Küçük Kardeş

O gene ADAM23 humano (também denominado MDC3) foi inicialmente identificado por SAGANE et al. (1998) e, posteriormente, o cDNA de camundongo correspondente à ADAM23 foi clonado pelo mesmo grupo (SAGANE et al. 1999). O gene humano está localizado no cromossomo 2 (2q33) e é formado por 27 exons (NM_003812.2) (Figura 2). A proteína ADAM23 é composta por 832 aminoácidos, possui tamanho estimado de aproximadamente 92 kDa e apresenta em sua estrutura todos os domínios característicos dos membros da família ADAM. Entretanto, em decorrência da ausência da sequência consenso de aminoácidos no sítio catalítico do domínio metaloprotease, esta proteína não possui atividade

proteolítica (RAWLINGS e BARRETT 1995) (Figura 1, em detalhe), o que sugere que esteja envolvida preferencialmente no processo de adesão celular.

Em 2004, SUN et al. identificaram duas formas alternativas de splicing do gene ADAM23 expressas em cérebro, denominadas ADAM23γ e ADAM23β, que codificam proteínas de tamanho e peso moleculares muito semelhantes ao transcrito identificado anteriormente por SAGANE et al. (1998) (atualmente denominado ADAM23α). A isoforma ADAM23γ corresponde a um transcrito que contém todos os domínios extracelulares conservados em sua estrutura, exceto pela ausência de exons que codifiquem o domínio transmembrana (exons 25 e 26 ausentes, Figura 2). Sendo assim, a isoforma ADAM23γ provavelmente codifica uma isoforma secretada ou citoplasmática da proteína ADAM23. Além disso, ADAM23γ utiliza um códon de parada diferente da isoforma ADAM23α e, decorrente disto, apesar de estas duas isoformas apresentarem a mesma sequência de nucleotídeos em suas porções C- terminal, ADAM23γ possui o último domínio com 46 aminoácidos a mais, em relação ao de ADAM23α. A comparação entre as sequências de aminoácidos das isoformas revela que ADAM23γ é 94.5% similar às isoformas α e β (Figura 2D).

A isoforma ADAM23β apresenta estrutura muito semelhante à da ADAM23α, com 98% de similaridade entre seus aminoácidos. Entretanto, estas duas variantes possuem domínios transmembranas diferentes, codificados por exons distintos (exon 25 e exon 26, respectivamente, Figura 2), e que possuem apenas 54% de similaridade entre suas sequências de aminoácidos. A diversidade transmembranar entre as duas isoformas pode ser responsável, por exemplo, por sua localização em sub-regiões ou subdomínios distintos da membrana celular.

Em relação ao domínio C-terminal das isoformas de ADAM23, que constitui o domínio citoplasmático das isoformas α e β, em nenhuma das variantes são

encontrados motivos ricos em prolina (PXXP), que consistem em potenciais sítios de ligação para proteínas que contém domínios SH3. Entretanto, existem diferenças significativas quanto à composição de aminoácidos serina, treonina e tirosina na porção C-terminal das isoformas. Conforme mencionado anteriormente, os resíduos de serina, treonina e tirosina são potenciais sítios de fosforilação para diversas quinases e, além disso, os resíduos de fosfotirosina resultantes podem atuar como sítios de ligação para proteínas que contém domínios SH2. No caso das isoformas α e β, que apresentam a mesma composição de aminoácidos em seus domínios citoplasmáticos, há apenas um resíduo de treonina e os aminoácidos serina e tirosina estão ausentes. Já no domínio C-terminal da isoforma γ, são encontrados sete resíduos de serina e um de tirosina, mas não há resíduos de treonina (Figura 2D). A diferença entre o domínio C-terminal da isoforma γ e o das outras duas isoformas de ADAM23, bem como o fato de ADAM23γ não estar ancorada à membrana plasmática, sugere que esta isoforma possa estabelecer interações com parceiros moleculares distintos das demais.

Figura 2 – Organização exon/intron do gene ADAM23 humano, suas isoformas de splicing alternativo e estrutura das proteínas codificadas por cada isoforma, de acordo com SUN et al. (2004). A – Estrutura do gene ADAM23 (NM_003812.2), mostrando os 27 exons. Na extremidade 3’ do gene ADAM23 estão destacados os exons (25-27) envolvidos no processo de splicing. B – Desenho esquemático da extremidade 3’ do gene ADAM23 demonstrando o splicing. Os exons 25 e 26 codificam os domínios transmembranas das isoformas β e α do gene ADAM23, respectivamente, ambos ausentes na isoforma γ. As linhas coloridas laranja, amarela e verde representam o splicing das isoformas ADAM23 α, β e γ, respectivamente. C – Estrutura das isoformas das proteínas ADAM23 e seus respectivos domínios. Na extremidade C-terminal das proteínas, os domínios protéicos estão representados da mesma cor dos exons que os codificam, de acordo com A e B. D –

Sequência de aminoácidos na extremidade C-terminal das isoformas de ADAM23. Os domínios protéicos estão representados da mesma cor de B e C. Observa-se a diferença entre a composição de aminoácidos dos domínios transmembranas das isoformas α e β, representados em laranja e amarelo, respectivamente. No último domínio, foram destacados os aminoácidos serina (S), treonina (T) e tirosina (Y), potenciais sítios de fosforilação para quinases (triângulo vermelho).

