B. Terimleşme Süreci ve Literatürdeki Yeri
2. Müçtehit İmamlar Dönemi
A insulinemia destas cadelas, por sua vez, apresentou dois picos, sendo um deles de 3,7 uU/ml aos 10 dias e o outro de 3,83 uU/ml aos 40 dias p.o. Já os seus menores valores foram observados aos 20 e aos 60 dias p.o. (1,4 e 1,2 uU/ml respectivamente), sendo que a insulinemia dos outros grupos flutuou entre estes valores mencionados (Figura 3).
Houve grande variação dos valores insulinêmicos das cadelas do grupo de 40 dias.
0 2 4 6 8 10 20 30 40 50 60 70 Dias pós ovulação Insulinemia (uU/ml)
Figura 3: Insulinemia de cadelas sadias ao longo do diestro (de 10 a 70 dias pós a ovulação). Os valores representam ⎯x ± DP (n= 4/ grupo). a significa que não houve diferença estatisticamente significativa entre todos os grupos.
a
a
A glicemia das cadelas pós jejum mostrou-se muito semelhantes em todos os grupos, com valores de aproximadamente 80 mg/ml, apresentando um único e pequeno pico de 90 mg/ml aos 40 dias pós ovulação (Figura 4).
Neste caso também encontramos variações entre os valores obtidos dentro de um mesmo grupo, e isso ocorreu de maneira mais significativa aos 20, 40 e 50 dias p.o.
0 20 40 60 80 100 120 10 20 30 40 50 60 70 Dias pós ovulação Glicemia (mg/dl)
Figura 4: Expressão da glicemia de cadelas sadias ao longo do diestro (de 10 a 70 dias pós a ovulação). Os valores representam ⎯x ± DP (n= 4/ grupo). a significa que não houve diferença estatisticamente significativa entre todos os grupos.
a
No índice Homa (glicemia x insulina % 22,5) as cadelas de todos os grupos foram reorganizadas de modo a introduzirem-se da melhor maneira possível nos grupos de 25, 40, 55 e 70 dias pós a ovulação. Assim como ocorrido na glicemia, o pico (0,89) neste caso também ocorreu aos 40 dias p.o., em quanto que os demais grupos apresentaram-se muito semelhantes, com valores em torno de 0,35 (Figura 5). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 25 (n=6) 40 (n=4) 55 (n=5) 70 (n=4) Dias pós ovulação I (uU/mL) * G (mmol/L)
Figura 5: Expressão do HOMA (insulina x glicose % 22,5) de cadelas sadias ao longo do diestro (25, 40, 55 e 70 dias pós a ovulação). Os valores representam ⎯x ± DP (n= 4/ grupo). a significa que não houve diferença estatisticamente significativa entre todos os grupos.
a
a a
5.3 PCR tempo real 5.3.1 GLUT4
Através do método de PCR tempo real foi evidenciada a presença de mRNA de GLUT 4 nos corpos lúteos de todas as cadelas do experimento, dentro de todos os grupos entre 10 e 70 dias pós a ovulação. O mRNA do GLUT4 em corpo lúteo teve seus menores valores de expressão aos 10, 30 e 40 dias p.o., sendo eles de aproximadamente 4,5 UA, e apresentou seu pico de expressão (de 15,55 UA) aos 50 dias (p<0,05). (Figura 6)
Figura 6: Expressão do GLUT4 mRNA em corpo lúteo de cadelas sadias ao longo do diestro (de 10 a 70 dias pós a ovulação). Os valores representam ⎯x ± DP (n= 4/ grupo). a, b, ab: Letras diferentes significam diferença estatisticamente significativa entre o grupo de 50 dias pós ovulação e todos os demais grupos.
10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 E x p res s ã o rel a ti v a do m R N A do G L U T -4 ( U A ) a a a b a ab ab
5.3.2 HIF-1
Através do método de PCR tempo real também foi evidenciada a presença de mRNA de HIF-1 nos corpos lúteos de todas as cadelas do experimento, dentro de todos os grupos entre 10 e 70 dias pós a ovulação. O HIF-1 apresentou valores de expressão de seu mRNA muito semelhantes (0,3 UA) em todos os grupos, com exceção dos grupos 10 e 40 dias p.o., que foram representados com valores de 0,2 UA (Figura 7).
Figura 7: Expressão do HIF-1 mRNA em corpo lúteo de cadelas sadias ao longo do diestro (de 10 a 70 dias pós a ovulação). Os valores representam ⎯x ± DP (n= 4/ grupo). a, b: Letras diferentes significam diferença estatisticamente significativa entre os grupos de 10 e 40 dias pós ovulação e todos os demais grupos.
