FENOTİPLENDİRİLMESİ
L a le D Ö N B A K * , B e h n a n A L PE R *, S e r p i l SALAÇİN***.
ÖZET
Bu çalışmada; taze kan örneklerinden Rh antijenleri tüp test, mikroplate ve jel test yöntemleri ile saptanarak, elde edi len sonuçlar karşılaştırılmış ve ayrıca hu üç yöntem hassaslık, güvenilirlik ve ekonomiklik yönünden değerlendirilmiştir.
Toplanı 76 gönüllü vericiden alınan kan örneklerinde tüp test ve mikroplate yöntemi ile aynı Rh fenotipleri sap tanmıştır. Jel test ID-kartları ile çalışılan 38 örneğin, 37’sin- de Rh fenotipleri itip ve mikroplate yöntemiyle saptanan fe- notiplerle aynı. 1 örneğin Rh lenotipi farklı bulunmuştur.
Mikrotyping yöntemlerle daha az materyalle daha has sas sonuçlar kısa sürede alınabilmekte ve sonuçlar kalıcı olarak kaydedilebilmektedir. Bu yöntemler laboratuarda meydana gelebilecek personel hatalarını en aza indirgemek tedir. Yöntemlerin hassaslık ve güvenilirlik farklılıkları nede niyle bu çalışmada; paternité araştırmalarında birbirini kont rol etmesi açısından en az iki ayrı yöntemin kullanılması ge rektiği kanısına varılmıştır.
Anahtar kelimeler: Rh kan grubu, Mierotyping yön temler. Tüp test yöntemi. Paternité araştırmaları.
GİRİŞ
Eritrosit antijenlerinin taze kan ya ela lekelerde gösterilebilmesi için kullanılan yöntemler, ilerleyen teknolojiye paralel olarak geliştirilmiştir. Son yıllarda, aglütinasyon prensibine dayanan, ancak önceki aglü- tinasyon yöntemlerinden daha hassas, daha az mater yalle çalışılabilen ve çok da pahalı olmayan mikropla te ve jel test gibi bazı mikrotyping yöntemler gelişti rilmiştir! 1-7).
Bu çalışmada; taze kan örneklerinde Rh eritrosit antijenlerinin tüp test, mikroplate ve jel test yöntemle ri ile saptanması, elde edilen sonuçların karşılaştırılma sı ve bu üç yöntemin, hassaslık, güvenilirlik ve ekono miklik yönünden değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Projeye Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu nun görüşü alınarak başlanmıştır ve proje SBE 94.2 no ile Çukurova Üniversitesi Araştırma Eonu’nun
maddi desteği ile gerçekleştirilmiştir. Kan almadan ön ce Bilgilendirme ve Rıza Formu gönüllü vericilere okutularak imzalatılmıştır. Bu çalışmada toplam 79 kan örneği tüp ve mikroplate yöntemi ile çalışırken, maddi problemler nedeniyle jel test yöntemiyle ancak 38 kan örneği çalışılabilmiştir(H).
Ayrıca tüp antiserumlarının dilüe edilebilirliğini belirlemek amacıyla, ilk 20 kan (örneğinde, 1/2, 1/4 ve 1/8 oranında serum fizyolojik ve % 3'lük bovin albu min ile dilüe edilmiş antiserıımlarla çalışı!mıştır(8).
BULGULAR ve TARTIŞMA
76 kan örneğinde saptanan Rh fenotipleri Tablo l'de sunulmuştur.
Tablo T 76 k a n ö rn e ğ in d e sa p ta n a n Rh fe n o tip le ri.
Rh fenotipleri Örnek sayısı %
dccee 5 6.38 dCcee 2 2.63 DCcee 28 36.84 DccEE 3 3.93 DCCee 18 23.68 DCcEe 12 13.79 Dccee 2 2.63 DccEe 6 7.90 Toplam 76 100
76 kan örneğinde, tüp ve mikroplate yöntemleri ile aynı Rh fenotipleri izlenirken, jel test yöntemi ile çalışılan 38 örneğin 36’sında tüp ve mikroplate yön temleri ile aynı Rh fenotipleri saptanmıştır. İlk deney lerde tüp ve mikroplate sonuçları ile jel test sonuçla rının farklı bulunduğu 2 örnekten, 94/3 protokol no- lu örnekte; tüp ve mikroplate yöntemi ile Rh Lenotipi DccEe olarak saptanırken, jel testle çalışıldığında d— e2+ sonucu alınmıştır. Bu örnekle yapılan ikinci jel test çalışmasında DccEe lenotipi elde edilmiştir. 94/6 pro tokol nolıı örnekte ise; tüp ve mikroplate yöntemiyle
* Ç u ku ro va (b ıire rsile si Ttp F akültesi A d li Tıp A ııa b iliın Dcılı B a lca lt/‘ADANA ** D o ku z E y lü l Üniversitesi Tıp F akültesi A c ili Tıp A ııa b iliın D a lı. İZM İR
III. ADLİ BİLİMLER KONGRESİ
Resim I 94/5 protokol tu Ait örneğin tiip yöntemi ile ehle edilen sonuçlan.
