Yeni Stratejik Konseptin (New Strategic Concept)

Ao comparar a MVC entre diferentes lesões, observou-se que a mediana dos casos de líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez revelou mediana maior que nos casos de mucosa oral normal. O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis demonstrou que essas diferenças não foram estatisticamente significativas (p=0,280) (Tabela 2) (Gráfico 2).

Tabela 2 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a contagem microvascular entre as lesões de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal, RN-2014.

Lesão n Mediana Q25-Q75 Média dos postos p(1)

LPO 40 73,10 59,00-90,55 40,15 0,280

PV 18 64,90 53,95-97,35 35,78

MON 15 55,20 43,80-83,60 30,07

Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal.

(1): Teste Kruskal-Wallis.

PPGO, 2014

Gráfico 2 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal, RN-2014.

PPGO, 2014

No tocante a contagem microvascular de CD34 em relação à forma clínica dos líquens planos orais, verificou-se uma mediana ligeiramente maior para a forma clínica erosiva. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney demonstrou que esta diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,720) (Tabela 3) (Gráfico 3).

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Tabela 3 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para a contagem microvascular entre os tipos de líquen plano oral. Natal, RN- 2014.

LPO n Mediana Q25-Q75 Média dos

postos Soma dos postos U p(1) Erosivo 14 74,30 56,80-99,10 21,46 300,50 168,50 0,720 Reticular 26 72,90 60,20-87,55 19,98 519,50

Legenda: LPO, líquen plano oral. (1): Teste Mann-Whitney. Fonte: ?????

Gráfico 3 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma clínica de líquen plano oral. Natal, RN-2014.

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Figura 1 - Fotomicrografia do espécime de LPO exibindo hiperparaceratinização, epitélio de revestimento atrófico, áreas de perda de nitidez da camada basal, projeções epiteliais e infiltrado inflamatório linfocítico subepitelial (H/E, 100X).

PPGO, 2014

Figura 2 - Fotomicrografia do espécime de PV exibindo separação intraepitelial, acima da camada de células basais do epitélio, acantólise, células de Tzanck e um infiltrado leve de células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo (H/E, 100X).

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Figura 3 - LPO Reticular. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X).Fon

PPGO, 2014

Figura 4 - LPO Reticular. Marcação imunoistoquímica para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais em meio ao infiltrado inflamatório linfocítico (LSAB, 100X).

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Figura 5 - LPO Erosivo. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados (LSAB, 100X).

PPGO, 2014

Figura 6 - LPO Erosivo. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em múltiplos vasos sanguíneos (LSAB, 100X).

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Figura 7 - Pênfigo Vulgar. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados e em células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X).

PPGO, 2014

Figura 8 - Pênfigo Vulgar. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais na lâmina própria principalmente em região justaepitelial (LSAB, 100X).

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6 DISCUSSÃO

O líquen plano oral é uma doença inflamatória crônica e imunomediada, na qual são reconhecidas seis formas clínicas: reticular, papular, placa, atrófica, bolhosa e erosiva (EDWARDS; KELSCH, 2002; AL-HASHIMI et al., 2007; CARBONE et al., 2009; NICO FERNANDES; LOURENÇO, 2011). No entanto, a maioria dos autores consideram apenas duas formas principais de apresentação clínica da doença: a reticular e a atrófica/erosiva, sendo esta divisão utilizada em muitos estudos (KARATSAIDIS et al., 2003; SEOANE et al., 2004; BRANT; VASCONCELOS; RODRIGUES, 2008; CHARAZINSKA-CAREWICZ et al., 2008; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009).

Esta classificação foi utilizada no presente estudo devido, principalmente, ao comportamento biológico diferente como se apresentam, que ressalta a importância de estudá- las separadamente. Alguns autores sugerem, ainda, que as formas clínicas reticular e erosiva do LPO devam ser consideradas entidades distintas (KARATSAIDIS et al., 2003; XIA et al., 2005; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2011).

Em relação aos achados morfológicos verificados nos casos de LPO analisados neste estudo, todos estão em concordância com as citações de Sousa et al. (2009), Anuradha et al. (2011), Fernández-González et al. (2011) e Navas-Alfaro et al. (2011), onde verificaram a presença de hiperceratose, ausência de displasia, presença de projeções em “dentes de serra”, sinais de degeneração da camada basal, presença de ceratinócitos apoptóticos, além de ocasional acantose e hiperplasia. Podendo-se observar, ainda em região justaepitelial um denso infiltrado inflamatório linfocítico.

