3.2 “Sahnenin Dışındakiler”de Tiyatro
24 Hatta Sahnenin Dışındakiler de Tanpınar’ın yarım kalmış romanları arasında zikredilir Üçlü bir nehir roman olarak nitelendirilebilecek Mahur Beste, Sahnenin Dışındakiler ve Huzur adlı romanlardan
glândula de veneno sob diferentes tratamentos.
Comparou-se a expressão da condição controle, 4 dias sem tratamento (4d), com as condições tratadas, 4 dias tratado com reserpina (4dR) e 4 dias tratado com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e (4dA).
Na comparação da glândula controle (4d), com a glândula tratada com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e (4dA) foram encontrados 140 clones diferencialmente expressos (p-value < 0,001), sendo que, 93 clones apresentaram sua expressão aumentada na glândula tratada com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e (4dA) e 47 clones apresentaram sua expressão reduzida na glândula 4dA.
Todos os clones foram sequenciados e após tratamento com Vector NTI AdvanceTM 10 (Invitrogen) restaram 127 sequências que foram submetidas ao programa Blast2go. Dessas sequências, 104 foram identificadas e 23 não apresentaram similaridade com nenhuma outra sequência do banco de dados (no hits).
Entre os transcritos identificados, 28 são transcritos celulares e 76 são toxinas, entre os transcritos com expressão reduzida na glândula 4dA, têm-se que, 10 são transcritos celulares e 27 são toxinas, entre os transcritos com expressão aumentada na glândula 4dA têm-se que, 18 são transcritos celulares e 49 são toxinas.
Na análise da expressão gênica diferencial em glândula de veneno tratada com reserpina (4dR) foram encontrados 99 clones diferencialmente expressos, 53 clones apresentaram expressão aumentada na glândula tratada com reserpina e 46 clones apresentaram expressão diminuída. Todos os clones foram sequenciados e após tratamento das sequências restaram 94 sequências que foram identificadas através da ferramenta BlastX/BlastN.
Entre os transcritos mais expressos em glândula tratada com reserpina (4dR), 15 são transcritos celulares e 27 são transcritos de toxinas, entre os transcritos menos expressos em glândula 4dR, 12 são transcritos celulares e 22 são transcritos de toxinas.
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Figura 43: Gráfico representando o número de transcritos celulares e toxinas upregulated na glândula de 4 dias tratada com reserpina (4dR) e na glândula de 4 dias tratada com reserpina e agonistas dos adrenocpetores α e (4dA).
Na figura 43 estão representados os transcritos celulares e toxinas com expressão aumentada na glândula 4dA e na glândula 4dR. Pode-se verificar que o número de transcritos celulares é quase o mesmo nas duas condições, porém o número de toxinas é quase o dobro na glândula 4dA, a reserpina foi descrita como um potente inibidor da produção de veneno na glândula de veneno de Bothrops jararaca (YAMANOUYE et al., 1997), assim, esperava-se que essa inibição fosse total e nenhum traço de toxina fosse encontrado na glândula.
Comparando o perfil de expressão de toxinas entre os transcritos mais expressos em glândula 4dR (figura 44) e entre os transcritos menos expressos (figura 45) encontram-se poucas diferenças.
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Figura 44: Gráfico representando as classes de toxinas com expressão aumentada em glândulas de 4 dias tratadas com reserpina (4dR). Classe de toxinas/Total de toxinas.
Figura 45: Gráfico representando as classes de toxinas com expressão diminuída em glândulas de 4 dias tratadas com reserpina (4dR). Classe de toxinas/Total de toxinas.
