Sucessivos fracionamentos cromatográficos da fração diclorometano, obtida a partir do extrato etanólico do cerne de C. glazioviana levaram ao isolamento do composto 1, uma resina amarela (item 3.5.4, p. 63), apresentando rotação óptica [α]D20 -13,5 (c 0,1; diclorometano).
O espectro de absorção na região do infravermelho de 1 (Fig. 16, p. 85) exibiu como principais absorções as bandas em: 3382 cm-1 (ligação O-H), 1709 cm-1 (ligação C=C), 1455 e
1375 cm-1 (características de dobramento de –CH
3) e bandas na faixa 1115-1020 cm-1 (de
ligação C-O).
O espectro de massa de alta resolução (APCI – EM; Fig. 22, p. 88) apresentou o pico do aduto de sódio [M + Na]+ em m/z 279,1963 (calcd. m/z 279,1931) indicando fórmula molecular C15H28O3Na com um IDH igual a 2.
O espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl
3 – Fig. 17, p. 85) de 1 apresentou um
simpleto largo em δH 5,37 (H-3) para hidrogênio olefínico, um sinal em δH 3,37 (dd, J = 7,9; H-
10) de hidrogênio carbinólico, quatro sinais para hidrogênios metílicos em δH 1,64 (Me- 15), δH
1,22 (Me-12), δH 1,21 (Me-13) e δH 1,15 (Me-14), além de uma série de sinais na faixa de δH
1,94 a 1,48, onde o sinal em δH 1,48 (m, H-1) corresponde a um hidrogênio metínico.
A análise do espectro RMN 2D 1H,1H-COSY (Fig. 21, p. 87) mostrou acoplamentos
spin-spin entre os hidrogênios em δH 1,94 (m, H-6a) e 1,64 (m, H-6b) com os hidrogênios em
δH 1,94 (m, 2H-5), entre o hidrogênio em δH 1,48 (m, H-1) e a metila Me-14 (δH 1,15), assim
como dos hidrogênios em δH 1,75 (m, H-9a) e 1,72 (m, H-9b) com os hidrogênios em δH 1,48
(m, H-8a) e 1,58 (m, H-8b), e com o hidrogênio H-10 (δH 3,37). As correlações observadas encontram-se apresentadas na Figura 14 (p. 83).
O espectro de RMN 13C CPD (75 MHz, CDCl
3 – Fig 18, p. 86) exibiu 15 linhas
espectrais e sua comparação com o espectro DEPT 135° permitiu definir a existência de quatro carbonos metílicos, cinco carbonos metilênicos, três carbonos metínicos, sendo um olefínico (δC 121,0; C-3) e um oxigenado (δC 75,4; C-10) e três carbonos não hidrogenados, um olefínico
(δC 134,3; C-4) e dois oxigenados em δC 74,7 (C-7) e 74,6 (C-11) (Tabela 45, p. 84).
Através do espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC (Fig. 19, p. 86) foi possível
carbonos em δC 30,1, 22,4, 22,6 e 23,6, respectivamente. Os carbonos metilênicos foram identificados na faixa entre δC 23,6 – 32,4, enquanto os hidrogênios metínicos H-1, H-3 e H-10 foram devidamente correlacionados aos sinais de carbono em δC 45,9, 121,0 e 75,4, respectivamente.
Os dados apresentados apontam 1 como sendo um sesquiterpeno, condizente com a classe dos bisabolanos (Figura 13), apresentando em sua estrutura uma insaturação e três grupos hidroxilas, como sugerido pelo EM e RMN 13C.
Figura 13-Estrutura básica de um sesquiterpeno de esqueleto bisabolano.
A completa elucidação da estrutura de 1 foi possível devido às correlações a longa distância observadas no espectro de RMN 2D 1H, 13C - HMBC (Fig. 20, p. 87). O sinal de
hidrogênio da metila Me-15 (δH 1,64) apresentou correlações com os carbonos olefínicos C-3 (δC 121,0) e C-4 (δC 134,3) e com C-5 (δC 31,3), permitindo posicionar a dupla ligação entre os
dois primeiros; a metila Me-14 (δH 1,15) mostrou correlações com os carbonos C-1 (δC 45,9) e
C-8 (δC 32,4) enquanto as metilas Me-12 (δH 1,22) e Me-13 (δH 1,21) mostraram correlações
com os carbonos oxigenados C-10 (δC 75,4) e C-11 (δC 74,6). O hidrogênio H-10 (δH 3,37) e
2H-9 (δH 1,75/1,72) mostraram correlações com o carbono oxigenado C-11 (δC 74,6). As
principais correlações encontradas no espectro HMBC encontram-se demonstradas na Figura 14 abaixo.