O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo, qualificada como uma doença crônica, autoimune, mucocutânea, que inicialmente se manifesta na forma de lesões intraorais, espalhando-se consequentemente para outras membranas mucosas e pele. É caracterizada clinicamente pela formação de bolhas intraepiteliais resultante do colapso da adesão celular entre as células epiteliais ( DAGISTAN et al., 2008).

O elemento semiotécnico para um diagnóstico mais simples do pênfigo vulgar é a verificação do sinal de Nikolsky. Este é positivo quando ocorre a formação de uma bolha ao se friccionar o epitélio nas proximidades das lesões já existentes, devido à facilidade de separação das células epiteliais. Embora seja de grande valia, toda a literatura concorda que este sinal não é patognomônico do pênfigo vulgar, uma vez podendo ser observado na grande

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maioria das lesões vesículo-bolhosas ( HEAPHY; ALBRECHT; WERTH, 2005; NEVILLE et al., 2009; JOLLY et al., 2010).

No que concerne aos achados histológicos do pênfigo vulgar pode ser observada separação intraepitelial (vesícula ou bolha intraepitelial) acima da camada basal das células do epitélio, sendo que esta permanece aderida à lâmina própria subjacente. No espaço vesicular são encontrados, com frequência, grupos de células que apresentam alterações degenerativas tais como tumefações dos núcleos, perda dos desmossomos, formato arredondado ou ovóide e hipercromatismo, sendo denominadas de células de Tzanck, as quais são resultantes da acantólise celular em decorrência do edema peri vesicular. Além disso, no tecido conjuntivo podem ser encontrados leucócitos polimorfonucleares e linfócitos em número variados. Essas características observadas nos espécimes de pênfigo vulgar analisadas neste estudo são condizentes com os descritos na literatura (WILLIAMS, 1989; WEINBERG; INSLER; CAMPEN, 1997; NEVILLE et al., 2009).

A angiogênese representa um ciclo de um processo vital que leva a formação de vasos sanguíneos a partir de uma estrutura vascular pré-existente. Exceções fisiológicas em que este processo ocorre sob forte regulação são encontradas no sistema reprodutivo feminino e durante o processo de cicatrização de feridas. Por sua vez, a angiogênese não regulada adequadamente pode resultar em diferentes patologias, tais como a artrite reumatoide, a retinopatia diabética, a psoríase e o hemangioma juvenis. Além disso, sabe-se que o crescimento tumoral também é dependente da angiogênese, uma vez que este necessita de uma extensa rede de capilares sanguíneos para que sejam fornecidos ao tumor nutrientes e oxigênio necessário para a sua sobrevivência e desenvolvimento. Desse modo, todo sistema orgânico pode envolver doenças em que a angiogênese é um importante componente. (HYDER; STANCEL, 1999; LIEKENS; DE CLERCQ; NEYTE, 2001).

Muitos estudos científicos (JAKOBSON; CLAESSON-WELSH, 2008) têm mostrado a importância da angiogênese nos mecanismos crônicos inflamatórios, bem como tem-se verificado a presença de neoangiogênese em patologias que apresentam essas características, como aquelas doenças já citadas anteriormente.

Sabe-se que a angiogênese tem um importante papel nas doenças crônicas inflamatórias, não apenas causando a geminação de novos vasos sanguíneos, que permite uma melhor oxigenação e uma maior contribuição dos metabólitos para a proliferação tecidual, mas também um notável aumento do complexo sistema de feed-back e turnover das células envolvidas no processo inflamatório (MONACO et al., 2004). Além disso, foi estudado por Monaco et al. (2004), durante a iniciação e progressão da aterosclerose e artrite reumatoide,

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que o CD40L nos sítios inflamatórios estimula os fibroblastos e monócitos/macrófagos a produzirem VEGF, levando a angiogênese, a qual promove a manutenção do processo crônico inflamatório.

Como verificado na revisão de literatura deste estudo, a angiogênese pode ser avaliada quantitativamente através de várias metodologias por meio da avaliação microscópica da vascularização tumoral, lançando-se mão de anticorpos específicos para as células endoteliais, como VEGF, CD31, CD34, CD44, CD105 e o fator von Willebrand (DUFF et al., 2003; ABBAS; LICHTMAN, 2005; MINHAJAT et al., 2006; LIORCA et al., 2007; NETTO et al., 2008).

