İKTİSAT POLİTİKALARI ÇERÇEVESİNDE TARIMSAL SULAMANIN ŞANLIURFA EKONOMİSİNE ETKİSİ

O baculovírus AgMNPV representado pelos seus diferentes isolados genéticos AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 foi analisado quanto à sua capacidade de produção de OB utilizando cultivo em suspensão das células de Spodoptera frugiperda, linhagem Sf21. A seleção de isolados genéticos é importante quando se trata de cultivo in

vitro de baculovírus, principalmente na estabilidade em relação à produção de corpos de

oclusão.

A Figura 3.1 mostra as infecções das células Sf21 com os isolados AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5. Percebe-se que as infecções com os isolados AgMNPV- 2D e AgMNPV-MP2 apresentam praticamente o mesmo crescimento celular, as células infectadas apresentaram uma pequena diferenciação das células não infectadas ((1,56±0,078) x106 células viáveis/mL) no segundo dia de infecção, atingindo concentrações máximas de (1,31±0,066)x106 células viáveis/mL e (1,39±0,070)x106 células viáveis/mL, respectivamente. Para a infecção com AgMNPV-2D, as células infectadas pararam de crescer, no 3º dia, fato que caracteriza o estabelecimento do processo infectivo. Neste momento, os

vírus utilizam a maquinaria das células para replicação viral, ou seja, ao invés das células utilizarem os genes para o crescimento celular os utilizam para produção do DNA viral. Observando a cinética de crescimento das células infectadas com isolado AgMNPV-MP2, no 3º dia, as células infectadas continuaram a crescer mais lentamente até a concentração de (1,79±0,29)x106 células viáveis/mL, após esse momento, houve uma diminuição na concentração de células infectadas viáveis, caracterizando o estabelecimento da infecção. Enquanto que as células não infectadas (células controle) já possuíam uma concentração de (4,21±0,67) x106 células viáveis/mL. 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 C é lu la s v iá v e is x 1 0 6 /m L Tempo (dia) Células não infectadas

Células infectadas com AgMNPV-2D Células infectadas com AgMNPV-MP2 Células infectadas com AgMNPV-MP5

Analisando a infecção com o isolado AgMNPV-MP5 pode-se observar, ainda na Figura 3.1, que as células infectadas atingiram uma concentração máxima de células infectadas de (1,56 ±0,25)x106 células viáveis/mL em 3 dias de infecção.

A partir do perfil de crescimento das células não infectadas e infectadas com os isolados selvagens, estimaram-se os parâmetros cinéticos referentes ao crescimento das células e à produção dos corpos de oclusão. Os parâmetros cinéticos estimados foram as velocidades especificas de crescimento (µap e µx) das células não infectadas e infectadas, além das taxas de mortalidade (Kd) e do tempo de duplicação (td). Tais parâmetros estão apresentados na Tabela 3.1. As velocidades específicas aparentes (µap) foram calculadas a partir da linearização das concentrações de células viáveis durante a fase exponencial de crescimento, as taxas de mortalidade celular (Kd) foram obtidas através da Equação (9), utilizando as concentrações de células não viáveis também durante a fase exponencial de crescimento.

Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos das infecções com os isolados selvagens

Células µap(d-1) Kd (d-1) µx (d-1) td (d)

Não infectadas 0,915±0,08 0,009 0,924 0,75

Infectadas (AgMNPV-2D) 0,726±0,05 0,028 0,754 0,92 Infectadas (AgMNPV-MP2) 0,619±0,06 0,053 0,674 1,03 Infectadas (AgMNPV-MP5) 0,612±0,12 0,064 0,676 1,03