A comparação dos dados apresentados, com os descritos na literatura permitiu identificar o composto em discussão como sendo o sesquiterpeno bisabolano 10,11- dihidroxibisabolol (Fig. 15), relatado na literatura pela primeira vez como um dos produtos majoritários da bioconversão de (-)-α-bisabolol por Aspergillus niger (MIYAZAWA et al,
1992) e, como produto natural, foi isolado pela primeira vez a partir do fungo Bionectria sp. (FIGUEROA et al, 2013).
Figura 15-Estrutura do composto 1 denominado 10,11-dihidroxibisabolol
Tabela 45-Dados de RMN de 1H e 13C (300/75 MHz, CDCl 3) de 1 (δ em ppm, J em Hz). HSQC C δC δH 1 45,9 1,48 (1H, m) 2 26,5 1,75 (1H, m) 1,94a (1H, m) 3 121,0 5,37 (1H, sl) 4 134,3 5 31,3 1,94a (2H, m) 6 23,6 1,94a (1H, m) 1,64a (1H, m) 7 74,7 8 32,4 1,48 (1H, m) 1,58 (1H, m) 9 25,2 1,75 (1H, m) 1,72 (1H, m) 10 75,4 3,37 (1H, dd, 7,9) 11 74,6 12 30,1 1,22 (3H, s) 13 22,4 1,21 (3H, s) 14 22,6 1,15 (3H, s) 15 23,6 1,64 (3H, s) aSobreposição de sinais
Figura 16-Espectro de infravermelho do composto 1.
Figura 17-Espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl
Figura 18-Espectro de RMN de 13C [75 MHz, CDCl
3] do composto 1.
Figura 19-Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC [300 x 75 MHz, CDCl
Figura 20-Espectro de RMN 2D 1H,13C-HMBC [300 x 75 MHz, CDCl
3] do composto 1.
Figura 21-Espectro de RMN 2D 1H,1H-COSY [300 x 300 MHz, CDCl
D D
Figura 22-Espectro de massas de alta resolução (modo positivo) do composto 1.
4.1.2 Determinação estrutural do composto 2
O composto 2 foi obtido a partir de fracionamentos cromatográficos da fração diclorometano do extrato etanólico do cerne de C. glazioviana (item 3.5.4, p. 63) e apresentou- se como uma resina incolor com [α]20 + 34,8 [c 0,5; metanol; lit. [α]23 + 71, c 0,5, metanol
(HASHIDOKO et al, 1992)].
O espectro de absorção no infravermelho (Fig. 25, p. 91) de 2 apresentou uma banda larga em 3382 cm-1 típica de estiramento de ligação O-H, uma banda intensa em 1682 cm-1 de
C=O conjugada e uma banda em 1046 cm-1 de ligações C-O.
O espectro de massa de alta resolução (ESI-EM) (Fig. 31, p. 94) de 2 mostrou um pico referente ao aduto com potássio [M + K]+ em m/z 275,1690 sugerindo a fórmula molecular C15H24O2K (calcd. m/z 275,1688), equivalente a um índice de deficiência de hidrogênio (IDH)
igual a 4.
A análise do espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl
3 – Fig. 26, p. 91) revelou um
sinal em δH 9,44 (s, H-15) típico de hidrogênio de aldeído, sinais para hidrogênios olefínicos em δH 6,81 (t, J = 5,0 Hz; H-5) e 5,14 (tl, J = 7,0 Hz; H-10) e três sinais para metilas em δH 1,69
(s, Me-12), 1,63 (s, Me-13) e 1,17 (s, Me-14). Foram observados também vários sinais na faixa de δH 1,24 - 2,52, pertencentes a hidrogênios metilênicos e metínicos, ressaltando a natureza terpênica de 2.
