O primeiro gene a ser relacionado com implicações de fala e linguagem foi identificado em 1987 a partir de investigações de uma grande família, denominada de família KE, em que diversos indivíduos eram afetados por uma forma distinta de prejuízo na fala conhecido como dispraxia verbal, responsável pelo comprometimento da fluência. Além disso, membros desta mesma família apresentavam expressivos déficits de linguagem.
Análises de ligação identificaram em 7q31.1, o gene FOXP2 (Forkhead Box P2) (FISHER et al., 1998). O sequenciamento desse gene, nesta família, revelou que todos os indivíduos afetados apresentavam uma mutação heterozigota (AÆG) no éxon 14 implicando na troca de aminoácidos, (Arg Æ His) na posição 553 (R553H) (LAI, C. S. L. et al., 2001). Esta mutação, uma vez ausente nos indivíduos não afetados da família, sugeriu que esse gene poderia estar envolvido com a dispraxia verbal desenvolvimental familiar.
A relevância dessa descoberta foi confirmada a partir da identificação de um novo caso de dispraxia verbal. Nele foram observados os mesmos problemas de fala, porém geneticamente foi identificado um rearranjo cromossômico, 7q e
5q:t(5;7)(q22;q31.2), ocasionando na disruptura do gene FOXP2 (LAI, C. S. et al., 2000). A partir de então diversos estudos independentes envolvendo novos casos clínicos semelhantes foram publicados.
Embora a fisiopatologia do FOXP2 necessite de melhor compreensão em relação à dispraxia verbal, há evidências de que esse gene esteja envolvido com o desenvolvimento de estruturas cerebrais responsáveis pelo controle motor fino (córtex motor, estriato e cerebelo). Assim, com disrupturas, esse gene pode ocasionar severos prejuízos no desenvolvimento adequado da fala (NEWBURY; MONACO, 2010).
O gene FOXP2 é responsável pela codificação de fatores de transcrição que atuam na regulagem (repressão ou ativação) da expressão em outros genes. A variedade de genes que podem ser modulados por ele é variável entre os tecidos e o período de desenvolvimento (KONOPKA et al., 2009; SPITERI, 2007; VERNES, 2007). Estima- se que os fatores de transcrição possam se ligar em aproximadamente 300 a 400 regiões promotoras de outros genes o que demonstra alta complexidade quanto ao seu envolvimento regulador (NEWBURY; MONACO, 2010) e o seu importante papel quanto ao desenvolvimento da fala e linguagem.
2.6.2.2. Gene CNTNAP2
O gene CNTNAP2 (Contactin-associated Protein-like 2) é um dentre vários genes, que está sob interferência do FOXP2, porém com modulação direta na região reguladora (VERNES et al., 2008).
Expresso ao longo do desenvolvimento do córtex cerebral humano, o gene CNTNAP2 localizado na região cromossômica 7q35-36, codifica uma proteína (ASPR2) neuronal transmembrana da família das neuroxinas, cujo papel envolve interações entre neurônios e a glia e, no agrupamento dos canais de potássio em axônios mielinizados durante o desenvolvimento do sistema nervoso (POLIAK et al., 1999).
O gene CNTNAP2, uma vez alterado, tem sido associado a doenças de caráter neurodesenvolvimental como apontado em diversos trabalhos: síndrome de Gilles de La Tourette (VERKERK et al., 2003); esquizofrenia (FRIEDMAN et al., 2008), epilepsia (FRIEDMAN et al., 2008; STRAUSS et al., 2006); autismo (ALARCÓN et al., 2008; ARKING et al., 2008; BAKKALOGLU et al., 2008; POOT et al., 2010); déficit de atenção e hiperatividade (ELIA; DEVOTO, 2007) e de deficiência intelectual (ZWEIER
et al., 2009) e mais recentemente, em um possível caso de gagueira associado a alterações de linguagem e aprendizado (PETRIN et al., 2010).
Estudando um paciente brasileiro de complexo fenótipo (gagueira persistente, alterações de linguagem e aprendizado) Petrin et al. (2010) identificaram uma deleção de 10 Mb envolvendo a região 7q33-q35 que incluía diversos genes, dentre os quais o CNTNAP2. Nessa região ficou demonstrado a deleção dos três primeiros éxons ocasionando a disruptura do gene CNTNAP2. A deleção dessa porção inicial também envolveu a deleção do íntron 1, sítio de ligação direto do FOXP2. Desta maneira, uma vez em hemizigose, esse sítio para o FOXP2 poderia implicar na desregulação dos mecanismos moleculares envolvidos entre os dois genes, implicando nas características fenotípicas, como apresentadas pelo paciente.
As evidências sugerem que tanto o gene FOXP2 quanto o CNTNAP2 estão envolvidos no desenvolvimento de neuropatias com implicações na fala e linguagem. Muito embora as alterações pontuais desses genes possam ser questionáveis quanto ao seu papel exclusivo no desenvolvimento da fala e linguagem, o entendimento de suas vias biológicas permitirá a compreensão dos mecanismos envolvidos à complexa variedade fenotípica.
