2.1 Kavram Yanılgılarının Belirlenmesi
2.1.5 Kuvvet Kavram Testi
Realizou-se uma dupla marcação das CTM . O núcleo foi marcado com DAPI e o citoplasma foi marcado com Qdot, um nanocristal que emite fluorescência e precisa de um peptídeo alvo para entrar na célula. Por isso, se ocorrer morte celular durante o processo de transplante as células marcadas com DAPI e Qdots podem liberar ambos no tecido hospedeiro, mas para o Qdot marcar células hospedeiras é preciso que existam peptídeos alvos neste meio, o que não ocorre.
Duas semanas após o transplante, o tecido retiniano lesado pelo Nd-YAG laser foi processado da mesma forma que anteriormente. Neste tempo é esperado que a maioria das células ainda se encontre no espaço vítreo, com pouca integração. Foi feita, então, uma coloração por Hematoxilina e Eosina em alguns cortes (fig. 7A e B) para avaliar a morfologia, e outros foram simplesmente processados a fresco para localização das células transplantadas no tecido por meio de sua fluorescência (fig. 7C e D).
Figura 7- Migração das CTM marcadas com DAPI e Qdot, duas semanas
apos o transplante. Nas figuras 7A e B, coradas por HE pode ser observada uma
desorganização no tecido retiniano pela lesão induzida (setas). Pode-se observar também um grupo de células adjacentes. É difícil precisar se são células do tecido ou se são CTM que estão migrando em direção a essa lesão (asteriscos), por eventual trofismo. Nas figuras 7C e D é verificado também que neste grupo de células existem células duplamente marcadas com DAPI e Qdot (azul e rosa, respectivamente) confirmando a hipótese de que estas são mesmo as células transplantadas. No entanto, as células do tecido retiniano já se encontram marcadas com DAPI (azul) figs. 7C e D, mas não com Qdot (rosa). Isso indica que realmente está havendo transferência do corante DAPI de células mortas transplantadas para células residentes do tecido.
A AP assay 0.075 0.1000.125 GFP- BMMSCBMMSCGFP- ATMSCATMSC 595nm B C D
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A B D C6. DISCUSSÃO
Existem várias doenças degenerativas da retina, como a retinose pigmentar e outras distrofias, que podem evoluir com acentuada baixa de acuidade visual (HARTONG, et al, 2006; GOODWIN P, 2008). Embora se procure prevenir ou retardar o processo degenerativo, os resultados dessas medidas ainda são muito limitados. A possibilidade do uso de células-tronco com esta finalidade despertou grande interesse e ensejou pesquisas científicas para avaliar seu real alcance e limitações.
As células-tronco vêm sendo estudadas por meio de vários modelos experimentais. O modelo experimental utilizado neste experimento mostrou-se de fácil execução e boa reprodutibilidade. Optou-se por realizar o trabalho em ratos Wistar pelo fato destes animais serem facilmente mantidos em biotério em grande quantidade e serem isogênicos, ou seja, o material genético dos ratos doadores é idêntico ao material genético dos animais receptores - o que descarta a possibilidade de rejeição às células injetadas e torna desnecessário o uso de imunossupressores.
Alguns estudos (TOMITA, et al 2002, COLES, et al., 2004), sugerem o uso de agulha de insulina para indução da lesão na retina. Inicialmente, no presente estudo, as lesões retinianas foram induzidas com agulha de insulina, por via pars plana. Entretanto, a baixa reprodutibilidade das lesões criadas nos fez abandonar este método de indução de lesão. Foi aventada a hipótese de realizar as lesões retinianas utilizando laser de argônio, mas devido ao fato dos ratos serem albinos (EPR não pigmentado), além da lesão pelo laser de argônio teoricamente não ser profundamente destrutiva, foi abortada a idéia de realizar este método de lesão.
As lesões foram induzidas com YAG laser, pela obtenção de trauma retiniano de espessura total, em região peripapilar, utilizando-se lente de 3 espelhos de Goldman. O padrão de lesão induzida foi muito similar em todos os animais
estudados, razão pela qual este modelo foi selecionado para a realização deste estudo.
Além do tipo celular a ser utilizado, outra questão a ser estudada é a via preferencial de transplante das células-tronco para dentro do olho. As principais vias são a intravítrea e a sub-retiniana. Ambas são amplamente descritas na literatura. O implante sub-retiniano de células-tronco necessita de vitrectomia prévia, com a indução de descolamento localizado da retina sensorial para injeção das células. A injeção intravítrea é um procedimento menos invasivo e com menor risco de complicações (JAISSLE, et al, 2005), razão pela qual se escolheu esta via de administração de células-tronco.
Diferentes estudos publicados têm mostrado diferentes resultados quanto à migração, incorporação e diferenciação das CTM no tecido retiniano. Embora tenha sido demonstrado que o transplante de células-tronco possa sobreviver na retina receptora (KLASSEN, 2007), integrar-se às várias camadas da retina e estabelecer sinapses com as células receptoras, o seu uso para substituir/renovar fotorreceptores parece ainda ser limitado. De fato, vários estudos sugerem que não há integração de células doadoras na camada nuclear externa e que as células- tronco não se diferenciam em fotorreceptores (PRESSMAR, et al., 2001; VAN HOFFELEN, et al., 2003; MEYER, et al., 2006; CANOLA, et al., 2007).
