Emre Seli

1_{Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Antalya Türkiye} 2_{Yale Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü, New Haven, CT, ABD}

Transkripsiyon, spermatogenezin mid-spermiyogenez aĢamasında durmaktadır. Geç spermiyogenezde sperm kuyruk oluĢumu, organellerin düzenlenimi, akrozom oluĢumu, sitoplazmik atılım ve nüklear kondensasyon gibi morfolojik değiĢimler için gerekli proteinler ise eken spermatogenezde üretilen mRNA‘lardan sentezlenmektedir. Epab (embriyonik poli(A)-bağlanma proteini) ve Pabpc1 (poli(A)-bağlanma proteini sitoplazmik 1) proteinleri, bu mRNA‘ların stabilizasyon ve translasyonel kontrol iĢlemlerinde görev yapmaktadırlar. Bu çalıĢma da, farklı yaĢlardaki postnatal fare testis dokularında bu genlerin ekspresyon düzeyleri ve hücresel yerleĢimlerinin belirlenmesi amaçlanmıĢtır.

Bu amaçla, C57BL/6 postnatal farelerden (6., 8., 16., 20., 29., 32., ve 88. günler) alınan testislerde, qRT-PCR tekniği ile Epab ve Pabpc1 gen ekspresyonları belirlendi. Epab mRNA‘sının postnatal testislerdeki hücresel yerleĢimi ise RNA in situ hibridizasyon tekniği ile ortaya konuldu. Elde edilen veriler, One Way ANOVA istatistiksel testi ile değerlendirildi.

Epab gen ekspresyonu 6., 8., 16. ve 20. gün fare testis dokularında oldukça zayıf bulunurken; 29., 32. ve 88. gün testislerde ise anlamlı düzeyde yükseldiği belirlenmiĢtir. Pabpc1 ise 6. ve 8. gün testislerde çok düĢük bir ekspresyon gösterirken; 16. günden itibaren yükselmeye baĢlamıĢtır. RNA in situ hibridizasyon uygulaması sonucunda, Epab mRNA‘sının postnatal fare testis dokularında sadece seminifer tübüllerde yerleĢik olduğu gözlenmiĢtir. qRT-PCR sonuçları ile uyumlu olarak 6., 8. ve 16. gün testis dokularında Epab mRNA‘sının kalitatif ekspresyonları çok düĢük düzeyde bulunmuĢtur. Fakat, Epab mRNA kalitatif ekspresyonu 29., 32. ve 88. gün testislerde spermatogonya ve yuvarlak spermatidlerde yüksek düzeyde olduğu gözlenmiĢtir.

Bu bulgular, Epab ve Pabpc1 genlerinin spermatogenez sürecinin baĢlaması ve devamlılığında görev aldıklarını düĢündürmektedir. Epab mRNA‘sının spermatogonya ve yuvarlak spermatidlerde yüksek düzeyde olması, Epab‘in transkribe edilip depolanan mRNA‘ların stabilizasyonu ve translasyonel kontrollerinde görev aldığını göstermektedir. Epab ve Pabpc1 proteinlerinin spermatogenez sürecindeki rollerinin daha net olarak belirlenebilmesi için bu proteinlerin iliĢkili olduğu proteinler ve mRNA‘ların ortaya konulması gerektiği kanısındayız.

Anahtar Kelimeler: Epab, Pabpc1, spermatogenez, testis, poliadenilasyon

Characterizing the Epab and Pabpc1 gene expression and cellular localization of them in different ages of postnatal mouse testes

Saffet Öztürk1_{, Özlem Güzeloğlu KayıĢlı}2_{, Berna Sözen}1_{, Necdet Demir}1_{, Orkan Ġlbay}2_{, Maria D.}

Lalioti2_{, Emre Seli}2

1_{Akdeniz University, School of Medicine, Department of Histology and Embryology, Antalya, Turkey}

2_{Yale University, School of Medicine, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, New}

Haven, CT, USA

Transcription ceases at mid-spermiogenesis stage of spermatogenesis. Required proteins for flagellum and acrosome formation, reorganizing organelles, development, and nuclear condensation during spermiogenesis are synthesized from transcribed mRNAs at early spermatogenesis. Epab and Pabpc1 function in stabilization and translational control processes of these mRNAs. In this study, it was aimed to characterize expression levels and cellular localization of these genes in different ages of postnatal mouse testes.

