ÇEfi‹TL‹ KL‹N‹K ÖRNEKLERDEN ‹ZOLE ED‹LEN ENTEROBACTERIACEAE SUfiLARINDA GSBL OLUfiTURMANIN ÇDST VE VITEK2 YÖNTEMLER‹ ‹LE ARAfiTIRILMASI

(1)

ÖZET

Nisan 2006-A¤ustos 2006 aras›nda hastanemizde çeflitli klinik örneklerden izole edilen 212 Escherichia coli, 71 Kleb- siella spp., 28 Proteus spp. ve 10 Enterobacter spp. olmak üzere toplam 321 suflun GSBL enzimi çift disk sinerji testi (ÇDST) ile ve Vitek2 (bioMérieux) cihaz›nda GN13 kartlar› ile prospektif olarak araflt›r›lm›flt›r. GSBL oranlar› ÇDST ve Vitek2 ile s›ras›yla E.coli’de % 49 ve % 51, Klebsiella spp.’de % 44 ve % 51 olarak bulunmufltur. Proteus spp. ve Enterobacter spp. sufllar›nda GSBL tespit edilmemifltir. Hastanemizde E.coli sufllar›nda oldukça yüksek GSBL enzimi oldu¤u görülmüfltür. Vitek2 GN13 kartlar› ile GSBL testinin ÇDST’ne göre duyarl›l›¤› % 100, özgüllü¤ü % 94.1 olarak bulunmufltur.

Anahtar sözcükler: çift disk sinerji testi, Enterobacteriaceae, GSBL, Vitek2 SUMMARY

ESBL Investigation in Enterobacteriaceae Strains Isolated from Various Clinical Samples by DDST and Vitek2 Methods

Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) production by 212 Escherichia coli, 71 Klebsiella spp., 28 Proteus spp. and 10 Enterobacter spp. strains isolated in our hospital was prospectively investigated by double disk synergy test (DDST) and Vitek2 GN13 cards system. ESBL positivity was detected by DDST and Vitek2 system in E.coli strains as 49 % and 51 %, in Klebsiella spp. strains as 44 % and 51 %, respectively. GSBL production was not detected in Proteus spp. and Enterobacter spp. strains. High ratio of GSBL production was found in E.coli strains in our hospital. When compared to the result of DDST, the sensitivity of Vitek2 system was calculated as 100 % and the specificity as 94.1 %.

Keywords: double disk synergy test, Enterobacteriaceae, extended-spectrum beta-lactamase, Vitek2

G‹R‹fi

Enterobacteriaceae ailesindeki bakterilerin beta-laktam antibiyotiklere direncinde en önemli kaynak beta-laktamaz enzimleridir⁽²⁾. Beta-laktamazlar, en çok Gram negatif bakteriler taraf›ndan sentezlenen, beta-laktam grubu antibiyotikleri hidrolize ederek inaktif hale geti- ren enzimlerdir^(2,17). Say›lar› 350 kadar olan beta-laktamazlar›n baz›lar› do¤al olarak mikroor- ganizmalar›n kromozomlar›nda, baz›lar› da bakteriler aras›nda aktar›labilen plazmidler

üzerinde kodlanmaktad›r^(3,22). Plazmid kontro- lündeki beta-laktamazlardan yaklafl›k 150’si

“genifl spektrumlu beta-laktamazlar (GSBL) (extended-spectrum beta-lactamase)” olarak ad- land›r›l›r^(2,22). GSBL enzimleri penisilinler, genifl spektrumlu sefalosporinler ve aztreonama karfl› dirençten sorumludur⁽⁵⁾. Günümüzde en çok Klebsiella ve Escherichia coli’de rastlanmakla birlikte son y›llarda di¤er patojen bakteriler ara- s›nda da h›zla yayg›nlaflmakta, özellikle nozo- komiyal etkenler aras›nda GSBL pozitif sufllara daha s›k rastlanmaktad›r^(5,15). Bu sebeple izole