O espectro de RMN 2D 1H, 1H - COSY (Fig. 30, p. 93) evidenciou os acoplamentos
entre os hidrogênios em δH 6,81 (H-5) com os hidrogênios em δH 2,03 (H-6b) e 2,51 (H-6a), e
destes com o hidrogênio em δH 1,69 (H-1). Foi observada ainda a correlação do hidrogênio metínico em δH 5,14 (H-10) com o sinal em δH 2,06 (2H-9), conforme ilustradas na Figura 23
O espectro de RMN 13C CPD (75 MHz, CDCl
3– Fig 27, p. 92) de 2 apresentou 15 linhas
espectrais, sendo este, provavelmente, um sesquiterpeno bisabolano, assim como 1. Através do espectro de RMN 2D 1H, 13C – HSQC (Fig. 28, p. 92) foi possível observar três carbonos
metílicos [δC 23,8 (C-14), 25,9 (C-12) e 17,9 (C-13)], cinco carbonos metilênicos, quatro carbonos metínicos, dentre eles, uma carbonila aldeídica (δC 194,0; C-15) e dois olefínicos [δC
151,1 (C-5) e δC 124,3 (C-10)], bem como três carbonos não-hidrogenados, sendo dois olefínicos [δC 141,7 (C-4) e 132,3 (C-11)] e um oxigenado [δC 74,1 (C-7)] (Tabela 46, p. 90)
Os dados apresentados mostram-se semelhantes aos do composto 1, levando a concluir que 2 também se trata de um sesquiterpeno de esqueleto bisabolano, apresentando as funções aldeído, álcool e duas insaturações.
A posição dos grupos aldeído e álcool e das insaturações na estrutura proposta foi possível através das correlações apresentadas pelo espectro de RMN 2D 1H,13C-HMBC (Fig.
29, p. 93). Foram observadas correlações do hidrogênio aldeídico em δH 9,44 (H-15) e do
hidrogênio metilênico em δH 2,51 (H-6a) com o carbono olefínico em δC 151,1 (C-5), o que
mostra a proximidade da função aldeído com a dupla ligação, formando um sistema α,β-
insaturado. O hidrogênio olefínico em δH 6,81 (H-5) e a metila em δH 1,17 (Me-14) mostram
correlação com o sinal de carbono em δC 43,3 (C-1), assim como são vistas importantes correlações da Me-14 e H-10 com o carbono oxigenado em δC 74,1 (C-7). Os hidrogênios
metilênicos em δH 2,06 (2H-9) e as metilas Me-12 e Me-13 mostraram correlações com o carbono olefínico em δC 124,3 (C-10) confirmando a conectividade destes grupos à dupla ligação. As principais correlações encontradas estão apresentadas na Figura 23 abaixo.
Figura 23-Principais correlações encontradas nos espectros HMBC ( ) e COSY ( ) de
2.
Os dados apresentados nesta discussão, e a comparação com dados da literatura corroboram com a estrutura de um sesquiterpeno denominado (1R:7S)-15-oxo-7-
hidroxibisabola-4(5),10(11)-dieno (hamanasal A, Fig. 24, p. 90) isolado pela primeira vez das folhas de Rosa woodsii (HASHIDOKO et al, 1992).
Figura 24-Estrutura do composto 2 denominado hamanasal-A.
Tabela 46-Dados de RMN de 1H e 13C (300/75 MHz, CDCl
3) de 2 comparados com os valores
da literaturaa para o sesquiterpeno hamanasal A (δ em ppm, J em Hz).
HSQC HSQCa C δC δH δC δH 1 43,3 1,69 (1H, m) 43,1 1,69 (1H, m) 2 22,2 1,99 (1H, m) 1,24 (1H, m) 22,7 1,94 (1H, m) 1,22 (1H, dddd, 13,0, 12,0, 12,0 e 5,0) 3 28,3 2,52 (1H, m) 2,39 (1H, m) 27,5 2,52 (1H, d, 20,0)/2,24 (1H, m) 4 141,7 141,3 - 5 151,1 6,81 (1H, m) 151,3 6,85 (1H, ddd, 3,2 e 2,0) 6 22,4 2,51 (1H, m) 2,03 (1H, m) 22,2 2,51 (1H, m)/2,03 (1H, m) 7 74,1 74,1 8 40,0 1,54 (2H, m) 39,6 1,56 (2H, t, 7,0) 9 22,4 2,06 (2H, m) 22,3 2,07 (2H, m) 10 124,3 5,14 (1H, tl, 7,0) 124,2 5,14 (1H, tl, 7,0) 11 132,3 132,2 12 25,9 1,69 (3H, s) 25,7 1,70 (3H, s) 13 17,9 1,63 (3H, s) 17,7 1,63 (3H, s) 14 23,8 1,17 (3H, s) 23,8 1,18 (3H, s) 15 194,0 9,44 (1H, s) 193,9 9,44 (1H, s) a HASHIDOKO et al, 1992.