10 20 30 40 50 60 70 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 E x pr es s ã o rel at iv a d o m R N A do H IF -1al p ha ( U A ) a a b b b b b
5.4 GLUT4 pela técnica Western blotting
Não foi evidenciada a presença da proteína GLUT 4 nos corpos lúteos de nenhuma das cadelas dos grupos entre 10 e 70 dias após a ovulação.
6 DISCUSSÃO
A presença do transportador de glicose GLUT 4 ainda não havia sido evidenciada em corpo lúteo até o presente momento, o que confere ineditismo ao trabalho apresentado. O significado funcional da expressão do mRNA deste transportador em tecido luteínico aponta para uma provável sensibilidade do corpo lúteo a ação da insulina, uma vez que a proteína deste transportador é translocada para membrana plasmática para transportar glicose quando a insulina se liga a seus receptores (IR) presentes na membrana de células alvo. As correlações apresentadas entre a expressão do GLUT 4 e a do HIF-1α, bem como com os hormônios sexuais progesterona e estradiol-17β e parâmetros metabólicos (glicemia e insulinemia) permitiram que um panorama mais abrangente pudesse ser visualizado em relação ao transporte de glicose no CL.
Outras técnicas, como o Western e Northern blotting, as quais quantificam a expressão de proteínas e mRNA, respectivamente, não evidenciaram a presença de GLUT 4 nos mesmos animais utilizados. É importante salientar que muitos autores encontram dificuldades com a técnica de Western blot para a detecção das proteínas GLUT, entre os problemas encontrados estão: bandas não específicas, dificultando sua identificação pelos soros não-imunes (WAGSTAFF et al., 1995); necessidade em usar anticorpos policlonais, que diminuem a especificidade do teste (HABER et al., 1993; HOCQUETTE et al., 1996), podendo dosar uma proteína similar ao GLUT como sendo efetivamente um GLUT 1 (ZHAO et al. , 1996) ou GLUT 4 (BALAGE et al., 1997). Paarman (comunicação pessoal) estudando a expressão do mRNA do GLUT4 nos corpos lúteos das mesmas cadelas deste trabalho, também não evidenciou a presença do mesmo através do Northen blotting.
Outros autores também pesquisaram GLUT 4 em tecido ovariano e não o encontraram, como foi observado por Kodaman e Behrman (1999) em células da granulosa de ratas também por análise de Western blot; e Zhou et al. (2000) em oócitos e folículos de camundongo pela técnica de imunohistoquímica.
Porém este trabalho evidenciou a expressão relativa do mRNA do GLUT4 no corpo lúteo de cadelas em todo o diestro pelo método de PCR em tempo real. Sugai et al. (2004), pelo mesmo método, não o detectaram em corpo lúteo de vacas. Em contrapartida, o GLUT 4 já foi evidenciado em células da teca e granulosa de ovário de ovelha (WILLIAMS et al., 2001) e em células de ovário de Hamster chinês, in vitro, (BOGAN et al., 2001, 2003). Tais diferenças podem estar ligadas às diferenças entre as espécies, envolvendo aspectos fisiológicos e nutricionais, mas também diferenças de expressão dependentes do estágio do ciclo reprodutivo.
Royer et al. (2000) descreveram que, em condições de hipóxia, há um aumento do GLUT4 na membrana citoplasmática do músculo esquelético de ratos adultos, levando a uma rápida captação de glicose. Os mesmos autores ainda demonstraram que a hipóxia gestacional leva a uma expressão aumentada do mRNA do GLUT4, e que o aumento concomitante do GLUT4 e do HIF-1α em resposta a hipóxia gestacional sugerem a hipótese do envolvimento do HIF-1α na regulação dos genes transportadores de glicose. Porém, neste trabalho não houve correlação significativa entre a expressão do GLUT4 e do HIF-1α. Mas Royer trabalhou com outro tipo de animal, o rato, e em um tecido muito distinto, o cérebro. O fato da hipóxia regular positivamente a expressão do GLUT4 em tecidos que captam glicose em abundancia, como cérebro e músculos esqueléticos, pode não se aplicar a tecidos periféricos como o CL. Além disso, a variabilidade encontrada em relação a transporte de glicose em animais como o cão é evidentemente maior do que as encontradas em animais de laboratório.
A glicose é predominantemente absorvida pelos tecidos sensíveis à insulina (músculos e tecido adiposo) através de difusão facilitada pelos transportadores de glicose transmembrânicos, principalmente pelo GLUT 4, que é altamente ativado durante o exercício ou pela presença da insulina (HOCQUETTE et al., 1998). Nos resultados deste trabalho, utilizando corpos lúteos, pode-se inferir sobre um transporte de glicose realizado pelo GLUT 4: esse fato evidenciou-se no grupo de 40 dias pós ovulação, no qual foi obtido o maior valor de glicemia, e este fato coincidiu com o menor valor de expressão do GLUT4, ou seja, na ausência de transportadores, a glicemia tende a ficar mais alta, embora uma correlação negativa significativa entre os valores da glicemia com a expressão do GLUT4 encontrados neste trabalho não foi obtida.