ÇEfi‹TL‹ KL‹N‹K ÖRNEKLERDEN ‹ZOLE ED‹LEN ENTEROBACTERIACEAE SUfiLARINDA GSBL OLUfiTURMANIN ÇDST VE VITEK2 YÖNTEMLER‹ ‹LE

ARAfiTIRILMASI

Murat MEHL‹ *, Yasemin ZER **, Efgan GAYYURHAN *

*Gaziantep Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, GAZ‹ANTEP

**Gaziantep Üniversitesi T›p Fakültesi, Merkez Laboratuvar›, GAZ‹ANTEP

Yaz›flma adresi: Yasemin Zer. Gaziantep Üniversitesi T›p Fakültesi, Merkez Laboratuvar›, GAZ‹ANTEP Tel.: (0342) 360 60 60/77373

e-posta: [email protected]

Al›nd›¤› tarih: 01.02.2007, revizyon kabulü: 24.04.2007

(2)

edilen etkenin GSBL enziminin olup olmad›¤›

araflt›r›lmal›, GSBL varl›¤›nda sufl tüm genifl spektrumlu sefalosporinlere, penisilinlere ve aztreonama dirençli bildirilmelidir^(3,11). GSBL üreten sufllar›n saptanmas›nda çift disk sinerji testi (ÇDST), E test, üç boyutlu test ve otomatize baz› sistemlere ait tan› kartlar› kullan›labilir^(1,2,16). Rutin uygulamada ÇDST en s›k kulla- n›lan yöntem olup, beta-laktam ve beta-laktamaz inhibitörleri aras›nda sinerji varl›¤›na da- yal› ucuz ve kolay bir testtir^(8,11). Günümüzde otomatize sistemler, bakteri tan›mlama ve anti- mikrobiyal duyarl›l›k testlerinin yap›lmas›nda s›kça kullan›lmaktad›r. Bu sistemlerin baz›lar›n- da GSBL de saptanabilmektedir. Bu çal›flmada baz› laboratuvarlarda kullan›lmakta olan Vitek2 ile tespit edilen GSBL oranlar›n›n, daha yayg›n olarak kullan›lan ÇDST ile uyumu irdelenmek is- tenmifl, bu iki yöntemin moleküler çal›flmalar› ge- rektiren mutlak performanslar›n› belirlemek amaçlanmam›flt›r.

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Nisan 2006-A¤ustos 2006 aras›nda Mikro- biyoloji birimimize gelen çeflitli örneklerden izole edilen 212 E.coli, 71 Klebsiella spp., 28 Pro- teus spp. ve 10 Enterobacter spp. olmak üzere 321 suflda GSBL enzimi, sufllar stoklanmadan, izole edilmelerini takiben prospektif olarak ÇDST ve Vitek2 GN13 kartlar› ile araflt›r›lm›flt›r.

Vitek2 identifikasyon kartlar› ile tüm sufllar›n tan›mlamas› yap›lm›fl, tan›mlama için ge- rekti¤inde klasik yöntemler kullan›lm›flt›r.

GSBL belirlenmesi de Vitek2 GN13 kartlar› ile yap›lm›flt›r. Bu kartlarda sefepim (klavulanik asitli ve klavulanik asitsiz), sefotaksim (klavulanik asitli ve klavulanik asitsiz), seftazidim (klavulanik asitli ve klavulanik asitsiz) olmak üzere 6 kuyudaki antibiyotik kombinasyonlar› ile GSBL belirlenmektedir.

ÇDST’de disk difüzyon yönteminin stan- dartlar› kullan›lm›flt›r. Mueller Hinton agar›n›n merkezine amoksisilin-klavulanik asit (20/10 µg) diski ve bu diskin etraf›na merkezden mer- keze uzakl›klar› 20 mm olacak flekilde seftriakson (30 µg), sefotaksim (30 µg), seftazidim (30 µg)

ve aztreonam (30 µg) diskleri dispenser ile yer- lefltirilmifltir. Plaklar 18-20 saat süreyle 35°C’de inkübe edilmifltir. Disklerden herhangi birinin inhibisyon zonunun amoksisilin-klavulanik asit diskine bakan k›sm›nda geniflleme olmas› GSBL pozitif olarak de¤erlendirilmifltir^(16,18). Çal›flmada GSBL üretmedi¤i bilinen E.coli ATCC 25922 suflu kontrol suflu olarak kullan›lm›flt›r.

