fenotipi sap tanmıştır.
Bu farklı sonuçlar eritrosit antijenlerinin Adli Sero lojide paternité ve kimliklendirmede kullanılması ba kımından tek bir yöntemin yetersiz kaldığını, çalışma ların en az iki farklı yöntemle yapılmasının gereklili ğini bir kez daha vurgulamamıza neden olmuştur.
III. ADLİ DİLİMLER KONGRHSİ
KAYNAKLAR
J. Race RR, Sanger R. Blood Groups in Man. 6 th ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1975:261- 369.
2. Dodd BE, London PJ. Blood Group Topics. 1 th ed. London: Edward-Arnold Ltd. 1975:65-90.
3. Schroder ML, Royner HL. Red Cell, Platelet and Whi te Cell Antigens. In: Lee RR, Bithell TC, Eoerster J, Athens JW, Lukens JN, eds. Wintrobe’s Clinical Ha ematology. 9 th ed. Philadelphia: Lea and Febiger Company, 1993:620-629.
4. Gaensslen RE. Sourcebook in Forensic Serology, Im munology and Biochemistry. Washington: US Go vernment Printing Office, 1984:329-34.369-87. 5. Greendyke RM, Corner JG. Introduction to Blood
Banking. New York: Medical Examination Publishing Company, 1970:75-84.
6. Grunbaum BW. Handbook for Forensic Individuali zation of Human Bloodstains. Göttingen: Sartorius GmbH, 1981:1-5.
7. Walker RH, Hoppe PA, Judd WJ. Ness P, Polesky HF, Rolih SD, Snyder EL, Vengelen-Tyler V, Ward M. Technical Manuel. 10 th ed. Arlington: American As sociation o f Blood Banks, 1990:225-29.
8. Ottenberg R. Medicolegal Application o f Human Blood Grouping. JAMA 1983; 250 (18): 2532-2535. 9. Donald M, Marcus Ml). The ABO and Lewis Blood
Group Systems. New Engl J Med Genet 1%9;280:994-1006.
10. Marsh WL, Redman CM. Recent Developments in the Kell Blood Group System. Transfusion 1987;1:4-20. 11. Marsh WL. Redman CM. The Kell Blood Group Sys
tem: A Review. Transfusion 1990;30:158-167. 12. Masouredis SP, Sudora E. Malian I.. Victoria EJ. Qu
antitative Immunoferritin Microscopy o f Fya, Fyb. Jka. I , and D ili Antigen Site Numbers on Human
Red Cells. Blood 1980;56:967-977.
1.3. Merry AH, Gardner B, Parsons SF, Anstee DJ. Estima tion of the Number of Binding Sites for a Murine Mo noclonal Anti-Lub on Human Erytrocytes. Vox Sang 1987;53:57-60.
14. Moore S, Woodrow CF, McClelland DHL Isolation of Membrane Components Associated with Human Red Cell Antigens Rh(D), ©, (E), and Fya. Nature 1982;295:529-531.
15. Parsons SF, Mallinson G,Judson PA. Anstee D|. Tan ner MSA, Daniels GL. Evidence that the Lull Blood Group Antigens in Location the Red Cell Membrane Glycoproteins o f 87 and 78 kd. Transfusion
1987;27:61-63.
1(>. Watkins WM. Biochemistry and Genetics o f ABO. Le wis and P Blood Group Systems. Adv I him Genet 1980;10:1-136.
17. Algora M. Barbolla L. Contreras M. Naturally Occu- ring Anti-D. anti-K. Anti-Fya, and Anti-Leab. Vox Sang 1991:61:1-11.
18. Arndt P. Garraty G. Evaluation o f the Optimal Incuba tion Temperature for Detecting Certain IgC Antibo dies with Potential Clinical Significance. Transfusion 1988;28:210-213.
19. Cooper ES, Ryden SE. Schimidt PJ. Walker RH. CAP
Compherensive Blood Bank Survey-1985. Arch Pat hol Lab Med 1987;111:899-903.