For this purpose, Epab and Pabpc1 gene expression were determined in postnatal C57BL/6 mouse testes (D6, D8, D16, D20, D29, D32 and D88) by using qRT-PCR. The cellular localization of Epab mRNA was detected with RNA in situ hybridization technique. Obtained data were analyzed with One Way ANOVA statistical test. While Epab expression in mouse testes at D6, D8, D16 and D20 were found to be very weak, its expression significantly increased in D29, D32 and D88. While Pabpc1 in testes from D6 and D8 showed very low expression, it began to gradually increase after D16. RNA in situ hybridization localized Epab mRNA only to seminiferous tubules of the mouse testis tissues. In consistent with qRT-PCR results, qualitative Epab mRNA expression was found to be very weak at D6, D8 and D16 testis tissues. However, qualitative Epab mRNA expression in spermatogonia, round spermatids from D29, D32 and D88 testes was observed to be very high. These findings thought us that Epab and Pabpc1 genes may play roles in the beginning and progression of spermatogenesis process. High level of Epab mRNA in the spermatogonia and round spermatids suggests that Epab may function in stabilization and translation control of the mRNAs transcribed and stored. We think that to determine the exact functions of the Epab and Pabpc1 proteins during spermatogenesis, proteins and

mRNAs linked with these proteins should be investigated.

Keywords: Epab, Pabpc1, spermatogenesis, testis, polyadenylation S09

Fkbp52 geni çıkarılmıĢ gebe farelere galektin-1 uygulaması embriyo rezorpsiyonunu düĢürür Nuray Acar1_{, Yasushi Hirota}2_{, Takiko Daikoku}2_{, Ġsmail Üstünel}1_{, Sudhansu K. Dey}2

1_{Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Antalya} 2_{Üreme Bilimleri Bölümü, Cincinnati Çocuk Hastanesi, Cincinnati, Ohio, ABD}

Galektinler hücre-hücre ve hücre-matriks etkileĢiminde rol alırlar (1). Galektin-1‘in gebe fare uterusunda immüntolerans rolleri vardır ve eksikliği gebelik kaybına neden olur (2).

Fkbp52-/-, Pgr-/- ve vahĢi tip fare uteruslarında daha önce yapılan proteomik çalıĢmasında (3) Galektin-1‘in hem Fkbp52-/- hem de Pgr-/- fare uterusunda vahĢi tipe oranla daha az olduğu belirlenmiĢtir. Galektin-1‘in, farelerde P4-FKBP52-PR sinyal yolağında yer alıp almadığının belirlenmesi amaçlandı.

C57BL/6/129 ve CD1 Fkbp52-/- fareler ile C57BL6/129 Pgr-/- fareler kullanıldı. C57BL6/129 genetik zeminli vahĢi tip, Fkbp52-/- ve Pgr-/- fareler overektomize edilip 2 hafta dinlendirildikten sonra 2 gün progesteron (P4) enjekte edildi, toplanan uteruslara 2 boyutlu ayrım jel elektroforezi (2D DIGE) uygulandı. CD1 Fkbp52-/- farelere P4 yüklü silastik implantlar gebeliğin 2. gününde subkutan yerleĢtirildi, gebeliğin 10 ve 12. günlerinde rekombinant Galektin-1 enjeksiyonu yapıldı, 14. günde implantasyon ve rezorpsiyon bölgeleri kontrol edildi. Gebeliğin farklı günlerindeki Galektin-1 ekspresyonu Ġn situ hibridizasyon, Ġmmünohistokimya, Western Blot teknikleri ile belirlendi.