‹statistiksel de¤erlendirme kikare testi kullan›larak yap›lm›flt›r.

BULGULAR

Çal›flmaya al›nan örneklerin 173’ü (% 54) kad›n, 148’i (% 46) erkek hastalardan izole edilmifltir. ‹ncelenen 321 örne¤in 192’si (% 60) idrar, 27’si (% 8) kan kültürü, 24’ü (% 7) yara sürüntü- sü, 24’ü (% 7) d›flk›, 18’i (% 6) balgam, 13’ü (% 4) sonda ucu ve 23’ü (% 7) di¤er örneklerden (dren, bo¤az sürüntüsü, trakeal aspirat, stent ucu, açl›k mide suyu, plevra) izole edilmifltir.

Örneklerin 223’ü (% 69) serviste yatmakta olan hastalara, 98’i (% 31) ise ayaktan tedavi için po- likliniklere baflvuran hastalara aitti. Serviste yatan hastalardan soyutlanan 223 suflun 151’i (% 68) E.coli, 57’si (% 26) Klebsiella spp., 8’i (% 4) Ente- robacter spp., 7’si (% 3) Proteus spp.; poliklinik hastalar›ndan izole edilen 98 suflun 61’i (% 62) E.coli, 14’ü (% 14) Klebsiella spp., 21’i (% 21) Pro- teus spp. ve 2’si (% 2) Enterobacter spp. olarak ta- n›mlanm›flt›r.

Servis ve poliklinik hastalar›ndan izole edilen sufllarda iki yöntemle saptanan GSBL pozitifli¤i tabloda gösterilmifltir. Enterobacter spp.

ve Proteus spp. sufllar›nda GSBL varl›¤› belirlen- memifltir.

ÇDST ile GSBL negatif bulunan 6 E.coli ve 5 Klebsiella spp. suflunda Vitek2 ile pozitif sonuç al›nm›fl, Vitek2 ile negatif, ÇDST ile pozitif so- nuç veren sufl olmam›flt›r. Bu durumda ÇDST kriter al›nd›¤›nda Vitek2’nin duyarl›l›¤› % 100, özgüllü¤ü % 94.1 olarak hesaplanm›flt›r. GSBL varl›¤› aç›s›ndan servis ve poliklinik hastalar›

aras›nda istatistiksel fark oldu¤u saptanm›flt›r (p<0.05). Kontrol suflu iki yöntemle de negatif sonuç vermifltir.

(3)

TARTIfiMA

GSBL üreten E.coli ve Klebsiella spp. suflla- r›n›n yol açt›¤› infeksiyonlar mortalitede art›fla neden olmas›n›n yan›nda ciddi ekonomik ka- y›plara sebep olmas›ndan dolay› da önemlidir.

Rutin antibiyogram bildirimlerine bakarak GSBL varl›¤›ndan flüphelenmek mümkündür.

Sefotaksim, seftazidim, seftriakson ve/veya aztreonama al›fl›lm›fl›n d›fl›nda direnç görülmesi GSBL için uyar›c› olabilmekle birlikte, baz›

GSBL pozitif bakterilerle yap›lan duyarl›l›k de- neylerinde bir k›s›m bakterinin yanl›fll›kla duyarl› olarak bulunabilece¤i gözlenmifltir^(4,7,18). GSBL belirlemede dilüsyon yöntemleri, çift disk sinerji testi, üç boyutlu test, otomatize sistemler (Vitek gibi) ve E test kullan›labilir^(8,16,18). GSBL araflt›rmak amac›yla ÇDST halen en yayg›n kullan›lan, en ucuz ve uygulamas› en kolay olan yöntemdir.

Enterobacteriaceae ailesinde bulunan pek çok bakterinin GSBL üretti¤i bilinmektedir.