Algumas células expressando marcadores específicos de fotorreceptores foram detectadas em estudos após transplante sub-retiniano (KWAN, et al., 1999; QIU, et al., 2005)e intravítreo (COLES, et al., 2004) de células-tronco. Entretanto, nestes estudos, não se demonstrou, que as células transplantadas desenvolveram um aspecto morfológico típico de fotorreceptores maduros.
CTM estão aptas a se diferenciar em fotorreceptores in vitro e in vivo. Nesse estudo, sob condições de cultura específicas, as CTM se diferenciaram em fotorreceptores em oito a dez dias, in vitro. Esses autores demonstraram também, in vivo, que houve diferenciação das CTM em fotorreceptores, duas semanas após transplante de CTM em ratos portadores de distrofias retinianas.
No presente estudo observou-se que com duas semanas de transplante havia alguma migração celular em direção ao sítio da lesão. Um maior número de células havia migrado para a retina quatro semanas após a injeção das células-tronco. Ao final de oito semanas a maioria das células injetadas encontrava-se na retina receptora.
A sobrevivência celular com duração de alguns meses foi observada em estudos prévios. De fato, Warfvinge et al (2005) e Klassen et al (2007), em trabalho utilizando porcos, observaram que as células podem sobreviver por até cinco semanas após o transplante. Em trabalho mais recente, em porcos GFP, KLASSEN et al., 2008 descreveram que as células transplantadas sobreviveram por até 10 semanas após o transplante e sugeriram que esta maior sobrevida era devida à utilização de células alogênicas GFP+ como doadoras.
Neste estudo, os resultados obtidos por imunohistoquímica realizados após oito semanas de injeção das CTM na cavidade vítrea sugeriram que , se as células transplantadas (CTM) estão co-expressando marcadores específicos de células retinianas elas teriam se diferenciado em neurônios retinianos.
Analisando-se as imagens de imunohistoquímica observa-se que toda a camada da retina que contém os fotorreceptores, se encontrava marcada, ou seja, seus núcleos estavam marcados com DAPI e suas membranas estavam marcadas com anticorpo anti-rodopsina, sugerindo que todas essas células poderiam ser as
células transplantadas (CTM) que já teriam, assim, se diferenciado em bastonetes e estavam produzindo rodopsina.
Na análise desses resultados devem ser considerados alguns fatos relevantes. Inicialmente, consideramos que teria ocorrido diferenciação das células injetadas em células das camadas específicas da retina. Esses resultados - aparentemente contundentes - sugeriam que uma análise cuidadosa necessitava ser implementada para verificar eventuais limitações metodológicas. De fato, estudos publicados após estas nossas observações (BURNS et al., 2006) vieram esclarecer algumas destas limitações. Nesse estudo os autores relataram que no momento do transplante, muitas células transplantadas morrem (por diferenças no micro- ambiente ou por agressões físicas), e que neste momento liberam a substância química que estava sendo usada na sua marcação (como DAPI, timidina, BrDU, iodeto de propídeo, e muitos outros marcadores que usam o mesmo principio de marcação, ou seja, captação ativa da substância pela célula em cultivo). Essa substância, no caso o DAPI, livre no micro-ambiente hospedeiro é ativamente captada pelas células residentes neste local. Este evento, que ocorre in vivo, demonstra uma importante limitação de experimentos que utilizam tais corantes como marcadores, já que células normalmente residentes no tecido podem se tornar marcadas e sendo assim, confundidas com células transplantadas, o que caracterizaria um falso positivo (BURNS et al., 2006).
Os resultados observados neste estudo demonstraram que, de fato, o uso desses corantes apresentam estas limitações. Os resultados do nosso estudo bem como as observações de BURNS et al., 2006, sugeriram que a difusão do corante era um fator que precisava ser considerado e se possível eliminado, permitindo assim a melhor identificação das CTM que migraram.
Embora o DAPI seja extensivamente utilizado para marcação de células- tronco, uma falsa marcação celular pode produzir resultados pouco confiáveis, já que a marcação adequada das células-tronco é um passo indispensável na validação de qualquer terapia celular baseada em propriedades de diferenciação.
O corante fluorescente azul, DAPI, liga-se à cadeia dupla de DNA da célula (BARCELLONA e GRATTON, 1989; BARCELLONA e GRATTON, 1990; KAPUSCINSKI, 1995) para formar um complexo que fluoresce 20 vezes mais que o DAPI isoladamente. Embora o corante seja impermeável às células, altas concentrações penetram em células vivas. O DAPI é um corante popularmente utilizado em técnicas fluorescentes multicoloridas, hibridização in situ do RNAm e experimentos celulares in vivo.
Corantes fluorescentes podem extravasar das células marcadas e “contaminar” células adjacentes. A marcação celular sem alterar sua morfologia ou função é um fator crítico na investigação do comportamento celular, crescimento, migração e diferenciação. Por estas razões, pesquisadores estão sempre procurando marcadores que sejam estáveis, não-tóxicos e que não sejam transmitidos de célula à célula em experimentos in vivo e in vitro.