C57BL/6/129 genetik zeminli farelere yapılan in situ hibridizasyon Lgals1 ekspresyonunun Fkbp52-/- uterusta vahĢi tipe oranla azaldığını gösterdi. P4 verilen Fkbp52-/- diĢilerde ise Lgals1 ekspresyonu vahĢi tiptekine benzer hale gelmiĢti. Bu bulgular immünohistokimya sonuçları ile doğrulandı. Rekombinant Galektin-1, gebe Fkbp52-/- diĢilerde rezorpsiyonu önemli ölçüde azalttı.

Fare uterusunda, P4-PR sinyalinin uterusta Galektin-1 ekspresyonunu düzenleyebileceği ve bu iĢleyiĢin gebeliğin sorunsuz ilerlemesi için yararlı olabileceği söylenilebilir.

REFERANSLAR:

1) http://en.wikipedia.org/wiki/Galectin-1

2) Blois SM et al. 2007 A pivotal role for galectin-1 in fetomaternal tolerance. Nat Med 13:1450–1457. 3) Hirota Y et al. 2010 Uterine FK506-binding protein 52 (FKBP52)-peroxiredoxin-6 (PRDX6) signaling protects pregnancy from overt oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA 107:15577–15582.

Anahtar Kelimeler: Uterus, FKBP52, Galektin-1, rezorpsiyon

Galectin-1 reduces the ıncidence of resorptions in pregnant Fkbp52 knockout mice Nuray Acar1_{, Yasushi Hirota}2_{, Takiko Daikoku}2_{, Ġsmail Üstünel}1_{, Sudhansu K. Dey}2

1_{Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Akdeniz University, Antalya} 2_{Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children‘s Hospital, Cincinnati, Ohio, USA}

The galectins modulate cell-cell and cell-matrix interactions (1). Galectin-1 has been shown to play immunotolerant roles in the pregnant mouse uterus, its deficiency is associated with pregnancy loss at midgestation (2).

We used proteomic in Fkbp52-/-, Pgr-/-, Wild-type (WT) mice uteri (3) and found lower expression of Galectin-1 in both Fkbp52-/- and Pgr-/- uteri compared with WT uteri. Galectin-1 may be a new downstream target of P4-FKBP52-PR signaling.

C57BL/6/129 and CD1 Fkbp52-/- mice and C57BL6/129 Pgr-/-mice were used. WT, Fkbp52-/- and Pgr-/- mice on a C57BL6/129 background were ovariectomized, rested for 2 week, treated with progesterone (P4) for 2 days, uteri were collected and processed for 2D-DIGE. Silastic implants loaded with P4 was implanted into CD1 Fkbp52-/- mice subcutaneously on day 2 of pregnancy, recombinant galectin1 was injected on days 10 and 12 of pregnancy, implantation and resorption sites were checked on day 14. In situ hybridization, Immunohistochemistry, Western Blotting were applied to detect expression of Galectin-1 on different days of pregnancy.

According to In situ hybridization findings on C57BL/6/129 background Lgals1 expression in uteri of Fkbp52-/- mice decreased compared with WT uteri. Decreases in stromal Lgals1 expression in Fkbp52-/- females were rescued by P4 delivered by silastic implants. This was confirmed by immunohistochemistry. Administration of recombinant Galectin-1 to pregnant Fkbp52-/- females significantly reduced incidence of resorptions.

P4-PR signaling regulates the expression of uterine Galectin-1 which should be beneficial to improve pregnancy.

REFERENCES:

1) http://en.wikipedia.org/wiki/Galectin-1

2) Blois SM et al. 2007. A pivotal role for galectin-1 in fetomaternal tolerance. Nat Med 13:1450–1457. 3) Hirota Y et al. 2010. Uterine FK506-binding protein 52 (FKBP52)-peroxiredoxin-6 (PRDX6) signaling protects pregnancy from overt oxidative stress. PNAS 107:15577–15582.