Contudo, os autores são conflitantes na escolha do marcador imunoistoquímico que oferece melhores resultados na avaliação da angiogênese. De um lado, alguns pesquisadores como Martone et al. (2005), Chien et al. (2006), Chuang et al. (2006), Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006), Taskiran et al. (2006), Nikiteas et al. (2007), Soares et al. (2007) e Netto et al. (2008) o CD105 é um excelente anticorpo para avaliação da angiogênese. Por outro lado, Traweek et al. (1991), Costa e Guinee (2000), Lopez-Graniel et al. (2001), Di Carlo et al. (2002), Teo et al. (2003), Guttman et al. (2004) e Ascani et al. (2005), recomendam para análise da vascularização o CD34.

Desse modo, no estudo realizado, optou-se em avaliar de forma comparativa a expressão imunoistoquímica do marcador CD34 em lesões de LPO reticular, LPO erosiva e pênfigo vulgar, lesões estas produzidas por doenças automimunes, crônicas inflamatórias, de mesmo nome, que mostram sinais e sintomas na mucosa oral nos portadores dessas doenças.

De acordo com Vermeulen et al. (2002), Freitas et al. (2005) e Souza, Freitas e Miranda (2007) a quantificação de vasos sanguíneos em secções histológicas pode ser útil como indicador de prognóstico em lesões de cabeça e pescoço. No entanto, a mesma pode ser influenciada por vários fatores, incluindo o tipo de fixador utilizado, o pré-tratamento dos espécimes antes da marcação, o método de quantificação empregado e o anticorpo selecionado. Schor et al. (1998a) afirmaram que o pré-tratamento das secções histológicas é a variável que mais exerce influência na estimativa da vascularização em espécimes teciduais. Estes pesquisadores demonstraram, através de um estudo comparativo entre diferentes metodologias destinadas à quantificação da angiogênese, que a variação no tipo de tratamento dos espécimes teciduais (digestão enzimática e aquecimento) produzia diferentes valores de índices angiogênicos colocando em questão o resultado da pesquisa. Perante estas observações, no presente estudo, buscou-se seguir a reprodutibilidade das técnicas conforme as determinações do fabricante do anticorpo utilizado (BOURNE, 1983), ressaltando-se, dessa

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forma, a necessidade de se padronizar um protocolo para a determinação da angiogênese, pois variações na metodologia poderiam ocasionar falhas na técnica de coloração e na obtenção do índice angiogênico (DUFF et al., 2003; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).

Devido às diferentes recomendações de técnicas destinadas à quantificação da angiogênese (WEIDNER et al, 1991; PAZOUKI et al., 1997; MAEDA et al., 1995) inicialmente foi realizada uma pequena avaliação da MVD, MVC e MVV e verificou-se que a MVC foi o método de obtenção do índice angiogênico mais simples, efetivo e de fácil aplicabilidade encontrado para a análise da angiogênese de tumores de cabeça e pescoço (MAEDA et al., 1995; FRIDMAN et al., 2000; FREITAS et al., 2005; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).

Assim sendo, em relação ao método de contagem de microvasos, Jacquemier et al. (1998) tentando estabelecer parâmetros comparativos de agressividade e sensibilidade terapêutica em pacientes portadores de câncer de mama entre a determinação da MVC, utilizando o anticorpo anti-CD31, e Erenoglu et al. (2000 buscando uma correlação e dados clínicos patológicos do carcinoma gástrico, por intermédio da marcação do anticorpo anti- fator VIII; certificaram que a MVC tem grande valor de prognóstico, especialmente na indicação de pacientes com alto índice de recidiva e com necessidade de terapia pós- operatória complementar. No entanto, Fridman et al. (1998) sugerem que essa técnica deve ser bem mais estudada e otimizada antes de ser utilizada na rotina para a determinação prognóstica nos mais variados tipos de cânceres humanos.

Ressaltou-se, neste estudo, que a expressão imunoistoquímica do anticorpo anti-CD34 nas lesões de LPO e PV foi restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos grupamentos de células endoteliais as quais não formavam lúmen sendo, dessa forma, equivalente com os trabalhos que afirmam que o anticorpo CD34 possui afinidade por epítopos específicos de células endoteliais (MARTONE et al., 2005; SOARES et al., 2007; YANG et al., 2006; NETTO et al., 2008).

De acordo com Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006), poucos estudos existem sobre a marcação do anticorpo CD-34 em vasos linfáticos, no entanto, nesta pesquisa, é possível que dentre os vasos imunomarcados existam alguns do tipo linfático, porém de pouca significância na avaliação da angiogênese. Durante a análise dos resultados verificou-se, de forma cautelosa, a morfologia dos componentes celulares imunomarcados, evitando, desse modo, erro na contagem microvascular, podendo-se afirmar que a maior parte da marcação ocorreu no endotélio vascular dos espécimes estudados.