Segundo Li et al. (2004) condição de hiperglicemia pode regular a função dos transportadores de glicose, os quais sofrem uma internalização celular, diminuindo sua expressão. Sivitz et al. (1989) observaram um drástico declínio nos níveis de mRNA do GLUT4 em tecido adiposo quando do jejum; e em 1990 demonstraram que a glicemia não influencia a expressão do mRNA do GLUT4 in vivo, e o mesmo fato foi observado por nós, quando não encontramos correlação entre os níveis de glicemia e a expressão do GLUT4. Mas os mesmos sugerem que a insulina seja o maior fator regulatório dos níveis do mRNA do GLUT4 no tecido adiposo, fato não observado neste trabalho quando não estabeleceu-se correlação entre os níveis de insulina e a expressão do GLUT4.
Segundo Piper et al. (1991) e Rea e James (1997), o mecanismo de captação de glicose em músculo e tecido adiposo é dependente da transmissão do sinal insulínico. E isso faz com que aumento da glicemia leve a um rápido aumento da insulinemia, a qual induz translocação do GLUT4 para que este capte a glicose circulante e a introduza nas células dos tecidos insulino- sensíveis. Isso também foi observado aqui, quando utilizamos corpos lúteos, e obtivemos os maiores valores de glicemia e insulinemia coincidindo no mesmo período, aos 40 dias p.o.
O índice HOMA, descrito por Matthews et al. (1985) pode ser calculado para a estimativa da resistência insulínica, na qual HOMA-RI = insulinemia de jejum (mU/L) x glicemia de jejum (mmol/L)/22,5. Quanto mais alto o índice HOMA, menos este animal é sensível à insulina (OLIVEIRA et al., 2005), ou seja, mais resistente à ela. O mesmo foi observado por nós, pois assim como a insulinemia e a glicemia, o índice HOMA também obteve seus maiores valores 40 dias p.o., momento em que obtiveram-se os menores valores de expressão de GLUT4. Quando o índice HOMA apresenta-se alto ocorre resistência insulínica, aqui expressa nos baixos valores de transportadores de glicose. Para Shepherd e Kahn (1999) redução na expressão de GLUT4 no tecido adiposo associa-se com o desencolvimento da resistência insulínica. Isso mostra também que o ovário se comporta como um tecido insulino-sensível.
Quanto a progesterona e o estradiol, ambos seguiram um padrão para o diestro, ou seja, progesterona com pico aos 20 dias e após isso queda gradativa até o final do diestro,
concomitantemente com o aumento gradativo do estradiol desde o início do diestro, assim como relatado por Feldman e Nelson (1987). .
Segundo Concannon et al. (1980), Eigenmann (1984) e Selman et al. (1994) a progesterona atua na resistência insulínica pois diminui o transporte da glicose para os tecidos. Isso também foi por nós visto, quando aos 20 dias p.o. houve pico de progesterona plasmática coincidente com baixa expressão de GLUT4, e queda dos níveis de progesterona, principalmente no final do diestro, período de maiores valores de expressão do GLUT4, principalmente aos 50 dias p.o. Campbell & Febbraio (2002) demonstraram em seus estudos com ratos ovariectomizados valores de insulina plasmática elevados quando estes eram tratados com progesterona. No presente trabalho, insulinemia e progesterona plasmática não apresentaram correlação significativa, apesar dos dados sugerirem o mesmo observado pelos autores acima citados.
Sugaya et al. (2000) demonstraram que o estradiol e a progesterona estão envolvidos na regulação da expressão do mRNA do GLUT4 no tecido adiposo, pois este sofre uma redução significativa na presença do estradiol, e que isso não ocorre da mesma maneira com a progesterona (SUGAYA et al., 1999). Para Barros et al. (2006a) o estradiol participa na homeostasia da glicose pela modulação da expressão dos genes que estão envolvidos na sensibilidade à insulina e na captação de glicose. Porém não conseguimos evidenciar correlação entre estes e o GLUT4.
Nossos dados sugerem um novo mecanismo de transporte utilizado pelas células do CL para realização de suas funções e ainda que estas células responderiam positivamente a ação da insulina. Dados de expressão protéica bem como experimentos funcionais seriam necessários para confirmação destas suposições.
7 CONCLUSÕES
- O mRNA do GLUT 4 está presente no CL ao longo do diestro e sofre regulação de acordo com a fase observada;
- O HIF-1α não está positivamente correlacionado à expressão do GLUT 4 ao longo do diestro em corpo lúteo de cadelas;
- Índices metabólicos e hormonais não estão diretamente relacionados à expressão do GLUT 4 em CL de cadelas ao longo do diestro.
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