3.6.1 Obtenção experimental de metacercárias
Cercárias emergidas dos moluscos naturalmente infectados foram utilizadas para a obtenção de metacercárias em diferentes modelos experimentais, selecionados de acordo com os possíveis ciclos biológicos relatados para os respectivos tipos cercarianos preliminarmente identificados.
66 sólido nos próprios recipientes contendo os moluscos (larvas do tipo monostoma), sendo as metacercárias, quando assim obtidas, removidas com auxílio de estiletes antes da realização de estudos morfológicos e de infecção experimental.
Para certos tipos cercarinos (equinostoma, estrigeocercária, magnacauda e gimnocéfala) foi verificada a formação de metacercárias em peixes. Para isso, dependendo do tipo cercariano, foram utilizados como modelos experimentais exemplares de Poecilia reticulata Peters, 1859 criados e mantidos em laboratório, e em alguns experimentos espécimes de Cyprinus carpio Linnaeus, 1758 adquiridos em loja comercial localizada na região norte de Belo Horizonte. Nos ensaios biológicos realizados para cada uma das espécies de trematódeo avaliadas, grupos de 10 a 30 exemplares de P. reticulata medindo cerca de 3 cm de comprimento total foram utilizados. Os peixes foram colocados individualmente em placas de cultura de seis poços sendo em seguida adicionado solução contendo número indeterminado de cercárias. Experimentos de infecção em massa também foram realizados, sendo os espécimes de moluscos naturalmente infectados mantidos juntamente com os peixes por 24 horas em aquário contendo 1L de água isenta de cloro. Nos experimentos utilizando C. carpio, foi realizada a infecção individual de cinco animais medindo cerca de 5 cm de comprimento total, sendo cada exemplar mantido por cerca de 30 minutos em recipiente contendo pequeno volume de água. Os peixes experimentalmente infectados foram mantidos em aquário aerado com capacidade de 10 L, sendo alimentados diariamente com ração especial para peixes (Nutriflakes®). A água dos aquários foi renovada semanalmente até o fim dos experimentos. Exemplares de peixes não expostos à solução cercariana foram mantidos nas mesmas condições como controle. A pesquisa de metacercárias nestes hospedeiros foi realizada em diferentes intervalos de tempo após infecção, dependendo da espécie de parasito avaliada. Para isso, os peixes foram mortos por comoção cerebral e as vísceras removidas para placas de Petri contendo solução fisiológica, sendo a pesquisa de formas parasitárias realizadas em estereomicroscópio.
Para algumas larvas do tipo equinostoma verificou-se a necessidade de outro molusco como segundo hospedeiro intermediário. Para isso, foram utilizados exemplares de B. glabrata criados em laboratório e isentos de infecção por trematódeos. Grupos de 10 exemplares foram expostos a solução cercariana obtida de moluscos naturalmente infectados. A pesquisa de metacercárias nestes invertebrados foi realizada a partir de 5
67 DPI, sendo os mesmos prensados entre lâminas de vidro e dissecados com auxílio de estiletes em estereomicroscópio.
Xifidiocercárias do grupo ornata foram utilizadas para a infecção de larvas Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) mantidas em laboratório. As larvas destes insetos foram transferidas para placas de cultura e expostas à solução contendo cercárias. Após 7 DPI, as larvas de insetos foram dilaceradas com auxílio de estiletes e examinadas em microscópio de luz para verificação da presença de metacercárias.
3.6.2 Infecção experimental de hospedeiros definitivos
Metacercárias obtidas em laboratório (item 3.6.1) foram utilizadas para a realização de infecções experimentais de hospedeiros definitivos, sendo contadas e inoculadas por via oral com auxílio de micropipeta.
Para as espécies de trematódeos em que foi obtido sucesso na obtenção de metacercárias, realizou-se a infecção de grupos de cinco camundongos da linhagem AKR/J, machos, adultos, pesando cerca de 25 g. Grupos destes roedores tratados diariamente pelo acetato de dexametasona (Decadron ®, Aché, Brasil), na dosagem de 50 mg/kg por via subcutânea, também foram infectados por algumas das espécies de trematódeos obtidas.
Em alguns experimentos, exemplares de pintos jovens (Gallus gallus domesticus Linnaeus, 1758), patos jovens (Cairina moschata domestica Linnaeus, 1758), canários adultos (Serinus canaria Linnaeus, 1758) e pombos adultos (Columba livia Gmelin, 1789) adquiridos em loja comercial localizada em Belo Horizonte foram também infectados. Antes da realização da infecção destes hospedeiros vertebrados, exames parasitológicos de fezes pela técnica de sedimentação espontânea (Lutz, 1919) foram realizados para constatação da ausência de infecção por trematódeos.
Larvas com características morfológicas sugestivas de Schistosomatidae foram utilizadas para a realização de infecção por via subcutânea, sendo as cercárias inoculadas com auxílio de seringa munida de agulha. Visando a verificação de ocorrência de penetração ativa de larvas na pele de roedores, camundongos da linhagem AKR/J foram anestesiados (pentobarbital sódico, 60 mg/kg, por via intraperitoneal) e uma solução
68 auricular) dos animais, sendo a penetração das larvas acompanhada em estereomicroscópio.
Os animais infectados foram mantidos em laboratório, sendo água e alimentação fornecida ad libitum até o fim dos experimentos. Exames parasitológicos de fezes dos animais experimentalmente infectados foram realizados periodicamente pelo método de sedimentação espontânea (Lutz, 1919) a partir de 7 DPI. Quanto verificada a presença de ovos de trematódeos nas fezes destes hospedeiros, amostras de sedimentos fecais positivos foram transferidas para placa de Petri contendo água isenta de cloro, as quais foram mantidas à temperatura ambiente para verificação da formação e eclosão de miracídios.
3.6.3 Recuperação de parasitos em hospedeiros definitivos experimentalmente infectados
Os hospedeiros definitivos experimentalmente infectados (aves e roedores) foram mortos por deslocamento cervical em diferentes intervalos de tempo após infecção, dependendo da espécie de parasito e do experimento. A cavidade abdominal foi exposta e as vísceras transferidas separadamente para placas de Petri contendo solução fisiológica (NaCl a 0,85%). Os intestinos foram separados em três porções, sendo em seguida abertos longitudinalmente com auxílio de tesouras e pinças, e examinados em microscópio estereoscópico para a pesquisa de parasitos. Após um exame inicial, a mucosa foi raspada com auxílio de lâmina de vidro e o material reexaminado. Quando necessário, os demais órgãos foram retirados, dilacerados com estiletes e também examinados. Nos experimentos de infecção por larvas de Schistosomatidae realizou-se a perfusão do sistema porta hepático de acordo com Pellegrino & Siqueira (1956). Na infeção de roedores por larvas de S. mansoni, um fragmento intestinal (íleo terminal) foi removido para a realização de oograma (Pellegrino & Faria, 1965).
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3.6.4 Comitê de Ética
Os procedimentos realizados nos estudos de infecção experimental de hospedeiros vertebrados foram realizados em acordo com os princípios éticos em experimentação animal, tendo a aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG), protocolo 199/2009.