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Verificou-se ainda que o CD34 reagiu preferencialmente com 100% dos casos de LPO - reticular e erosivo e de PV, demonstrando que este marcador apresenta alta sensibilidade de imunomarcação, fato verificado em diversas condições tumorais, conforme observado por Traweek et al. (1991) em angiossarcomas, sarcoma de Kaposi e hemangioendotelioma epitelioóide; Guttman et al. (2004) em carcinoma epidermóide de língua e Yang et al. (2006) em carcinoma hepatocelular.

Somando-se a isso, de acordo com Heimburg et al. (1999), Yoshida et al. (1999) e Di Carlo et al. (2002), o CD34 é o anticorpo de eleição na avaliação da angiogênese. Tais afirmações não são similares aos achados de Saad et al. (2004), em um estudo realizado em câncer colorretal, que recomendam o uso do anticorpo CD105 como marcador endotelial ideal para a mensuração da angiogênese, bem como valor preditor de metástase em comparação com os marcadores pan-endoteliais. Entretanto, nesta pesquisa, apesar de não ter sido lançado mão de outro marcador para possível comparação, os espécimes submetidos à marcação com CD34, exibiram um padrão de marcação uniforme e de fácil interpretação.

No estudo de Tao et al. (2007), no qual o anticorpo anti-CD34 foi utilizado para auxilar na determinação da microdensidade vascular em casos de LPO, observou-se uma alta marcação citoplasmática no endotélio vascular de todos os espécimes por esse marcador. Além disso, foi ressaltado que a MVD no grupo dos pacientes com LPO foi significativamente elevada em relação aos grupos controles.

Ao que diz respeito às lesões de LPO, os resultados deste estudo não foram concordantes com as poucas pesquisas que avaliam a angiogênese nessas lesões, uma vez que pôde-se observar ausência de diferença estatística significativa na determinação das médias da contagem microvascular (MVC), entre as lesões de LPO reticular e os espécimes de mucosa oral normal e entre as lesões de LPO erosivo e os espécimes de mucosa oral normal. Contudo, quando comparamos a mediana da MVC, nesta pesquisa, entre as lesões de LPO e os espécimes de mucosa oral normal ressalva-se que esta mostrou-se maior nos casos de LPO dos que nos espécimes de mucosa oral normal; e que a mediana nas lesões de LPO erosivo foi ligeiramente maior do que nos casos de LPO reticular.

Estes resultados são contrários aos encontrados no estudo de Scardina et al. (2009), o qual observou uma maior expressão de CD34 em amostras de LPO (54,3%), bem como de outros marcadores como o VEGF (64,2%), VCAM-1 (32,5%) e ICAM-1 (29,7%), levando-os a concluir que o número de vasos sanguíneos em biópsias de pacientes com LPO estava significativamente elevado (média ± DP: 21,27 ± 4,85) quando comparado com indivíduos saudáveis (média ± DP: 4,74 ± 0,97).

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Nossos resultados também foram discordantes dos encontrados na pesquisa de Mittal, Shankari e Palaskar (2012), uma vez que também avaliando o índice angiogênico (MDV) com o auxílio do imunomarcador CD34, os mesmos observaram diferença estatística significativa entre as lesões de LPO (97,24 ± 42,887) e o grupo controle (44,47 ± 9,942).

Por sua vez, os resultados do estudo de Khalili, Eshghyar e Asgari (2013) também foram diferentes dos nossos encontrados, o qual mostrou que utilizando a imunomarcação do CD34 e CD105, a MDV em amostras de LPO foi significativamente maior do que nos casos de mucosa oral normal (6,05 ± 0,86).

Quanto à expressão do CD34 entre lesões de LPO reticular e erosivo, nossa pesquisa não encontrou diferença estatisticamente significativa entre ambas as lesões na avaliação da MVC. Este resultado discordou dos encontrados por Mittal, Shankari e Palaskar (2012) e Khalili, Eshghyar e Asgari (2013), uma vez que estes pesquisadores certificaram-se que as lesões de LPO erosivo - (129,71 ± 49,253), (31,8 ± 5,39) apresentavam um maior índice angiogênico quando comparadas com as lesões de LPO reticular – (84,61 ± 33,724). Ambos os estudos concluem com seus respectivos resultados que a angiogênese seria um dos principais fatores que contribuem na patogênese e progressão do líquen plano oral.