Keywords: Uterus, FKBP52, Galectin-1, resorption S10

Rapamisin uygulamasının fare spermatogenik hücrelere etkisinin seminifer tübül kültüründe gösterilmesi

Pınar ġahin1_{, Zeliha ġahin}2_{, Ece Güngor Ordueri}1_{, Nilay KuĢcu}1_{, Çiler Çelik Özenci}1

1_{Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Antalya} 2_{Akdeniz Üniversitesi Hastanesi, Merkezi AraĢtırma Laboratuvarı, Antalya}

Spermatogenez, hücre yenilenmesi ve farklılaĢmasını içeren karmaĢık bir süreçtir. Rapamisinin memeli hedefi (mTOR) sinyal yolağı; hücre metabolizması, büyümesi ve kurtuluĢunda merkezi bir düzenleyicidir. mTOR, çeĢitli proteinler ile fiziksel iliĢki kurarak, mTORC1 ve mTORC2 protein komplekslerini oluĢturur. mTOR inhibitörü Rapamisin‘e duyarlı olan mTORC1, hücre büyümesi için gerekli olan protein sentezini ökaryotik baĢlatma faktörü 4E (eIF4E)-bağlanma proteini 1 (4E-BP1) ve p70 ribozomal S6 Kinaz 1 (p70S6K1)‘i fosforlayarak tetikler. Tüberoz Skleroz Kompleks (TSC2/Tuberin), mTOR aktivitesini negatif yönde düzenleyen bir tümör baskılayıcıdır.

mTOR inhibitörleri, organ transplantasyonu hastalarında bağıĢıklık sistemini baskılamak için kullanılan ilaçlardır. Son yıllardaki raporlar rapamisinin, organ nakli hastalarında kullanılmasının testosteron düzeylerinde ve sperm sayılarında düĢüĢe neden olarak, fertiliteyi olumsuz etkilediğini ortaya koymaktadır. ilk aĢamada mTOR sinyal yolağı ile iliĢkili proteinlerin eriĢkin fare testisinde erken spermatogenik seri hücrelerindeki

varlığını gösterdik. Bu çalıĢmanın amacı; eriĢkin fare seminifer tübül kültüründe rapamisin uygulamasının spermatogenik hücrelere etkisinin değerlendirilmesidir.

ÇalıĢmada eriĢkin erkek fareler kullanıldı. Kontrol, sham ve rapamisin olarak 3 grup oluĢturuldu. Farelerden elde edilen seminifer tübüller 24 saat seminifer tübül damla kültüründe kültüre edildi. Rapamisin grubu 200 nmol rapamisin varlığında, sham grubu ethanol (rapamisin çözücüsü) varlığında kültüre edilirken, kontrol grubu %0,1 lik BSA içeren RPMI medyumu içerisinde kültüre edildi. Kültür sonrası tüm gruplar için canlılık testi yapıldı. mTOR sinyal yolağı inhibisyonunun belirteci olan fosforile S6K, bölünme belirteçleri olan PCNA, stra8 ve germ hücre belirteci VASA proteinlerinin ekspresyonları western blot tekniği ile gösterildi. Tüm gruplara TUNEL metodu uygulandı.

Seminifer tübüllerin 0. Saatte ve 24 saatte canlılıklarının eĢit olduğu gözlendi. Rapamisin grubunda kontrole oranla p-S6K, PCNA ve stra8 ekspresyonlarının anlamlı derecede azaldığı gözlendi. VASA ekspresyonunun tüm gruplarda eĢit olduğu gösterildi. Apoptoza uğrayan hücre sayılarında gruplar arasında fark gözlenmedi. ÇalıĢmamız mTOR sinyal yolağının spermatogonyal kök hücrelerin proliferasyonu ve farklanmasında rolü olduğunu gösteren ilk fonksiyonel çalıĢmadır. Ġleride yapılacak olan kök hücre çalıĢmaları için ıĢık tutabilecektir.