Figura 25-Espectro de infravermelho do composto 2.
Figura 26-Espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl
Figura 27-Espectro de RMN de 13C [75 MHz, CDCl
3] do composto 2.
Figura 28-Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC [300 x 75 MHz, CDCl
Figura 29-Espectro de RMN 2D 1H,13C-HMBC [300 x 75 MHz, CDCl
3] do composto 2.
Figura 30-Espectro de RMN 2D 1H,1H-COSY [300 x 300 MHz, CDCl
D
D
Figura 31-Espectro de massas de alta resolução (modo positivo) do composto 2.
4.1.3 Determinação estrutural do composto 3
O composto 3 foi obtido a partir da fração diclorometano do cerne de C. glazioviana como um sólido branco (item 3.5.4, p. 63) com [α] 20 + 4,3 (c 0,1; diclorometano).
O espectro de massas de baixa resolução, obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Fig. 41, p. 101), apresentou o pico do íon molecular em m/z 238, além de picos em m/z 220 [M-18]+
e 202 [M-36]+ correspondentes à perda de uma e duas moléculas de água, respectivamente. A
partir dessas informações, juntamente com as dos espectros de RMN 13C e HSQC, foi possível
propor para 3 a fórmula molecular C15H26O2, a qual mostra IDH = 3.
O espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl
3 – Fig. 36, p. 99) apresentou um simpleto
largo em δH 5,41 (H-3) referente a um hidrogênio olefínico, o que é sugestivo de uma dupla ligação dissubstituída, um sinal em δH 3,48 (dd, J = 6,4 e 3,8 Hz; H-1) de hidrogênio oximetínico, além de sinais na faixa entre δH 2,30 – 1,72 para um conjunto de hidrogênios metilênicos. Foram observados também quatro sinais para hidrogênios metílicos em δH 1,80 (sl, Me-15), 1,00 (s, Me-14) e outros dois em δH 0,98 (sl, Me-12) e 0,92 (sl, Me-13), que em conjunto com o sinal em δH 1,61 (septd, J = 6,7 e 2,3 Hz; H-11) sugerem a presença de um grupo isopropila na molécula.
A análise do espectro de RMN 2D 1H, 1H – COSY de 3 (Fig. 40, p. 101) evidenciou o
acoplamento alílico entre o hidrogênio H-3 e a metila Me-15, assim como os acoplamentos vicinais entre o hidrogênio oximetínico H-1 e os hidrogênios metilênicos diastereotópicos em
δH 2,30 e 2,25 (2H-2). A presença do grupo isopropila pôde ser confirmada através do acoplamento entre o hidrogênio H-11 e as metilas Me-12 e Me-13. As principais correlações encontram-se demonstradas na Figura 33 (p. 96).
O espectro de RMN de 13C CPD (125 MHz, CDCl
3– Fig. 37, p. 99) apresentou 15 linhas
21,2 (C-13), 20,9 (C-12), 20,5 (C-15) e 12,0 (C-14)], três carbonos metilênicos [δC 32,5 (C- 2), 20,7 (C-8) e 35,5 (C-9)], seis carbonos metínicos, entre eles um olefínico [δC 122,1 (C-3)] e dois carbinólicos [δC 76,8 (C-1) e 68,6 (C-6)], bem como dois carbonos não hidrogenados [δC 133,9
(C-4) e 37,1 (C-10)] (Tabela 47, p. 98). Através desse experimento foram atribuídos os sinais dos hidrogênios metilênicos diastereotópicos em δH 2,30 e 2,25 (2H-2) e em δH 1,75 e 1,72 (2H-
8) aos sinais de carbono em δC 32,3 e 20,7, respectivamente. Os dados expostos sugerem para