Portanto, esta revisão demonstra claramente que há casos de gagueira em que existem genes causais e outros predisponentes, os quais uma vez sob a ação de fatores ambientais permitem classificar a gagueira desenvolvimental persistente familial, como um distúrbio de comunicação altamente complexo e cujo modelo exato de herança ainda não está definido, possivelmente variando entre famílias e populações distintas.
2.7. POPULAÇÃO BRASILEIRA
Historicamente, a população brasileira sempre foi tomada por elevados níveis de intercasamentos entre diferentes grupos étnicos, fato este que nos faz conhecidos como uma população formada pela mistura de povos ancestrais europeus, africanos e ameríndios, o que é completamente comprovada por dados históricos e genéticos (GONÇALVES et al., 2008; SUAREZ-KURTZ, 2007).
Mais especificamente relacionada às amostras deste trabalho, a população do Estado de São Paulo (região sudeste do Brasil) segundo Giolo et al. (2012) demonstraram um extenso grau de intercasamentos, porém preponderantemente, entre
povos africanos e europeus apesar da presença de leves traços indígenas, asiáticos, entre outros na população paulista.
Além de ser um trabalho pioneiro e inédito no Brasil os dados genéticos dessa população frente aos estudos apresentados até então, envolvendo populações com grau de miscigenação menor e, até mesmo de consanguinidade, podem fornecer informações relevantes para o estudo de doenças complexas, como a gagueira desenvolvimental persistente familial.
3. OBJETIVOS
3.1. PRIMÁRIOS
x Realizar análises de ligação em famílias portadoras de gagueira desenvolvimental persistente do Estado de São Paulo e comparar os resultados com os obtidos em outras populações;
x A partir do refinamento do mapa de ligação, identificar as regiões e os genes presentes;
x Avaliar sistematicamente os genes através de sequenciamento de nova geração e identificar, com o uso de ferramentas de bioinformática, potenciais variações relacionadas com o fenótipo;
x Sequenciar as variações identificadas (etapa anterior), por eletroforese capilar, no grupo amostral e grupo controle com o propósito de validar e estimar as frequências dessas variações, correlacionando-as ao fenótipo.
3.2. SECUNDÁRIOS
x Sequenciar, por eletroforese capilar, as amostras selecionadas, tanto do grupo amostral quanto de controles para a identificação de polimorfismos nos SNPs rs6275 e rs6277 no gene DRD2 e confrontar os resultados com os observados por Lan et al. (2009).
x Sequenciar, por eletroforese capilar, as amostras selecionadas tanto do grupo amostral quanto de controles para a identificação de mutações nos genes GNPTAB, GNPTG, NAGPA (KANG et al., 2010) como causadores da gagueira bem como, identificar outros polimorfismos eventualmente presentes na população brasileira;
x Sequenciar, por eletroforese capilar, as amostras selecionadas tanto do grupo amostral quanto de controles para a identificação de mutações nos genes FOXP2 e CNTNAP2 e correlacionar os possíveis achados ao fenótipo.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CASUÍSTICA
4.1.1. Grupo amostral
Participaram deste trabalho dois grupos de pacientes: no primeiro, 43 famílias com gagueira desenvolvimental persistente, não relacionados; no segundo, 115 indivíduos gagos, não relacionados, com gagueira desenvolvimental persistente e histórico familial positivo para a doença; ambos selecionados independentemente do número de membros da família sem distinção de sexo, etnia, escolaridade e nível sócio- economico-cultural provenientes de todo o Estado de São Paulo.
As avaliações se iniciaram pela triagem dos pacientes que procuravam os serviços de diagnóstico fonoaudiológico e terapia, dos centros colaboradores do projeto. A partir dos pacientes diagnosticados com gagueira desenvolvimental persistente, informações referentes ao histórico familial de recorrência para doença foram verificadas. Pacientes com o diagnostico confirmado e com casos de recorrência na família foram convidados a participar do projeto.
Posterior à fase de avaliação, os pais e/ou responsáveis, o próprio paciente (maior de 18 anos) ou mesmo a família receberam a devolutiva quanto ao diagnóstico. Informações sobre a gagueira foram oferecidas gratuitamente através de orientações e instruções com o auxílio de um informe especialmente elaborado pelos fonoaudiólogos envolvidos. Todos os casos que necessitaram de terapia foram mantidos nas clínicas dos centros colaboradores para intervenção fonoaudiológica quando assim desejaram.
4.1.1.1. Critérios de inclusão
x Ser falante nativo do português brasileiro; x Ter idade igual ou superior a seis anos;
x Apresentar histórico familial positivo para a gagueira, ou seja, apresentar no mínimo outro parente gago;
4.1.1.2. Critérios de exclusão
x Apresentar qualquer distúrbio neurológico, genético ou não, nos familiares, tais como distonia, doenças extras piramidais, deficiência intelectual, epilepsia, transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH);
x Sintomas ou condições psiquiátricas;
x Apresentar alterações de comunicação oral não compatível com a idade; x Apresentar perda auditiva condutiva ou neurossensorial;
x Outras condições pertinentes que possam gerar erros no diagnóstico, definidos pelos fonoaudiólogos responsáveis.