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Dependendo do tipo de interação os biossensores podem ser classificados em sensores biocatalíticos ou sensores de bioafinidade.

2.4.1.1 Sensores biocatalíticos

Este tipo de biossensor utiliza biocatalisadores constituídos por enzimas ou sistemas multi-enzimáticos isolados, organismos celulares, células completas de tecidos animais ou vegetais (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). A seguir veremos a descrição de alguns dos elementos de reconhecimento do tipo biocatalítico. Estes elementos de reconhecimento podem acoplar-se a distintos tipos de transdutores como eletroquímicos, ópticos e termométricos.

Enzima

Em uma reação catalisada por uma enzima há uma união do substrato em uma região especifica de sua estrutura denominada de centro ativo, que compreende um sítio de ligação e um sítio catalítico. Uma vez formados os produtos, a enzima se recupera podendo começar um novo ciclo de reação. Em ocasiões, pode ser necessária a presença de cofatores para que a enzima possa se regenerar (ROVER JUNIOR, L. et al., 2001). A atividade enzimática é controlada normalmente pelo pH, a força iônica, a temperatura e a presença de cofatores. Sua estabilidade é um fator limitante para o tempo de vida do biossensor do tipo enzimático.

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Células completas

Neste caso, em vez de purificar as enzimas, utiliza-se como elemento biológico, uma célula completa que possui em seu interior sistemas multi-enzimáticos em meio natural, sendo capaz de utilizar células modificadas geneticamente. A utilização de células completas oferece uma sensibilidade ampla à variedade de substâncias de ocorrência natural ou mesmo sintética. Além disso, a própria célula fornece o mecanismo de transdução que vincula o reconhecimento molecular de uma substância de teste a um evento mensurável pelo observador humano; podem estar relacionadas células bacterianas, fúngicas, protozoários ou células provenientes de organismos superiores e podem ser viáveis ou não (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Células viáveis podem metabolizar diversos compostos orgânicos dando lugar ao surgimento de distintos produtos como amônio, dióxido de carbono e ácidos que podem ser monitorizados com o uso de transdutores específicos. São utilizados para detectar a presença de compostos relacionados ao metabolismo como vitaminas, açucares e ácidos orgânicos ou compostos nitrogenados. Também são úteis para detectar compostos que inibem a respiração microbiana como contaminantes ambientais ou substâncias tóxicas.

A maior limitação em se utilizar células completas está na difusão dos substratos e produtos através da membrana celular que resulta em uma resposta mais lenta comparada com os sensores baseados em enzimas purificadas. Esta limitação pode ser suprimida mediante a permeabilização da membrana por meio de métodos físicos como tratamentos que permitem a formatação de poros nas membranas, facilitando a difusão de moléculas pequenas e retendo a maior parte dos compostos macromoleculares, como o caso das enzimas, dentro das células. Como conseqüência desses tratamentos a célula torna-se viável, pois serve como uma fonte enzimática intracelular. Pode-se utilizar para aplicações que não requerem regeneração celular de cofatores ou respiração metabólica como é o caso de aminoácidos, de enzimas, oxidases e invertases, etc. Outra limitação das células completas, em comparação com as enzimas purificadas, é que elas têm uma menor especificidade devido a reações catalisadas por outras enzimas presentes.

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Organismos subcelulares

Os organismos subcelulares podem conter determinados sistemas enzimáticos completos, mas não possuem todos componentes presentes em uma célula completa (ROVER JUNIOR, L. et al., 2001) como é o caso de cloroplastos completos, tilacoides ou mitocôndrias. Mitocôndrias e cloroplastos são organismos que cobrem as membranas que possuem sistemas enzimáticos relacionados com a obtenção de energia do interior da membrana. Determinados agentes tóxicos como praguicidas, metais pesados ou detergentes atuam sobre estes sistemas enzimáticos inibindo, de modo que as membranas internas desses organismos podem ser utilizadas como biossensores para detectar este tipo de compostos.