Considerando as velocidades específicas de crescimento, observa-se que as células não infectadas apresentaram µx = 0,924d-1 e µap = 0,915d-1 (Anexo B – Figura B.2), correspondendo ao tempo de duplicação (td) de 0,75d, valores que comparados com alguns trabalhos da literatura são bastante representativos. Estes valores demonstram que as células Sf21 estão adaptadas às condições de cultivo e principalmente ao meio de cultura SF900II SFM (Gibco), isso pode ser justificado também pelo valor de Kd das células Sf21 que foi de 0,009d-1, mostrando que a velocidade de morte dessas células é insignificante. No trabalho de Power (1993) utilizando as células de S. frugiperda, linhagem Sf9, e utilizando o mesmo meio

de cultura deste estudo (SF900II SFM, Gibco) atingiu-se um µap = 0,682d-1 e td = 1d, valores próximos aos obtidos neste trabalho. Também utilizando células Sf9, Almeida et al. (2010) obteve um µx = 0,775d-1, cultivadas em meio HyClone suplementado com 5% (v/v) de soro fetal bovino. Ainda utilizando células Sf9, Power et al. (1994) obtiveram um µx = 0,672d-1 e

Kd = 1,9x10-3d-1. Como as linhagens Sf21 e Sf9 são originárias do mesmo hospedeiro, S.

frugiperda, apresentam características semelhantes quanto à cinética de crescimento quando

cultivadas em mesmo meio de cultura.

Para as velocidades específicas de morte celular (Kd) obtidas das infecções com os diferentes isolados foram consideradas, para o cálculo, as células infectadas que ainda apresentaram crescimento celular, e assim, foram calculadas da mesma maneira que as células não infectadas (POWER, 1993). Os valores de Kd, nesse caso, refletem o quanto as células foram afetadas pela ação viral, ou seja, quanto maior for o Kd maior será a influência e atividade viral sobre as células infectadas durante o crescimento celular. As células infectadas com AgMNPV-2D obtiveram um µap = 0,726 ± 0,05d-1 e Kd igual a 0,028d-1, consequentemente um µx = 0,754d-1. As células infectadas com AgMNPV-MP2 e AgMNPV- MP5 apresentaram parâmetros cinéticos de crescimento semelhantes, µap = 0,619 ± 0,06d-1 (Anexo B – Figura B.3), Kd igual a 0,053d-1, µx = 0,674d-1 e µap = 0,612 ± 0,12d-1 (Anexo B – Figura B.4) e Kd igual a 0,064d-1, µx = 0,676d-1, respectivamente. Esses valores demonstraram que as células infectadas com os clones MP2 e MP5 possuem comportamento similar após serem inoculadas, mesmo utilizando quantidades de inóculo diferentes (AgMNPV-MP2 – 10% v/v de BV e AgMNPV-MP5 – 1% v/v de BV), no entanto, a partir do momento que a infecção foi estabelecida ocorreu uma diferenciação quanto à velocidade de infecção e formação dos corpos de oclusão.

A Tabela 3.2 apresenta os resultados das velocidades médias de infecção (Ri) para cada isolado selvagem de AgMNPV.

Tabela 3.2 Velocidade média de infecção

Isolado Ri (células/mL.d) R2(ajuste linear)

AgMNPV-2D (1,31±0,11) x 105 0,9961

AgMNPV-MP2 (7,00 ±0,12) x 104 0,9867

AgMNPV-MP5 (5,77 ±0,36) x 105 0,9981

Para a infecção AgMNPV-2D foi obtida uma velocidade média de infecção (Ri) igual a (1,31±0,11) x105células/mL.d (Anexo C – Figura C.1). Para a infecção com AgMNPV- MP2 foi obtida uma velocidade média de infecção (Ri) = (7,00±0,12) x104 células/mL.d (Anexo D – Figura D.1). Para a infecção com AgMNPV-MP5 foi obtido uma velocidade média de infecção (Ri) igual a (5,76 ± 0,36) x105 células/mL.d (Anexo E – Figura E.1).

Analisando as velocidades médias de infecção obtidas para cada isolado, observou-se que o isolado AgMNPV-MP5 alcançou a maior velocidade média de infecção quando comparado aos outros isolados AgMNPV-2D e AgMNPV-MP2. A velocidade média de infecção representa a velocidade na qual as células são infectadas durante o processo de infecção, portanto, tendo maior velocidade média de infecção maior será a capacidade de infectar as células viáveis durante o mesmo período do processo de infecção, portanto, as células Sf21 demonstraram possuir maior suscetibilidade ao isolado AgMNPV-MP5.

A Figura 3.2 mostra a produção de OB produzidos na infecção em células Sf21 utilizando diferentes isolados selvagens do baculovírus AgMNPV.