Özellikle Klebsiella spp. sufllar›nda GSBL’ye daha s›k rastland›¤›, bunun da Klebsiella spp. sufllar›nda daha s›k spontan mutasyon olmas›na ba¤l› oldu¤u bildirilmektedir⁽¹⁰⁾. Sufllar›m›zda ÇDST ile E.coli’de % 49, Klebsiella spp.’de % 44 oran›nda GSBL saptanm›flt›r. Türkiye’de GSBL oranlar›n› E.coli ve Klebsiella spp.’de s›ras› ile Özkan ve ark.(13) % 39 ve % 66, Mumcuo¤lu ve ark.⁽¹²⁾% 20 ve % 44 olarak bildirmifllerdir. De- lialio¤lu ve ark.⁽⁶⁾ klinikte yatan hastalardan

izole edilen E.coli sufllar›nda % 29, Klebsiella pneumoniae sufllar›nda % 35.8 oran›nda GSBL varl›¤›

bulmufllard›r. Yetkin ve ark.⁽²¹⁾kan kültürlerin- den izole edilen E.coli sufllar›nda % 34.5 oran›n- da GSBL tespit etmifllerdir. Dünya genelinde yap›lan çok merkezli çal›flmalarda Klebsiella spp.

izolatlar›nda GSBL oran›n›n genellikle daha yüksek oldu¤u ve oran›n farkl› ço¤rafik bölge- lerde % 2-45, E.coli’de ise bu oran›n % 6-30 oldu-

¤u bildirilmektedir^(9,19,20). Klebsiella spp.’de bul- mufl oldu¤umuz oranlar›n benzer, E.coli için bir miktar yüksek oldu¤u gözlenmifltir. Klini¤imiz- de 2002 y›l›nda Zer ve ark.⁽²³⁾ taraf›ndan yap›- lan benzer bir çal›flmada GSBL oranlar› E.coli ve Klebsiella sufllar›nda s›ras›yla % 26.19 ve % 46.34 olarak bulunmufltur. Hastanemizde Klebsiella sufllar›n›n GSBL oranlar›nda de¤ifliklik olmad›-

¤›, E.coli sufllar›nda ise artm›fl oldu¤u gözlen- mifltir. Tespit etmifl oldu¤umuz oranlardaki de-

¤iflikli¤in, hastanemizdeki direnç profilindeki de¤iflikli¤e ba¤l› olabilece¤ini, bu verilerin gün- cellenmesinin antibiyotik kullan›m prensiplerini yönlendirece¤ini düflünmekteyiz. Her bölge ve her hastanede, hatta hastanelerin farkl› servisle- rinde tespit edilen direnç oranlar› farkl› olup, bu verilerin hastanemizin çal›flm›fl oldu¤umuz peri- yottaki direnç profilini yans›tt›¤› düflünülmekte- dir. Servis ve poliklinik hastalar›ndan izole edilen sufllardaki GSBL oranlar›n›n E.coli sufllar›nda

% 61 ve % 18; Klebsiella spp. sufllar›nda % 49 ve % 21 oldu¤u, tüm sufllar için servis ve poliklinik sufllar› aras›nda anlaml› fark oldu¤u görülmüfl-

Tablo: Servis ve poliklinik hastalar›ndan izole edilen sufllarda ÇDST ile ve Vitek2 GN 13 kart› ile saptanan GSBL pozitifli¤i.

Bakteri E.coli

Klebsiella spp.

Proteus spp.

Enterobacter spp.

Toplam

ÇDST 92/151*

(61) 28/57 (49) 0/7 0/8 120/223

(54)

Vitek2 97/151

(64) 33/57 (58) 0/7 0/8 130/223

(58) Servis

ÇDST 11/61 (18) 3/14(21)

0/21 0/2 14/98

(14)

Vitek2 12/61 (20) 3/14(21)

0/21 0/2 15/98 (15) Poliklinik

ÇDST 103/212

(49) 31/71 (44) 0/28 0/10 134/321 (42)

Vitek2 109/212

(51) 36/71 (51) 0/28 0/10 145/321

(45) Toplam

* GSBL pozitif sufl say›s›/denenen sufl say›s› (% pozitiflik).