20. Lapierre Y, Rigal D, Adam J. Josef D,Meyer F. Greller S, Drat C. The Gel Test: A New Way to Detect Red Cell Antigen-Antibody Reactions. Transfusion 1990:30:109-113.
21. Hitzler W, Schöming-Brecker 11. Mathias I). Gel Centrifugation Test-A New Micro Method for Blood Grouping and Antibody Screening. Arzl Lab 1989;35:89-92.
22. Erbaş O, Işık E, Acar Y, Soydinç J. Onaran L. Kan Gruplarının Saptanmasında Yeni Bir Yöntem: Jel Sentrifigasyon Testi. Ant l lstTıp Bul 1991:26:147-150. 23. Altun A, Kellece L. Alper B. Salayin S. Kan Grupları nın Saptanmasında Jel Test Yöntemi. Adana: Çuku rova Üniversitesi Basımevi. 1094.
24. Plapp EV. New Techniques for Compatibility Testing. Arch Pathol Lab Med 1 9 8 9:113:262-269.
25. Warlow A, Tills D. Micromethods in Blood Group Serology. Vox Sang 1978;35:354-356.
26. Wegmann TG. Smithies O. A Simple Hemagglutina tion System Requiring Small Amounts of Red Cell and Antibodies. Transfusion 1966:6:67-73.
27. Kellece L, Altun A. Alper B. Salaçin S. Mikroplate Yöntemi ile Kan Gruplarının Saptanması. Adana: Çu kurova Üniversitesi Basımevi, 1994.
28. Holburn AM. The UK National External Quality As sessment Scheme in Blood Group Serology. ABO and D Grouping and Antibody Screening 1982-1983. Clin Lab Haemal 1986;8:243-256.
29. Cooper ES. Ryden SE. Schimitt PJ. Walker MT CAP Compherensive Blood Bank Survey-1985. Arch Pat hol Lab Med 1987:111:899-90.3.
30. Voak I), Napier CAP. Boulton FF. Conn R. Finney RD, Fraser ID. Wagstaff W. Waters AH. Wood IK. BCS1I Blood Transfusion Task I'orse. Guidelines for Microplate Techniques in Liqued-Phase Blood Gro uping and Antibody Screening. Clin Lab Haemal 1990;12:437-460.
31. Çekin N. Mikroplate Yöntemi ile Kan Gruplarının Saptanması. Tıpta Uzmanlık Tezi. Adana: Çukurova Üniversitesi, 1994.
32. Kellece L. Adli Amaçlarla Rh Eritrosit Antijenlerinin Microtyping (Mikro Tiplendirme) Yöntemlerle Feno- tiplendirilmesi. Master Tezi. Adana: Çukurova Üni versitesi, 1995.
33. Salaçin S. Kan Gruplarının Saptanmasında Kullanılan Yöntemlerin Karşılaştırılması Üzerine Bir Çalışına. Tıpta Uzmanlık Tezi. İzmir: Ege Üniversitesi. 1980. 34. Altun A. Adli Amaçlarla Lewis. Kell. Kidd. Dııffv ve
Lutheran Eritrosit Antijenlerinin Microtyping (Mikro Tiplendirme) Yöntemlerle Fenotiplendirilıııesi. Mas ter Tezi, Adana: Çukurova Üniversitesi, 1995. 33. Grindon AJ. Eska PL. Error Rate, Precision, and Ac
curacy in Immunohaematology. Transfusion 1977:17:425-430.
36. Green C. Shilling GD. Kelly J, Yap PL. Quality As surance o f Physiological Saline Used for Blood Grouping. Med Lab Sei 1986;43:364-368.
37. Severns ML. Kline LM, Epley KM. Computerized Threshold Determination for Automated ABO/Rh Tests. Vox Sang 1989;56:87-92.
IH. ADLİ BİLİMLER KONGRESİ