2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50 60 70 O B x 1 0 7 /m L Tempo (dia) Produção de OB - AgMNPV-2D Produção de OB - AgMNPV-MP2 Produção de OB - AgMNPV-MP5

Figura 3.2 Produção volumétrica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV

A produção média de OB foi de (1,3±0,21)x108OB/mL ao final de 8 dias de infecção para o isolado AgMNPV-2D e (1,9±0,30)x108OB/mL para o isolado AgMNPV-MP2, mostrando um comportamento semelhante da curva de produção volumétrica de OB. Já o isolado AgMNPV-MP5 obteve uma produção média de OB de (5,3±0,85)x108OB/mL durante 8 dias de infecção. Assim, o isolado AgMNPV-MP5 teve uma produção volumétrica 4 vezes maior do que a produção do AgMNPV-2D e cerca de 3 vezes maior do que o isolado AgMNPV-MP2.

Com base nas curvas de produção de OB foi realizada estimativa das velocidades médias de formação de OB para todos os isolados genéticos utilizados neste processo de infecção. A maior atividade de produção de OB é demonstrada na curva de formação de OB em períodos distintos para cada isolado, e esta é constante e obedece a linearidade, portanto, o ajuste linear do trecho que corresponde à maior atividade de formação de OB é representativo e seu coeficiente angular é a velocidade média de formação do OB.

O isolado AgMNPV-2D apresentou intensa produção de OB no período de 3 a 6 dias do processo de infecção, estimando a velocidade média de formação de OB (Rp) correspondente a esse período obtém-se um Rp igual a (3,879±0,06)x107 OB/mL.d (Anexo C – Figura C.2). A infecção utilizando o isolado AgMNPV-MP2 teve o período de intensa atividade de produção de OB correspondente ao período de 2 a 4 dias de infecção, obtendo uma Rp igual a (1,074±0,0001)x108 OB/mL.d (Anexo D – Figura D.2) e, por fim, o isolado AgMNPV-MP5 teve plena produção de OB, também no período de 2 a 4 dias de infecção, com uma Rp de (1,893±0,14)x108 OB/mL.d. (Anexo E – Figura E.2).

O isolado AgMNPV-MP5 apresentou uma velocidade média de formação de OB quase 2 vezes maior do que o isolado AgMNPV-MP2 e cerca de 5 vezes maior do que a velocidade de formação de OB do isolado AgMNPV-2D, demonstrando ser um melhor produtor de corpos de oclusão neste sistema de produção in vitro de baculovírus selvagem de AgMNPV utilizando a linhagem de células Sf21.

O que ficou bastante evidente foi à produção específica de OB para cada isolado, mostrada na Figura 3.3. O isolado AgMNPV-MP2 obteve uma relação OB/Célula semelhante ao isolado AgMNPV-2D. Sendo o AgMNPV-MP2 com a produção de 72,37±11,58 OB/Célula e o AgMNPV-2D com a produção de 75,71±12,11 OB/Célula. No entanto, o isolado AgMNPV-MP5, mesmo tendo um processo de purificação idêntico ao AgMNPV- MP2, obteve a melhor relação OB/Célula atingindo 297,73±47,64 OB/Célula ao final de 8 dias de infecção.

2 3 4 5 6 7 8 0 50 100 150 200 250 300 350 400 O B /C é lu la Tempo (dia)

AgMNPV - 2D AgMNPV - MP2 AgMNPV - MP5

Figura 3.3 Produção específica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV

Com base nos resultados, pode-se considerar o isolado AgMNPV-MP5 com melhor desempenho na produção dos corpos de oclusão do baculovírus selvagem de AgMNPV e isso pode ser comprovado com os valores dos parâmetros cinéticos obtidos durante o processo de infecção nas mesmas condições de cultivo dos outros isolados, pois o mesmo apresentou os melhores valores de velocidades específicas de crescimento de células infectadas, velocidades de infecção e por fim, velocidades de formação de OB. Outro fator que torna o isolado AgMNPV-MP5 como melhor na produção de OB foi a menor quantidade de inóculo utilizado para infectar a mesma concentração de células (utilização da mesma multiplicidade de infecção – MOI). Para a infecção com os isolados AgMNPV-MP2 e AgMNPV-2D foi necessário utilizar 10% v/v de inóculo e para o isolado AgMNPV-MP5 de apenas 1% v/v para infectar as células Sf21, visando uma futura ampliação de escala, a quantidade de inóculo

inicial é um parâmetro economicamente importante quando se deseja produzir grandes quantidades de baculovírus (WONG et al, 1996).