Nos dois conjuntos de dados a classe de lectinas do tipo C é a mais abundante correspondendo a 31% e 27%, respectivamente, do total de toxinas, seguida das metaloproteases com 19% e 23%, respectivamente. As fosfolipases correspondem a 19% dos transcritos de toxinas mais expressos na glândula 4dR enquanto representam apenas 5% dos transcritos menos expressos, situação semelhante é a das serino- proteases que correspondem a 23% dos transcritos de toxinas menos expressos e apenas 8% dos transcritos de toxinas mais expressos. Diferença menor apresentam as BPPs,
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toxinas menos expressos, VEGF não foi encontrada entre os mais expressos e representa 5% dos transcritos de toxinas menos expressos.
A princípio pode-se afirmar que nenhuma classe de toxina é totalmente inibida na condição tratada com reserpina (4dR), mesmo o VEGF que não aparece entre os transcritos mais expressos, possui apenas um transcrito entre os menos expressos, sendo difícil fazer qualquer afirmação a respeito da sua produção ou não na glândula tratada com reserpina.
Os transcritos celulares foram anotados manualmente usando a ferramenta QuickGO (http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/), os transcritos que pertenciam a uma mesma categoria do GO foram agrupados. Para determinar o perfil funcional da glândula foram consideradas apenas as categorias com dois ou mais transcritos (tabela 9).
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na glândula de veneno de 4 dias tratada com reserpina. Cada transcrito pode ser classificado em mais de uma categoria funcional. Os valores em porcentagem se referem ao total de transcritos da categoria/total de transcritos celulares.
ID Componente Celular n° de transcritos GO:0005840 Ribossomo 4 (26,7%) GO:0016020 Membrana 4 (26,7%) GO:0005737 Citoplasma 3 (20,0%) GO:0005622 Intracelular 3 (20,0%)
GO:0030529 Complexo ribonucléico 3 (20,0%)
GO:0016021 Integral da membrana 2 (13,3%)
GO:0005886 Membrana plasmática 2 (13,3%)
Função Molecular
GO:0009055 Atividade de transportador de elétrons 4 (26,7%) GO:0016491 Atividade de oxidorredutase 4 (26,7%) GO:0003735 Constituinte estrutural do ribossomo 4 (26,7%)
GO:0046872 Ligação a íon metálico 3 (20,0%)
GO:0051539 4 iron, 4 sulfur cluster binding 2 (13,3%)
GO:0005524 Ligação a ATP 2 (13,3%)
GO:0016787 Atividade de hidrolase 2 (13,3%)
GO:0051536 iron-sulfur cluster binding 2 (13,3%)
GO:0016853 Atividade de isomerase 2 (13,3%)
GO:0008137 Atividade de NADH desidrogenase (ubiquinona) 2 (13,3%)
GO:0000166 Ligação a nucleotídeo 2 (13,3%)
GO:0005515 Ligação a proteína 2 (13,3%)
GO:0015035 Atividade de oxidorredutase de proteína dissulfeto 2 (13,3%)
Processo Biológico
GO:0006412 Tradução 3 (20,0%)
GO:0042773 Transporte de elétron acoplado a síntese de ATP 2 (13,3%)
GO:0045454 Homeostase redox celular 2 (13,3%)
GO:0055114 Processo de redução oxidativa 2 (13,3%)
Na tabela 9 pode-se verificar que a maior parte dos transcritos que apresentaram aumento na expressão na glândula 4dR estão relacionados ao processo de tradução (ribossomo – 26,7%; complexo ribonucléico – 20,0%; constituinte estrutural do ribossomo – 26,7%; tradução – 20,0%), ao processo de metabolismo energético
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ligação a íon metálico – 20,0%; atividade de NADH desidrogenase (ubiquinona) – 13,3%; transporte de elétron acoplado a síntese de ATP – 13,3%; processo de redução oxidativa – 13,3%) e em menor escala ao processamento de proteínas no retículo endoplasmático (atividade de isomerase – 13,3%; atividade oxidorredutase de proteína dissulfeto – 13,3%; homeostase redox celular – 13,3%).
Tabela 10: Categorias funcionais dos transcritos que apresentaram diminuição na
expressão na glândula de veneno de 4 dias tratada com reserpina. Cada transcrito pode ser classificado em mais de uma categoria funcional. Os valores em porcentagem se referem ao total de transcritos da categoria/total de transcritos celulares.