Resim 2. 94/5 protokol nolıt örneğin mikroplute yöntemi ile elde edilen sonuçları
Resim 4. 94/5 protokol ııolıı örneğin AHO/Rb k a ili He Yapı lan II. çalışına sonucu
Resim 5. 94/5 protokol ııolıı örneğin Rb/Kell karlı ile Yapı lan I ve II. çalışına sonuçlan.
Rh fenotipi DCcEe olarak, jel test ile çalışıldığındaysa DccEe sonucu alınmıştır. ID-kartların kısıtlı sayıda ol ması nedeniyle hu örnekle ikinci jel test çalışması ya pılamamıştır. Resim 1 ve 2 de 94/5 protokol nolu ör neğin tüp ve mikroplate yöntemi ile elde edilen çalış ma sonuçları, Resim 3, 4 ve 5'de hu örneğin jel test ile yapılan I. ve II. çalışma sonuçları görülmektedir.
Jel testin çok az miktarlardaki materyallerde dahi zayıf antijenik özellikleri oıtaya koyabilecek kadar has sas olduğu bildirilmektedir. Bu durum çeşitli kantitatif varyantları tanımlanmış olan Rh antijenlerinin ve diğer zayıf antijenik yapıdaki subgrupların incelenmesinde paternité tayininde bir avantaj olacaktır!2.3,9.10).
Bu çalışmada jel test ID-karllan ile fenotiplendiıi- len 38 örneğin sadece birinde, c antijeni zayıf antije nik özellik göstermiş ve 2+ şeklinde değerlendirilmiş tir. Diğer örneklerde tüm pozitif reaksiyonların aglüti- nasyon dereceleri 4+ olarak izlenmiştir.
Resim .-J. 94/5 protokol nolıı örneğin ABO/Rh kartı ile yapı lan I çalışına soımcıı.
Tüp antisemmu dilüsyon oranlarının karşılaştırıldı ğı deneylerde ancak dilüe edilmemiş antiserum kulla nılması ile diğer yöntemlerle aynı sonuçlar alınabilmiş ve ayrıca dilüsyonda kullanılan solüsyonun bu yönte min sonuçlarını etkilemediği saptanmıştır. Mikroplate yöntemi için yapılan ön çalışmalarda antiserumların 1/4 oranında sulandırılmasının test sonuçlarını etkile mediği saptanmıştır. Bu sulandırma işlemi kan grupla rının saptanmasındaki maliyetin en önemli bölümünü oluşturan antiserum harcanma miktarını azaltacağın dan yöntemin daha ekonomik olmasını sağlamaktadır. Jel test yöntemi standartlaştırılmış olduğundan, bu yöntemle çalışmak istendiğinde ID-kartlar, gerekli so lüsyonlar ve diğer gereçlerin set halinde alınması ge rekmektedir. Bu nedenle jel testin ekonomikliği, kul lanılacak merkezin büyüklüğüne, gelirine ve kullanım amacına bağlı olacaktır. Diğer taraftan çok sayıda tüp kullanımı yerine tek bir plate ya da jel test ID kartla rının kullanımı, gerek etiketleme gerekse sonuçların değerlendirilmesi ve fotoğraflanması açısından kolay lık sağlamaktadır! 3,8,11).
Çeşitli araştırıcıların yaptıkları çalışmalarda, yön tem karşılaştırmalarında izlenen fenotiplendirme fark lılıklarının. tekniklerin uygulanmasındaki hatalardan veya kullanılan yöntemlerin hassaslık ve güvenilirlik farkından kaynaklandığı bildirilmektedir!2,9,12,1.3).