Para provar a hipótese de difusão do DAPI para células adjacentes, foi feito um experimento controle. Neste, foi realizada uma dupla marcação das CTM. O núcleo foi marcado com DAPI e o citoplasma foi marcado com Qdot, um nanocristal, marcador citoplasmático, que emite fluorescência e precisa de um peptídeo alvo para entrar na célula (MULLER-BORER et al., 2007; SHAH et al., 2007; SOLANKI et al., 2008; FERREIRA et al., 2008). Este peptídeo, que normalmente não está presente nos tecidos oculares, é adicionado durante o preparo da marcação das células-tronco. Por isso, caso ocorra morte celular durante o processo de transplante
das células marcadas com DAPI e Qdots, pode haver liberação de ambos no tecido hospedeiro. Entretanto, para o Qdot marcar células hospedeiras é preciso que existam peptídeos alvos neste meio, o que não ocorre. Ou seja, o QuantumDot só pode ser incluído dentro das células através de um peptídeo, e não pode ser transferido de uma célula para outra.
Neste último experimento, duas semanas após o transplante, o tecido retiniano também lesado por Nd-YAG laser, foi processado como no experimento anterior. Foi feita, então, uma coloração por HE em alguns cortes (fig. 8A e B) para avaliar a morfologia, e outros foram simplesmente processados a fresco para localização das células transplantadas no tecido através de sua fluorescência (fig. 8C e D). Observou-se que as células coradas pelo QuantumDot (rosa) haviam migrado em direção a lesão, mas um número muito maior de células estava corado em azul (DAPI), o que confirma a difusão do DAPI para células adjacentes.
Vários marcadores tem sido utilizados para marcação de células-tronco antes do transplante. Os principais marcadores são análogos de timidina, como o 5-bromo- 2-deoxiuridina, DAPI, iododeoxiuridina, e timidina tritiada. Alguns estudos mostram que estes marcadores permitem a identificação adequada das células transplantadas. (LIMB, et al, 2006; VEMUGANTI, et al, 2006; KAN, et al, 2007). Entretanto, como descrito por trabalhos recentes, a difusão dos corantes, assim como a captação e incorporação destes pelas células receptoras limitam o seu uso. Tais corantes tendem a ser perdidos em situações em que há divisão celular das células doadoras, e em casos em que seja necessário avaliar detalhes da morfologia celular (KLASSEN et al., 2008). O presente estudo demonstra a limitação da utilização de corantes que se difundem, como o DAPI, quando utilizados isoladamente. A utilização de outros marcadores, como o QDot utilizado neste
estudo, parece ser fundamental para uma melhor avaliação do comportamento das células-tronco.
Em síntese, o presente estudo mostrou que o modelo experimental desenvolvido é útil para estudos envolvendo transplante de células-tronco mesenquimais. Entre as vantagens deste modelo incluem-se:
1. A facilidade de obtenção, manuseio e baixo custo dos animais;
2. A utilização de ratos albinos isogênicos favorece o mesmo padrão de resposta biológica, minimizando assim a ocorrência de respostas diferentes secundárias a peculiaridades individuais;
3. Os parâmetros para a indução da lesão produzida pelo YAG-laser podem ser precisamente selecionados, de forma a tornar as lesões mais reprodutíveis, de acordo com os padrões pré-estabelecidos;
4. A indução da lesão por meio de procedimento não-invasivo reduz o risco de infecção, que não é infreqüente com os procedimentos mecanicamente produzidos por agulha.
Ao iniciarmos este estudo o DAPI vinha sendo amplamente utilizado para estudar a integração e diferenciação das CTM transplantadas. Este estudo, assim como outros recentemente publicados, demonstraram que a difusão do DAPI limita grandemente a análise dos resultados observados quando ele é utilizado como marcador de células-tronco. Este fato explica inequivocamente resultados aparentemente discrepantes de diferentes trabalhos publicados na literatura. Embora algumas CTM possam ter sido incorporadas e ter experimentado diferenciação, os métodos utilizados não permitem esta conclusão.
Este estudo mostrou que, nas condições do experimento, as CTM obtidas da medula óssea de outros ratos isogênicos quando injetadas na cavidade vítrea,
migram, ao longo das primeiras semanas, para o sítio de lesão induzida pelo YAG- laser. A comprovação que as CTM experimentam diferenciação em células do tecido normal, requer, estudos adicionais que apresentem metodologia específica e adequada para a identificação e comprovação desse efeito biológico.
7. CONCLUSÃO
1) O modelo experimental criado mostrou-se adequado, reprodutível e efetivo para o estudo de indução de lesão retiniana e injeção intravítrea de CTM;
2) Houve migração das células-tronco para o sítio de lesão coriorretiniana. A migração foi progressiva e ocorrreu ao longo das primeiras semanas após o transplante;
3) Não é possível afirmar se ocorreram integração e diferenciação das células-tronco transplantadas em células do tecido neurorretiniano.
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