(4)

tür (p< 0.05). Servislerden izole edilen bakterilerin çeflitli faktörlerden dolay› daha dirençli oldu-

¤u göz önüne al›narak, bu, tahmin edilebilen bir sonuç olarak de¤erlendirilmifltir.

Bu çal›flmada GSBL enzimi ÇDST ve Vi- tek2 ile araflt›r›lm›fl, s›ras› ile E.coli’de % 49 ve % 51; Klebsiella spp.’de % 44 ve % 51 oran›nda GSBL tespit edilmifltir. ‹zolatlardan 6 E.coli ve 5 Klebsiella spp. suflunda ÇDST ile GSBL tespit edilmezken, Vitek2 ile tespit edilmifltir. Bu sufllarda her iki test de tekrarlanm›fl, ayn› sonuçlar al›nm›flt›r. Bunun sebebi olarak Vitek2’de GSBL belirlemek için ÇDST’den farkl› olarak, sefepi- min de test ediliyor olmas› düflünülmüfltür. Bu verilere göre ÇDST’e göre Vitek2’nin duyarl›l›¤›

% 100, özgüllü¤ü % 94.1 olarak bulunmufltur.

Sanders ve ark.⁽¹⁴⁾da Vitek2 ve ÇDST ile yapt›k- lar› benzer bir çal›flmada GSBL saptanmas›nda Vitek2’nin duyarl›l›¤›n› % 98.1, özgüllü¤ünü % 99.4 olarak bulmufllar, Vitek2 ile E.coli ve Klebsi- ella spp.’da GSBL’nin güvenilir bir flekilde tespit edilebildi¤ini bildirmifllerdir.

Sonuçlar›m›z Vitek2 GN13 kartlar›n›n ÇDST yerine GSBL saptanmas›nda kullan›labi- lece¤ini göstermektedir. ÇDST ile pozitif, Vitek2 ile negatif sonuç al›nmam›flt›r. Ancak ÇDST ile negatif, Vitek2 ile pozitif sonuç veren sufllarda ÇDST’nin mi yanl›fl negatif, Vitek2’nin mi yan- l›fl pozitif sonuç verdi¤i moleküler yöntemlerle araflt›r›lmal›d›r.

KAYNAKLAR

1. Bal Ç: Beta-laktamazlar: güncel durum, Flora 2003;8(2):111-23.

2. Bradford PA: Extended-spectrum beta-laktama- ses in the 21st century: characterization, epide- miology and detection of this important resistance threat, Clin Microbiol Rev 2001;14(4):933-51.

3. Bush K: New beta-lactamases in Gram-negative bacteria: diversity and impact on the selection of antimicrobial therapy, Clin Infect Dis 2001;32(7):108-59.

4. Büyükbaba Ö, Ayd›n D, An¤ Ö: ‹drar yolu infek- siyonu etkeni Gram negatif çomaklarda genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar›n çift disk sinerji yöntemi ile belirlenmesi, Klimik Derg 1996;9(1):27-30.

5. Datta P, Thakur A, Mishra B, Gupta V: Prevalen- ce of clinical strains resistant to various beta-lac-

tams in tertiary care hospital in India, Jpn J Infect Dis 2004;57(4):14-69.

6. Delialio¤lu N, Öcal ND, Emektafl G: Çeflitli klinik örneklerden izole edilen Escherichia coli ve Kleb- siella türlerinde genifllemifl spektrumlu beta-laktamaz oranlar›, ANKEM Derg 2005;19(2):84-7.

7. Derbentli fi, Katranc› H, Nakibo¤lu Y: Gram negatif çomaklarda genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar›n belirlenmesinde üç boyutlu yöntem ve çift disk sinerji yönteminin karfl›laflt›r›lmas›, AN- KEM Derg 1996;10(1):1-13.