Adli Seroloji laboratuvarlarında kullanılacak yön temler hassas ve güvenilir olmalı, ayrıca sonuçların fo- loğraflanarak kaydedilmesine olanak tanımalıdır. Yöntemin ekonomik olması ise ilave üstünlük sağla yacaktır. Aranan bu özellikleri sağlamak amacıyla planlanan bu çalışmada kullanılan mikroplate ve jel test, görüntülenebilirle üstünlüğü olan yöntemlerdir. Diğer taraftan jel test, meydana gelebilecek personel hatalarını en aza indirgemektedir. Bu yöntemde labo- ratuvarda yanlızca eritrosit süspansiyonu hazırlan- maktadır. Sonuçlar santrifügasyondan sonra net ola rak okıınabilmektedir. Mikrotüpler ve içindeki antise- rıımlur eğer uygun kalite kontrol sistemleri ve aktivi- te kontrol sistemleri ile hazırlanarak üretilmişse ve mi adında kullanılıyor ise, zayıf antijenik yapıların net olarak görülebilmesi nedeniyle test sonuçları daha da güvenilir olacaktır!2,3,9,14-16).
Çalışma sonunda, yöntemlerin hassaslık ve güve nilirlik farklılıkları nedeniyle paternité araştırmaların da tek bir yöntemle çalışılması yerine, birbirini kont rol etmesi açısından en az iki ayrı yöntemin kullanıl ması gerektiği kanısına varılmıştır.
KAYNAKLAR
1. Crawford MN. Gottman FE, Gottman CA. Microp- late system for routine use in blood bank labora
nt. ADLİ DİLİMLER KONGRESİ
tories. Transfusion 1970; 10:238-26.3.
2. Hitzier W, Schöming-Breckner H, Mathias D. Gel centrifugation test-A new micro method for blo od group typing and antibody screening. Arztl Lab 1989; 33:89-92.
3. Lapierre Y, Rigal D. Adam J, Josef D. Meyer F, Greber S, Drat C. The gel test: A new way to de tect red cell antigen-antibody reactions. Transfu sion 199«; 30:109-113.
-i. Plapp FV. New techniques for compatibility tes ting. Arclt Pathol Lab Med 1989; 11.3:262-269. 3. Warlow A, Tills D. Micromethods in blood group
serology. Vox Sang 1978; 35:354-336.
6. Wegmann TG, Smithies O. Improvement of the microtiter hemagglutination method. Transfusion
1968; 8:47.
7. Wegmann TG, Smithies O. A simple hemaggluti nation system requiring small amounts of red cell and antibodies. Transfusion 1966; 6:67-73- 8. Kellece L. Adli amaçlarla Rh eritrosit antijenleri
nin mikrotyping (mikro tiplendirme) yöntemler le fenotiplendirilmesi. Master Tezi, Çukurova Üniversitesi, Adana, 1995.
9. Erbaş O, İşık E, Acar N, Soydinç J. Onaran L. Kan gruplarının saptanmasında yeni bir yöntem: Jel sentrifügasyon testi. Ank Hst Tıp Bül 1991: 26:. 147-150.
10. Schönitzer D. The impact of the gel test in routi ne work. Est International Symposium "Present and Future o f the Gel Test" Montreux, 1994. 11. Voak D, Napier JAF, Boulton FE, Conn R, Finney
RD, Fraser ID, Wagstaff W, Waters AH, Wood JK. Guidelines for microplate techniques in liquid- phase blood grouping and antibody screening. Clin Lab Haemat 1990; 12:437-460.
12. Ege B, Salaçin S. Kan gruplarının saptanmasında iki laikli tekniğin sonuçlarının karşılaştırılması. EÜ Ege Tıp Fak Derg 1982; 21:29-40.
13. Salaçin S. Kan gruplarının saptanmasında kulla nılan yöntemlerin karşılaştırılması üzerine bir ça lışma. Uzmanlık tezi, Ege Üniversitesi, İzmir, 1980.
14. Alttın A. Kellece L, Alper B, Salaçin S. Kan grup larının saptanmasında jel test (Plıast Gel) Yönte mi. 1. adli Bilimler Kongresi, Adana. Türkiye. 12-
15 Nisan, 1994.
15. Grıınbaıım BW. Handbook for Forensic Indiv idu alization of Human Bloodstains. Göttingen: Sar- toriuss GmbH. 1981: 160-176.
16. Kellece L, Altım A. Alper B, Salaçin S. Mikroplate yöntemi ile kan gruplarının saptanması. I. Adli Bilimler Kongresi, Adana, Türkiye,12-15 Nisan. 1994.
P45
111. ADI.İ BİLİMLER KONGRESİ