ID Componente Celular
n° de transcritos
GO:0005737 Citoplasma 4 (33,3%)
GO:0005783 Retículo endoplasmático 3 (25,0%)
GO:0005622 Intracelular 2 (16,7%)
GO:0005634 Núcleo 2 (16,7%)
GO:0030529 Complexo ribonucléico 2 (16,7%)
GO:0005840 Ribossomo 2 (16,7%)
Funções Moleculares
GO:0009055 Atividade de transportador de elétrons 3 (25,0%)
GO:0016853 Atividade de isomerase 3 (25,0%)
GO:0003729 Ligação ao mRNA 3 (25,0%)
GO:0015035 Atividade de oxidorredutase de proteína dissulfeto 3 (25,0%)
GO:0005509 Ligação a íon cálcio 2 (16,7%)
GO:0003677 Ligação ao DNA 2 (16,7%)
GO:0016491 Atividade de oxidorredutase 2 (16,7%)
GO:0005515 Ligação a proteína 2 (16,7%)
GO:0003723 Ligação ao RNA 2 (16,7%)
GO: 0043565 Ligação a sequência específica do DNA 2 (16,7%) GO:0003735 Constituinte estrutural do ribossomo 2 (16,7%)
Processos biológicos
GO:0045454 Homeostase redox celular 3 (25,0%)
GO:0017148 Regulação negativa da tradução 2 (16,7%) GO:0006355 Regulação da transcrição DNA dependente 2 (16,7%)
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As categorias anotadas do GO dos transcritos menos expressos na glândula 4dR estão representados na tabela 10. Pode-se perceber que são predominantes as categorias relacionadas ao processamento pós-traducional (retículo endoplasmático – 25,0%; atividade de isomerase – 25,0%; atividade de oxidorredutase de proteína dissulfeto – 25,0%; ligação a proteína – 16,7%; ligação a íon cálcio – 16,7%; homeostase celular redox – 25,0%, regulação negativa da tradução – 16,7%), transcrição (ligação ao DNA – 16,7%; ligação a sequência específica do DNA – 16,7%; regulação da transcrição DNA dependente – 16,7%) e tradução (complexo ribonucléico - 16,7%; ribossomo – 16,7%; ligação ao mRNA – 25,0%; ligação ao RNA – 16,7%; constituinte estrutural do ribossomo – 16,7%; tradução – 16,7%).
Esses resultados sugerem que o processo de tradução não é afetado pelo bloqueio da atividade simpática.
Foi feita a análise dos transcritos celulares diferencialmente expressos na glândula de veneno tratada com reserpina e com os agonistas do adrenoceptores α e , a fim de identificar quais funções celulares se destacam quando há o estímulo direto da atividade simpática.
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expressão na glândula de veneno de 4 dias tratada com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e . Cada transcrito pode ser classificado em mais de uma categoria funcional. Os valores em porcentagem se referem ao total de transcritos da categoria/total de transcritos celulares.