Anahtar Kelimeler: mTOR, rapamisin, testis, spermatogenez

Representing the effect of rapamycin administration to spermatogenic cells utilizing seminiferous tubule culture

Pınar ġahin1_{, Zeliha ġahin}2_{, Ece Güngor Ordueri}1_{, Nilay KuĢcu}1_{, Çiler Çelik Özenci}1

1_{Akdeniz University Medical Faculty, Histology and Embriyology Department, Antalya} 2_{Akdeniz University Hospital, Central Research Laboratory, Antalya}

Spermatogenesis is a complex process of cellular renewal and differentiation. Mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway serves as a central regulator of cell metabolism, growth, proliferation and survival. mTOR forms two protein complexes, mTORC1 and mTORC2, by interacting various proteins. Rapamycin sensitive-mTORC1 positively controls protein synthesis by phosphorylating the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E)- binding protein 1 (4E-BP1) and the p70 ribosomal S6 kinase 1 (p70 S6K1). Tuberous sclerosis complex (TSC/Tuberin) is a negative regulator of mTORC1. mTOR inhibitors are immunosuppressive drugs used in organ transplantation patients. Recently, several studies have emphasized a potential impact of rapamycin on male gonadal function by decreasing testosterone levels and sperm counts. Recently, we have shown immunohistochemical distributions of mTOR signalling proteins in early spermatogenic cells of adult mice. Thus; we aimed to investigate the effect of rapamycin administration to spermatogenic cells utilizing seminiferous tubule cultures of adult mice.

Adult male mice were used. We grouped mice as control, sham and rapamycin. Then seminiferous tubules cultured for 24 hours. After culture cell viability assay were performed for 0. hours and 24 hours. Western blot applied for p-S6K, PCNA, Stra8 and germ cell marker VASA. For all groups TUNEL was applied.

Cell viability was similar between groups. For western blot analysis p-S6K, PCNA and stra8 expression was decreased for rapamycin group significantly. Any difference were observed for VASA expression between groups. For all groups apoptotic cells was similar. This is the first functional study that reports mTOR signaling pathway have an important role spermatogonial proliferation and differentiation. This study will highlight further stem cell studies.

Keywords: mtor, rapamycin, testis, spermatogenesis S11

Kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin akut lenfoblastik lösemi hücre dizilerindeki apoptoz, hücre döngüsü, tümör süpresyonu ve anjiogenezis süreçlerine etkisinin araĢtırılması

Vildan Bozok ÇetintaĢ1_{, Hüseyin Aktuğ}2_{, Fatih Oltulu}2_{, Dilek TaĢkıran}3_{, Ahmet Keskinoğlu}4_{, Buket}

Erer Del Castello4

1_{Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı, Ġzmir}

2_{Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı, Ġzmir} 3_{Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Fizyoloji Ana Bilim Dalı, Ġzmir}

4_{Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı, Ġzmir}

Ġmmunojenik olmayan mezenkimal kök hücreleri (MSCs) immünomödülatör ve immunosupressif özellikleri nedeniyle son yıllarda bazı hemato- onkojenik ve otoimmün hastalıkların tedavilerinde baĢarıyla kullanılmaktadır. Buna karĢılık MSCs‘ in onkogenez ve metastazı indükleme potansiyeline sahip olduğu da bazı çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. Bu çalıĢmada; akut lenfoblastik lösemide (ALL) MSCs uygulanımının onkogenez sürecindeki olası etkileri araĢtırılmıĢtır.

Bu amaçla çalıĢmamızda kemik iliği kökenli insan mezenkimal kök hücrelerin (hMSCs) kültür ortamında çoğaltılan ALL hücre dizisine (CCRF-CEM) uygulanımı ile apoptoz, hücre döngüsü, tümör süpresyonu ve anjiogenezis üzerindeki etkileri araĢtırılmıĢtır. hMSCs‘ den salgılan soluble faktörleri içeren besiyerinin (hMSCs