SUN et al. (2004) também avaliaram o padrão de expressão do RNA mensageiro das três variantes de splicing de ADAM23 durante o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) de camundongos e demonstraram a ocorrência de expressão diferencial entre as etapas avaliadas. ADAM23γ tem alta expressão em cérebro embrionário e neonatal, mas sua expressão diminui após o nascimento e desaparece logo após o décimo dia pós-natal, estando ausente nos camundongos adultos. Já as isoformas ADAM23α e β são pouco expressas no início do desenvolvimento embrionário, sua expressão começa a aumentar próximo ao nascimento, crescendo paulatinamente até a idade adulta, quando atinge sua expressão máxima. O padrão de expressão de ADAM23γ parece coincidir exatamente com o período de formação do SNC, sugerindo uma importante função desta proteína no desenvolvimento cerebral.

É importante ressaltar que no estudo pioneiro de SUN et al. (2004) a avaliação do padrão de expressão do RNA mensageiro das três isoformas de ADAM23 baseou-se no tamanho dos fragmentos gerados, pois foi utilizado um par de iniciadores para amplificar todas as isoformas simultaneamente, os quais foram construídos considerando-se a porção semelhante entre elas. Adotando esta estratégia, foi possível discriminar entre ADAM23γ e as outras duas variantes, uma vez que o fragmento amplificado desta isoforma apresentava tamanho reduzido, quando comparado aos amplicons das outras duas. Entretanto, não foi possível

analisar separadamente a expressão dos transcritos de ADAM23α e β, pois seus amplicons apresentavam o mesmo tamanho.

Apesar da existência da isoforma de splicing γ, a presença de uma variante secretada ou citoplasmática da proteína ADAM23 não foi comprovada até o momento. Além disso, o padrão de expressão das três isoformas de splicing do gene ADAM23 foi estudado apenas em cérebro e ainda não foi determinado em outros tecidos normais e em condições patológicas específicas, como o câncer. Por fim, não há trabalhos na literatura que tenham avaliado o papel funcional das três isoformas individual e comparativamente, com o intuito de investigar a importância de cada uma nos mecanismos celulares e em processos biológicos.

Além de ADAM23, outros genes pertencentes a esta família também apresentam splicing alternativo e frequentemente originam transcritos que diferem entre si na região dos exons que codificam os domínios transmembrana e/ou citoplasmático. Os genes ADAM9, 11, 12, 28 e 33 codificam isoformas potencialmente secretadas, sendo que, para ADAM9 e 12, a existência de tais variantes protéicas já foi comprovada (KATAGIRI et al. 1995; GILPIN et al. 1998; ROBERTS et al. 1999; HOTODA et al. 2002; POWELL et al. 2004).

O gene ADAM9, por exemplo, origina dois transcritos, sendo que um deles codifica uma proteína transmembrana, que apresenta todos os domínios típicos das ADAMs, e o outro, uma proteína secretada (ADAM9s), que não possui os domínios transmembrana e citoplasmático (HOTODA et al. 2002). MAZZOCA et al. (2005) demonstraram que o aumento da expressão de ADAM9s está correlacionado com o incremento da capacidade invasiva de carcinomas e com maior potencial metastático.

De modo semelhante a ADAM9, os genes ADAM11 e ADAM12 também apresentam splicing alternativo e codificam uma forma longa, transmembrana, e uma forma curta, secretada (KATAGIRI et al. 1995; GILPIN et al. 1998). KURISAKI et al. (2002) descreveram a existência de uma isoforma curta de ADAM19, denominada ADAM19 mini, em que o pró-domínio e os domínios de metaloprotease e desintegrina estão ausentes, e cuja expressão é exclusivamente intracelular.

No caso dos genes ADAM15 e ADAM22, foram identificadas diversas variantes de splicing que se diferenciam em suas porções C terminal, nos exons que codificam para seus domínios citoplasmáticos, o que sugere que sejam capazes de interagir com proteínas citossólicas distintas (KLEINO et al. 2007; SAGANE et al. 2005). KLEINO et al. (2009) estudaram as isoformas de ADAM15 que possuem domínios citoplasmáticos distintos e que, por isso, exibem diferentes combinações de potenciais sítios de ligação a domínios SH3 (domínio de ligação a motivos ricos em prolina) em sua cauda citoplasmática. Eles demonstraram que estas isoformas exibem grande diversidade na seleção de parceiros moleculares, ou seja, cada isoforma interage com diferentes proteínas que contém domínios SH3, revelando sua participação em vias de sinalização intracelular distintas.