Tecidos

Existem determinados vegetais que, devido à sua função fisiológica no organismo, são uma fonte de enzimas ou sistemas enzimáticos. Podem ser utilizados tecidos distintos como folhas, raízes, frutas ou sementes, preparados e homogeneizados (LOUZADA et al., 2004). Apesar de haver uma tendência recente de utilização de tecidos de vegetais e/ou extratos brutos no lugar de enzimas purificadas na confecção de biossensores e/ou procedimentos enzimáticos de análise.

O uso de extratos brutos e/ou tecidos vegetais pode apresentar, em alguns casos, certa desvantagem na seletividade do método analítico (VIEIRA et al., 2004), demonstrados na Quadro 2.2. Mas, por outro lado, são extremamente econômicos e, geralmente, possuem tempo de vida superior àqueles métodos que utilizam enzimas purificadas, visto que estas enzimas naturalmente imobilizadas nas células destes matérias biológicos (habitat natural) são mais estáveis e geralmente possuem o seu cofator disponível (FATIBELLO; VIEIRA, 2002). O Brasil tem uma grande variedade de vegetais que se podem constituir em fontes inesgotáveis de enzimas para ser aplicados nas mais diversas áreas do conhecimento.

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Vantagens Desvantagens

Baixo custo Limitada

seletividade

Simplicidade na construção Resposta lenta

Elevada estabilidade Baixa sensibilidade

Evitam processos de extração e purificação de enzimas Não requerem a adição de cofatores de regeneração enzimática

Vida útil apropriada Atividade elevada

Quadro 2.2: Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados e transdutores eletroquímicos 2.4.1.2 Sensores de bioafinidade

A interação entre o analito de interesse e o elemento de reconhecimento, sem que exista transformação catalítica é a base para o entendimento dos sensores de bioafinidade (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Para medir a interação, onde não existe consumo de substratos nem a geração de produtos, se podem utilizar um marcador no receptor.

O inconveniente deste tipo de sistemas é que se requerem alguns passos posteriores como limpeza e separação do excesso de moléculas marcadas e a adição de substratos.

Existem distintos tipos de receptores de bioafinidade como anticorpos, lectinas, células completas, ácidos nucléicos, PIMs, aptâmeros e PNAs.

Anticorpos

A maior parte dos biossensores de bioafinidade baseia-se nas reações de união de antígenos a anticorpos específicos. Um anticorpo é uma proteína que se une, de maneira seletiva, a uma molécula complementar denominada antígeno que, neste caso, corresponde ao analito. A detecção de cada antígeno requer a produção de um anticorpo particular, seu isolamento e, em algumas ocasiões, sua purificação

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(DAMOS et al., 2004). Em geral, o antígeno e o anticorpo são espécies eletroquimicamente inertes e, portanto, o imunosensor eletroquímico requer um marcador que será útil para monitorar a reação de afinidade (RICCARDI et al., 2002). Nesse sentido, o anticorpo ou o antígeno deve ser marcado com enzima, constituindo então o conjugado.

A especificidade e afinidade da interação antígeno-anticorpo determinam a seletividade e sensibilidade do imunosensor, assim como a possibilidade de regeneração. Na prática, para alcançar uma sensibilidade adequada é necessário que o complexo tenha uma alta afinidade, sendo difícil sua dissociação, porque esses sistemas possuem um único uso. Não obstante, o anticorpo pode regenerar- se por dissociação dos complexos mediante a aplicação de agentes distintos que mudam as condições do meio e favorecem esta dissociação, porém, em alguns casos, essas condições prejudicam a estrutura do anticorpo.