–conditioned medium; hMSCs– CM) CCRF-CEM hücrelerinin proliferasyonuna olan etkisi sitotoksisite testleri ile analiz edildi. hMSCs ve CCRF-CEM hücre serileri 72 saat boyunca ko-kültür ortamında inkübe edildikten sonra RNA izolasyonları yapıldı. Q-PCR yöntemi ile apoptoz, hücre döngüsü, tümör süpresyonu, anjiogenezis ve hücre içi sinyal yolakları ile iliĢkili 88 genin mRNA ekspresyonu analiz edildi. Ayrıca kaspaz 3, kaspaz 8, kaspaz 9, Bcl-2, Bax, p53, ve VEGF ekspresyonları immünohistokimyasal yöntem ile protein düzeyinde de değerlendirildi. CCRF-CEM hücre dizilerine hMSCs-CM uygulanımı sonucunda hücre canlılığında anlamlı azalma görüldü. hMSCs ile ko-kültür sonrasında CCRF-CEM hücrelerinde; büyüme faktörlerinin eksprese edilmeye baĢladığı, apoptotik yolaklardaki genlerden kaspaz-2,-8,-9,-10, Bak-1 ve APAF1 ekspresyonlarının baskılandığı, CCRF-CEM hücrelerinde normalde ekspresyonu çok az bulunan tümör supressor p53 geninin 5.1 kat arttığı ve hücre içi sinyallerinin oluĢmasını sağlayan adaptör proteinlerin ekspresyonlarının baskılandığı saptandı. Ġmmunohistokimyasal analizler, ko-kültür sonrasında CCRF-CEM hücrelerindeki kaspaz 3, 8 ve Bcl-2 immunoekspresyonlarının baskılandığını, p53 immunoekspresyonunun ise arttığını ortaya koydu. ÇalıĢmamızda MSCs‘ in ALL hücre dizisine anti-proliferatif etkileri olduğu gözlendi. Bu baskılanma, p53 ve apoptotik kaspaz 3 - 8 ekpresyonlarının artıĢı ve hücre içi sinyal yolaklarındaki gen ekspresyonlarının azalması ile desteklenmiĢtir.

Anahtar Kelimeler: Mezenkimal Kök Hücre, ALL, Apoptozis, Hücre Sinyal Yolakları

The investigation of the effects of bone marrow derived mesenchymal stem cells on apoptosis, cell cycle, tumor supression and angiogenesis in acute lymphoblastic leukemia cell lines

Vildan Bozok ÇetintaĢ1_{, Hüseyin Aktuğ}2_{, Fatih Oltulu}2_{, Dilek TaĢkıran}3_{, Ahmet Keskinoğlu}4_{, Buket}

Erer Del Castello4

1_{Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey}

2_{Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey} 3_{Department of Physiology, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey}

4_{Department of Pediatrics Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey}

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been successfully used in the therapy of some hemato-oncogenic and autoimmune diseases due to their immunomodulatory and immunosupressive properties. MSCs are also able to induce oncogenesis and metastasis. The aim of this study is to clarify the possible effects of MSCs treatment on oncogenesis process in acute lymphoblastic leukemia (ALL). We investigated the effect of human mesenchymal stem cells (hMSCs) on apoptosis, cell cycle, tumor supression, angiogenesis in ALL cell lines (CCRF-CEM) invitro using a co-culture method. The effect of solubl factors released from hMSCs into the culture medium (hMSCs–CM) on the proliferation of CCRF-CEM was measured by using cytotoxicity tests. Following the incubation of hMSCs with CCRF-CEM cell lines in a co-culture system for 72 hours, the expression of mRNA of 88 genes related to apoptosis, cell cycle, tumor supression, angiogenesis and signal transduction pathways were analyzed by Q-PCR. In addition, the exppressions of caspase- 3, caspase- 8, caspase- 9, Bcl-2, Bax, p53, ve VEGF were evaluated by immunohistochemistry. Treatment of CCRF-CEM cell lines with hMSCs-CM significantly decreased cell viability. Co-culture of CCRF-CEM cell lines with hMSCs significantly induced the expression of several growth factors and supressed the expression of caspase- 2, -8, -9, -10, Bak-1 and APAF1 which are involved in the apoptotic pathways. Furthermore, the incubation of CCRF- CEM cell lines with hMSCs caused a 5.1 fold increase in p53 expression and decreased the adaptor proteins expression which are essentially responsible for intracellular signaling. We found that supression of caspase-3, 8, Bcl-2 immunoexpression and elevation of p53 immunoexpression in CCRF-CEM cell lines after co-culture with hMSCs. hMSCs may have an anti-proliferative effect on CCRF-CEM cell lines. This result was confirmed by induction of p53 and apoptotic caspase- 3 and 8 expression and supression of genes which are mainly involved in intracellular signaling pathways.