8. Gill VJ, Fedorko DP, Witebsky FG: The clinician and microbiology laboratory, “Mandel GL, Ben- net JE, Dolin R (eds): Principles and Practice of In- fectious Diseases, 5.bask›” kitab›nda s.184-221, Churchill Livigstone, Philadelphia (2000).

9. Ho PL, Tsang DN, Que TL, Ho M, Yuen KY: Com- parison of screening methods for detection of extended-spectrum beta-lactamases and their prevalence among E.coli and Klebsiella spacies in Hong Kong, APMIS 2000;108(3):237-40.

10. Jacoby GA, Medeiros AA: More extended-spectrum beta-lactamases, Antimicrob Agents Che- mother 1991;35(9):1697-704.

11. Livermore DM, Brown DF: Detection of beta-lactamase-mediated resistance, J Antimicrob Che- mother 2001;48(Suppl 1):59-64.

12. Mumcuo¤lu ‹, Gündüz T, Baydur H: Escherichia, Klebsiella ve Proteus sufllar›nda genifllemifl spektrumlu beta-laktamaz varl›¤› ve çeflitli antibiyotiklere direnç durumu, ANKEM Derg 2004;18(1):9-11.

13. Özkan Ç, Oldacay M, Erdem G: Hastane infeksi- yonu etkeni olarak izole edilen Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae sufllar›nda genifllemifl spektrumlu beta-laktamaz s›kl›¤›, ANKEM Derg 2002;16(1):65-8.

14. Sanders CC, Barry AL, Washington JA et al: De- tection of extended-spectrum beta-lactamase pro- ducing members of the family Enterobacteriaceae with Vitek ESBL test, J Clin Microbiol 1996;34(12):2997-3001.

15. Sanders CC, Sanders WE: Beta-lactam resistance in gram negative bacteria; global trends and clinical impact, Clin Infect Dis 1992;15(5):824-39.

16. Sanders CC, Thomson KS, Bradford PA: Prob- lems with detection of beta-lactam resistance among nonfastidious gram negative bacilli, Infect Dis Clin North Am 1993;7(2):411-23.

17. Steward CD, Rasheed JK, Hubert SK et al: Charac- terization of clinical isolates of Klebsiella pneumoniae from 19 laboratories using the National Committee for Clinical Laboratory Standards ex-

(5)

tended-spectrum beta-lactamase detection methods, J Clin Microbiol 2001;39(8):286-472.

18. Thomson KS, Sanders CC: Detection of extended- spectrum beta-lactamases in members of family Enterobacteriaceae: comparison of the double- disk and three-dimersional tests, Antimicrob Agents Chemother 1992;36(9):1877-82.

19. Villegas MV, Correa A, Perez F, Miranda MC, Zu- luaga T, Quinn JP: Prevalence and characterization of extended spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolates from Colombian hospitals, Diagn Microbiol Infect Dis 2004;49(3):217-22.

20. Winokur PL, Canton R, Casellas JM, Legakis N:

Variations in the prevalence of strains expressing an extended-spectrum beta-lactamase phenotype and characterization of isolates from Europe, the

Amaricas, and the Western Pacific region, Clin In- fect Dis 2001;32(2):94-103.

21. Yetkin G, Kuzucu Ç, Çal›flkan A, Ay S: Kan kül- türlerinde üreyen Escherichia coli’lerin antibiyotik duyarl›l›klar›, GSBL oranlar› ve hastane birim- lerine göre da¤›l›m›, ‹nönü Üniv T›p Fak Derg 2006;13(3):147-50.

22. Yorganc›gil B: Beta-laktam antibiyotiklere karfl›

oluflan direnç mekanizmalar›, Turgut Özal T›p Merkezi Derg 1999;6(2):176-82.

23. Zer Y, Bayram A, Orhan G, Çeliksöz C, Korkmaz G, Balc› ‹: Hastanede yatan hastalardan izole edilen Gram negatif çomaklarda genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar›n ve çeflitli antibiyotiklere duyarl›l›¤›n araflt›r›lmas›, Anadolu T›p Derg 2002;4(2):71-5.