Receptores moleculares

As interações de reconhecimento molecular são eventos importantes considerando-se os aspectos biológicos. Este tipo de afinidade entre biomoléculas tem sido bastante investigado, nos últimos anos (FERREIRA, 2006) Nas membranas celulares existem distintos receptores moleculares, além de proteínas de ligação que podem imobilizar-se em diferentes superfícies e ser utilizadas como elementos de reconhecimento associados aos diversos transdutores. Existem proteínas transportadoras que formam canais que podem acoplar-se a membranas lipídicas sintetizadas de maneira artificial. A união do analito a estes receptores produz a formação de canais através dos quais se gera um fluxo de íons que se pode monitorar mediante tipos distintos de transdutores eletroquímicos (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Células completas

As células completas oferecem uma grande sensibilidade a muitas substancias natural ou sintética, além de detectar um grande número de compostos químicos dentro de um intervalo maio de pH e temperatura (id.). Nas células existem receptores moleculares de membrana, as quais se unem a um ligante

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correspondente emitindo respostas fisiológicas amplificadas como a abertura de canais iônicos, a ativação de sistemas mensageiros secundários e a ativação de enzimas que podem ser monitoradas por transdutores distintos. Estes tipos de receptores apresentam afinidade por compostos relacionados estruturalmente, tornando-se interessantes para a detecção de multi-analitos.

Lectinas

As lectinas pertencem a um grupo de proteínas, que se unem de maneira seletiva e reversível a alguns sacarídeos como os oligossacarídeos, que se encontram nas paredes celulares das bactérias. São moléculas facilmente disponíveis e econômicas que podem associar-se a transdutores como os piezoelétrico (id.).

Ácidos nucléicos

O comportamento eletroquímico do DNA e os efeitos de sua adsorção sobre diversos tipos de eletrodos vêm sendo pesquisados (LA-SCALEA; SERRANO; GUTZ, 1999). Os biossensores para análise de DNA baseiam-se no processo de hibridização quando ocorre a união de uma cadeia de DNA com sua cadeia complementar, também conhecido como gene chips, utilizados para o reconhecimento e quantificação de DNAs nas amostras de interesse. Este processo pode ser realizado em dissolução de suportes sólidos e em seguida utilizam marcadores específicos que se unem às seqüências híbridadas, como marcadores fluorescentes ou enzimáticos. Podem acoplar-se em sistemas de transdução ópticos, gravimétricos e eletroquímicos. São utilizados para a detecção de organismos modificados geneticamente e microorganismos patógenos.

Polímeros de impressão molecular

Polímeros de impressão molecular ou PIMs (“Moleculary Imprinted Polymers”) são matrizes sintetizadas artificialmente que apresentam, em teoria, a capacidade de reconhecer e interagir de forma específica com determinados compostos. A biomimetização de interações bioquímicas é um dos maiores desafios em várias áreas da ciência (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005), tornando-se uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de sistemas com reconhecimento

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biomimético semelhante aos sistemas específicos enzima-substrato e/ou antígeno- anticorpo. Suas principais vantagens em relação aos materiais biológicos estão na possibilidade de síntese em situações onde nenhuma biomolécula se encontra disponível ou em ambientes adversos, nos quais biomoléculas naturais não resistiriam, como na presença de ácidos, bases, íons metálicos, solventes orgânicos, altas temperaturas e alta pressão.

Aptâmeros

Os aptâmeros (Apts) são pequenas moléculas capazes de reconhecer e ligar-se a proteínas-alvo com afinidade e especificidade muito elevadas (FAROKHZAD et al., 2006). Por ser uma seqüência de oligonucleotídeos (DNA ou RNA) de cadeia simples sintetizada artificialmente, são capazes de reconhecer diversas moléculas com afinidade e especificidade elevadas (FERIOTTO et al., 2001). Estas moléculas se assemelham aos anticorpos, adquirindo uma conformação determinada podendo unir-se ao analito (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Ácidos nucléicos peptídicos

Os ácidos nucléicos peptídicos ou PNAs são outro tipo de moléculas sintéticas que mimetizam o DNA-RNA. Logo, sua estrutura é muito similar a estes ácidos (FERIOTTO et al., 2001). Estão formados por um esqueleto de monômeros (N-2- aminoetilglicina) unidos por ligações peptídicas com bases nitrogenadas. A diferença dos ácidos nucléicos para os PNAs é ausência de pentoses nos grupos fosfato. A principal vantagem dessas moléculas, frente a seus análogos naturais e sua grande afinidade para estabelecer ligações com cadeias de DNA. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).