Keywords: Mesenchymal Stem Cell, ALL, Apoptosis, Cell Signaling Pathway S12

Multiple myeloma hastalarından ve sağlıklı vericilerden elde edilen kemik iliği-kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaĢma potansiyelinin karĢılaĢtırmalı olarak incelenmesi

Ayça Aksoy1_{, Cansu SubaĢı}1_{, Zehra Seda Ünal}1_{, Özgür Mehtap}2_{, Gülay Erman}1_{, Erdal Karaöz}1

1_{Kocaeli Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kök Hücre Anabilim Dalı, Kocaeli} 2_{Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji Anabilim Dalı, Kocaeli}

Multiple myeloma (MM) osteolitik kemik lezyonlarına neden olan bir plazma hücre malignansisidir. Sağlıklı kemik iliğinde kemik formasyonu adı verilen mezenkimal kök hücrelerin osteoblastlara farklılaĢması ve osteoklastik aktivite sonucu oluĢan kemik yıkımı bir denge halindedir. MM hücreleri ise bu dengeyi çeĢitli inhibitör faktörler salgılayarak bozmaktadırlar. Buna ek olarak yapılan klinik çalıĢmalarda MM hastalarında alkalen fosfataz gibi kemik oluĢumu belirteçlerinin az olabileceğini gösterilmiĢtir. Bu çalıĢmada, MM hastalarından ve sağlıklı vericilerden elde edilen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin (KĠ-MKH) osteojenik farklılaĢma kapasitesi çeĢitli yöntemlerle karĢılaĢtırmalı olarak incelenmiĢtir.

MM hastalarından (n=3) ve sağlıklı vericilerden (n=3) gradiyent yöntem ile KĠ-MKH‘ler izole edilip, pasaj 3‘e kadar uygun koĢullarda kültüre edildiler. Akım sitometri aygıtında karakterizasyon çalıĢmaları tamamlandıktan sonra MKH‘ler 30 gün süresince osteojenik farklılaĢma için uyarılmıĢtır. Alkalen fosfataz aktivitesi uyarımdan itibaren 1., 3., 7., 14. ve 21. günlerde ölçülmüĢtür. Absorbanslar 405 nm‘de okunmuĢ ve toplam protein konsantrasyonlarına oranlanmıĢtır. Buna ek olarak osteojenik farklılaĢma Alizarin Red S gibi kemik oluĢumunu gösteren belirteçlerle histokimyasal olarak gösterilmiĢtir. BMP-2, BMP-4 ve ALPL genlerinin ekspresyonları Real Time PCR ile ölçülmüĢtür.

Sağlıklı donörlerin kemik iliğinden elde edilen MKH‘lerde osteojenik farklılaĢmanın 3. gününden 14. gününe kadar ALP aktivitesinde artıĢ görülürken, MM hasta grubunda 21. güne kadar ALP aktivitesi gözlenmemiĢtir. Alizarin Red S boyamasında ise, sağlıklı KĠ-MKH‘lerine göre çok az miktarda kalsifiye kemik nodülü izlenmiĢtir. Gen ekspresyon (BMP-2, BMP-4 ve ALPL) çalıĢmaları bu verilerimizi onaylamıĢtır.

Sonuç olarak, MM hastalarının kemik iliğindeki tümörojenik mikroçevrenin etkisine ek olarak MKH‘lerin ALP aktivitelerinin olmayıĢı ve osteojenik farklılaĢmayla iliĢkili gen ekspresyonlarındaki azalmanın MM‘daki kemik defektleri ile iliĢkili olabileceğini düĢünmekteyiz.

Anahtar Kelimeler: Multiple Myeloma, osteojenik farklılaĢma, mezenkimal kök hücre