A Figura 3.4 apresenta uma micrografia ótica (aumento 400x em microscópio ótico) das células Sf21 infectadas com o isolado selvagem AgMNPV-MP5 com 4 dias de infecção (d.p.i). Observa-se que as células apresentam OB no interior do seu núcleo hipertrofiado devido ao processo de infecção.

Figura 3.4 Células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP5 em 4 d.p.i

Estudos realizados por Slavicek et al. (1996) mostraram que isolados de um mesmo baculovírus Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus (LdMNPV), também purificados, produziram diferentes concentrações de OBs quando utilizados em infecções em células da linhagem L. dispar 652Y. Pedrini et al. (2005) utilizaram isolados genéticos do

Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HaSNPV) multiplicados na passagem

seriada em células de Helicoverpa zea, foram selecionados mutantes few polyhedra (FP) (ppC19) que produziram cinco vezes mais corpos de oclusão que típicos mutantes FP (FP8AS), onde normalmente produziam menos corpos de oclusão do que o baculovírus HaSNPV selvagem, portanto. Neste trabalho, os isolados genéticos AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 apesar de serem originários do mesmo processo de purificação apresentaram diferenças quanto à produção de OB.

Estudos com o baculovírus AgMNPV têm sido realizados com a finalidade de mostrar sua produção in vitro (CLAUS et al., 1993; CASTRO et al., 1997; RODAS et al., 2005; CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006). A infectividade do Anticarsia gemmatalis multiple

nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em sete diferentes linhagens celulares foi investigada

(CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006). A linhagen BTI-Tn-5B1-4, de Trichoplusia ni, e a linhagem UFL-AG-286, de Anticarsia gemmatalis, foram altamente produtivas em termos de produção de poliedros e de vírus extracelulares (BV). Por outro lado, uma linhagem de

Lymantria dispar (Ld652Y) não apresentou susceptilidade ao vírus enquanto uma linhagem

de Bombyx mori (BM 5) resultou em apoptose (auto-destruição celular ou morte natural da célula). A produção in vitro do AgMNPV utilizando as células de Spodoptera frugiperda, linhagem Sf9, foi analisada por Rodas et al. (2005), esta linhagem produziu na ordem da 106 OB/mL de vírus e apenas 27,8 OB/Célula. Já neste trabalho, utilizando as células Sf21 em cultivo em suspensão, obteve-se para o isolado AgMNPV-2D em média 75,71±12,11 OB/Célula; para o isolado AgMNPV-MP2 em média 72,37±11,58 OB/Célula e para o isolado AgMNPV-MP5 em média 297,73±47,64 OB/Célula que demonstrou a melhor capacidade de produção de corpos de oclusão deste isolado genético.

A produção in vitro da isolado AgMNPV-MP5 foi bastante significativa por apresentar uma alta produção especifica de OB, somente observados em poucos sistemas in

vitro de produção de baculovírus como exemplo o Helicoverpa armigera SNPV cultivados

em células H. zea que produziu 222 OB/Célula (LUA et al., 2002) e o Spodoptera frugiperda MNPV cultivados em células S. frugiperda produzindo em média 400 OB/Célula (ALMEIDA, 2005).

Sabendo que a estabilidade e produtividade virais são amplamente dependentes do vírus isolado, e isolados mais estáveis têm sido purificados por plaqueamento e obtendo maior produção de OB em altas passagens seriadas (SLAVICEK et al., 1996; SLAVICEK; HAYES- PLAZOLLES; KELLY, 2001). Deste modo, o isolado AgMNPV-MP5 purificado por plaqueamento em alta passagem (7ª) produziu mais corpos de oclusão do que os isolados AgMNPV-MP2 e AgMNPV-2D.