No que concerne às lesões de pênfigo vulgar, os resultados do nosso estudo não mostraram diferença estatística significativa quando comparamos a MVC nas lesões de PV com os espécimes de mucosa oral normal. Entretanto, quando observamos as medianas em ambos os casos, podemos perceber que esta é ligeiramente maior nos casos de PV do que nos espécimes de mucosa oral normal. Do mesmo modo, não observamos, em nossos resultados, diferença estatisticamente significativa entre as lesões de PV e os casos de LPO reticular, nem mesmo entre as lesões de PV e os casos de LPO erosivo. Contudo, podemos observar que a mediana da MVC das lesões de PV é ligeiramente menor do que nos espécimes de LPO, tanto nas lesões reticulares quanto nas erosivas.

Como este foi o primeiro estudo que tentou avaliar a angiogênese nessas lesões não podemos comparar nossos resultados para se chegar a uma conclusão sobre essa questão. Contudo, Cunha et al. (2004) e Lee (2011) relataram em seus respectivos casos clínicos uma significativa remissão das lesões de pênfigo vulgar após a administração oral da talidomida; sendo notado também o retorno das mesmas quando o uso desse medicamento era interrompido. Porém, os mecanismos pelos quais a talidomida age no pênfigo ainda não estão esclarecidos. Estes pesquisadores especularam que tal medicamento exerce seus benefícios clínicos no PV através dos efeitos citocinas-moduladores e que agentes imunossupressores podem interferir nesses efeitos da talidomida.

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Adicionalmente, D’amato et al. (1994) observaram em modelos animais que a talidomida apresenta propriedades antiangiogênicas, porém o mecanismo pelo qual isso acontece é desconhecido. Mathews e McCoy (2003) observaram que essa inibição ocorria apenas após a administração oral da talidomida, sugerindo a hipótese de que um metabólito ativo é formado in vivo.

Sabendo que a talidomida suprime nos macrófagos a produção de TNF-α, que é fracamente angiogênico in vivo; e age secundariamente induzindo uma inflamação, D’amato et al. (2004) hipotetizaram, então, que a talidomida inibia diretamente um componente essencial da angiogênese e não agia através do efeito da produção de TNF-α. Somando-se a isso, Kruse et al. (1998), relataram que a talidomida inibe a angiogênese induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),o qual é um potente mediador da angiogênese (TAO et al., 2007).

Diante dos estudos supracitados, acreditamos que por o PV ser uma doença crônica autoimune inflamatória, assim como o LPO, e por apresentarem remissão da doença após o uso da talidomida, uma droga com possíveis propriedades antiangiogênicas; estas lesões supostamente poderiam apresentar um índice angiogênico significativamente maior do que os casos de mucosa oral normal. No entanto, diante dos nossos resultados, podemos concluir que apesar de estas lesões terem apresentado leve aumento do número de vasos sanguíneos em relação ao grupo controle a insignificância estatística, de fato, nos impede de afirmar que existe angiogênese nas lesões de pênfigo vulgar pertencentes a amostra desta pesquisa.

Isto posto, destacamos que o papel exato da angiogênese nas lesões crônicas inflamatórias, aqui estudadas, e sua relação com a progressão e o desenvolvimento destas ainda necessita ser esclarecido, com o objetivo de que o processo angiogênico possa ser mais um parâmetro seguro a ser utilizado como ferramenta na identificação do potencial biológico e como adjuvante nas técnicas terapêuticas disponíveis.

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7 CONCLUSÕES

Os resultados encontrados no presente estudo permitem concluir que:

 Foram encontrados maiores índices angiogênicos, medidos por intermédio do imunomarcador CD34 no grupo de LPO (reticular e erosivo) quando comparados aos espécimes de mucosa oral normal. Assim como os índices angiogênicos nas lesões de LPO erosivo apresentaram-se ligeiramente superiores aos encontrados nas lesões reticulares.

 Os achados encontrados nesta pesquisa, associados aos dados relatados na literatura, sugerem uma possível participação do processo angiogênico na patogênese e progressão das lesões de líquen plano oral.

 Não foram encontradas diferenças dos índices angiogênicos, quantificados através da imunomarcação do CD34, entre as lesões de PV e os espécimes de mucosa oral normal. Porém, pôde-se perceber um ligeiro aumento no número de vasos nas lesões de PV em relação aos espécimes de mucosa oral normal.

 Uma ligeira diminuição do número de vasos sanguíneos foi observada em lesões de PV quando comparadas com as lesões de LPO (tanto as erosivas quanto as