ID Componente Celular N° de transcritos
GO:0005783 Retículo endoplasmático 5 (27,8%)
GO:0005737 Citoplasma 3 (16,7%)
GO:0005789 Membrana do retículo endoplasmático 2 (11,1%)
GO:0005886 Membrana plasmática 2 (11,1%)
GO:0030529 Complexo ribonucleoprotéico 2 (11,1%)
GO:0005840 Ribossomo 2 (11,1%)
Função Molecular
GO:0000166 Ligação a nucleotídeo 5 (27,8%)
GO:0016853 Atividade de isomerase 4 (22,2%)
GO:0003723 Ligação a RNA 4 (22,2%)
GO:0005524 Ligação a ATP 3 (16,7%)
GO:0009055 Atividade de carregador de elétron 3 (16,7%) GO:0015035 Atividade de oxidorredutase de proteína dissulfeto 3 (16,7%) GO:0003735 Constituinte estrutural do ribossomo 3 (16,7%)
GO:0046872 Ligação a íon metálico 2 (11,1%)
Processo Biológico
GO:0045454 Homeostase redox celular 4 (22,2%)
GO:0006662 Processo metabólico de éter de glicerol 3 (16,7%) GO:0006457 Enovelamento de proteínas 2 (11,1%)
GO:0006412 Tradução 2 (11,1%)
Na tabela 11 pode-se verificar claramente que os processos de tradução e processamento pós-traducional são predominantes entre os transcritos celulares com expressão aumentada na glândula 4dA. A maior parte dos transcritos se encontra no retículo endoplasmático (retículo endoplasmático - 27,8%; membrana do retículo endoplasmático - 11,1%) ou são constituintes estruturais do ribossomo (complexo ribonucleoprotéico – 11,1%; ribossomo – 11,1%), apresentam funções relacionadas ao processamento pós-traducional (atividade de isomerase – 22,2%; atividade de oxidorredutase de proteína dissulfeto – 16,7%; enovelamento de proteínas – 11,1%;
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27,8%; ligação a RNA – 22,2%; constituinte estrutural do ribossomo – 16,7%) e a tradução (tradução – 11,1%).
Tabela 12: Categorias funcionais dos transcritos que apresentaram diminuição na
expressão na glândula de veneno de 4 dias tratada com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e . Cada transcrito pode ser classificado em mais de uma categoria funcional. Os valores em porcentagem se referem ao total de transcritos da categoria/total de transcritos celulares.
ID Componente Celular n° de transcritos
GO:0005634 núcleo 3 (30,0%)
GO:0005737 citoplasma 2 (20,0%)
GO:0005743 membrana interna da mitocondria 2 (20,0%)
Função Molecular
GO:0046872 ligação a íon metálico 3 (30,0%)
GO:0005515 ligação a proteína 3 (30,0%)
GO:0003677 ligação ao DNA 2 (20,0%)
GO:0004450 atividade isocitrato desidrogenase (NADP+) 2 (20,0%) GO:0000287 ligação a magnésio iônico 2 (20,0%)
GO:0051287 ligação a NAD 2 (20,0%)
GO:0016491 atividade de oxidorredução 2 (20,0%) GO:0008270 ligação a zinco iônico 2 (20,0%)
Processo biológico
GO:0006102 processo metabólico de isocitrato 2 (20,0%)
GO:0055114 redução oxidativa 2 (20,0%)
GO:0006355 regulação da transcrição, DNA dependente 2 (20,0%) GO:0006351 transcrição, DNA dependente 2 (20,0%) GO:0006099 ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs) 2 (20,0%)
A maior parte dos transcritos com expressão diminuída na glândula 4dA, participa de processos relacionados ao metabolismo energético (processo metabólico de isocitrato – 20,0%; redução oxidativa – 20,0%; ciclo de Krebs – 20,0%) , bem como o processo de transcrição (regulação da transcrição, DNA dependente – 20,0%; transcrição, DNA dependente – 20,0%).
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transcritos com expressão reduzida é bem clara, funções como tradução e enovelamento protéico são predominantes no primeiro grupo, enquanto transcrição e metabolismo energético são predominantes entre os menos expressos.
A glândula 4dA apresenta um padrão diferente do encontrado na glândula 4dR, enquanto a primeira apresenta uma clara diferença entre os transcritos mais expressos e os menos expressos, a segunda apresenta sobreposições de funções, entre os transcritos mais expressos e os transcritos menos expressos, que impedem qualquer conclusão a respeito dos processos celulares afetados. Porém fica claro que as toxinas estão sendo transcritas, assim para determinar o que impede que essas toxinas sejam secretadas foi feita a análise de expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de transcrição, tradução, enovelamento protéico e secreção por PCR em tempo real.